米尔伊丽莎白菌拮抗菌X2的筛选鉴定及其特性分析.pdf

本实验旨在筛选对米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）有抑制作用的拮抗菌，并对其生长特性及其去除氨氮和亚硝酸盐的作用进行分析。实验采用平板对峙法从“稻蛙”养殖稻田土壤中分离到1株对米尔伊丽莎白菌有较强抑制作用的菌株X2。采用形态学特征观察和16 srDNA测序对X2进行鉴定，随后对X2在不同pH、盐度、温度等条件下的生长曲线进行了测定，以评估其环境适应性，并将X2接种于氨氮和亚硝酸盐培养基中，测定去除率以评估其去除氨氮和亚硝酸盐的能力。结合形态学特征及菌株16 srDNA序列分析，X2鉴定为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）。结果显示：X2在pH59、盐度5%o50%o、温度2 0 40 之间均能生长，最适pH、盐度、温度分别为7、5%和35。这表明X2对环境的适应性较强，具有较强的耐酸碱性、耐盐性，适温性广等特性。X2在去除氨氮、亚硝酸盐方面也表现出了很强的能力，在X2接种浓度为5.0 10 7 CFU/mL时氨氮的去除率最高，达到7 4.95%；接种浓度为5.0 10 CFU/mL时亚硝酸盐的去除率最高，达到99.8 9%。结果表明，侧孢短芽孢杆菌X2对米尔伊丽莎白菌具有较强的拮抗作用，其环境适应能力也很强，同时具有较强的去除氨氮和亚硝酸盐的能力，可作为益生菌应用于蛙类养殖中防控米尔伊丽莎白菌感染和水质调控。关键词：米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingiamiricola）；侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）；拮抗菌；鉴定；氨氮降解中图分类号：S942米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）是牛蛙（Lithobates catebianus）、虎纹蛙（Hoplobatrachuschinensis）、黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）、棘胸蛙（Quasipaa spinosa）和棘腹蛙（Quasipaa bouleng-eri)等 蛙类脑膜炎病（俗称“歪头病”）的病原，该病发病广泛、致死率高，已成为蛙类养殖过程最难防治、危害最大的疾病。由于蛙血脑屏障的存在，常用抗生素无法进入病灶发挥抗菌作用1,2 。O同时又存在病原菌抗药性问题，导致该病的药物治疗效果很差3.4 拮抗菌是目前抑制病原体和控制疾病的新手段5，具有维持肠道微生态平衡，增强宿主免疫力、抵御病原体入侵的作用(6-8 。拮抗菌能通过分泌抗菌物质、竞争附着部位、竞争营养、改变病原体的酶活性、免疫刺激功能等方式抑制病原体，同时还能增强宿主肠道消化功能，促进营养吸收利用，提高饲料消化率和饲料利用率9-11。目前，水产养殖中常用的拮抗菌有芽孢杆菌、海洋放线文献标识码：A文章编号：10 0 0-6 90 7-(2 0 2 3)0 4-0 0 54-0 7菌、乳酸菌等12,13，其中，芽孢杆菌作为拮抗菌的一种，能产生多种抗菌物质，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有很强的抑制能力14，部分菌株可产生抗菌肽和抗生素，能直接抑制和杀灭病原菌15。芽孢杆菌同时也能有效降低水体硝酸盐氮、亚硝酸盐、氨氮含量，净化水质，改善水产养殖动物生存环境16 。芽孢杆菌在水环境调控和疾病控制方面发挥越来越重要的作用17-19。O本实验从“稻蛙”养殖的稻田土壤中分离、筛选到一株米尔伊丽莎白菌的拮抗菌X2，对其进行了形态学和分子生物学鉴定，并对该菌的生长特性及其降氨氮和亚硝酸盐的作用进行了分析，以期为该拮抗菌的应用提供科学依据。1材料与方法1.1材料病原菌：米尔伊丽莎白菌（E.miricola）为实验室从患“歪头病”的黑斑蛙中分离出来，并在收稿日期：2 0 2 2-0 9-30；修订日期：2 0 2 3-0 3-30资助项目：国家重点研发计划蓝色粮仓科技创新专项“多元复合型渔农综合种养技术与模式”课题资助（2 0 19YFD0900305）第一作者简介：张虹（1998），女，硕士研究生，专业方向为水产健康养殖。E-mail：3490 18 8 450 q q.c o m通讯作者:徐进。E-mail：x u j i n y f i.a c.c n第4期-80 冰箱保存。脑心浸出液肉汤（BHI)为海博生物技术有限公司产品。氨氮培养基2 0 配方为葡萄糖3.7 5g、(NH4),SO4 0.5 g、K,H PO 4 1.0 g、K H,PO 4 0.3 g、MgS04 7H,0 0.05 g、Fe S0 4 7H,0 0.01 g、MnS044H,0 0.01 g、Na Cl 5.0 g、1 0 0 0 m L蒸馏水,pH7.0。亚硝酸盐培养基2 0 配方为葡萄糖3.7 5g、NaNO,0.49 g、K,H PO 4 1.0 g、K H,PO 4 0.3 g、MgS04 7H,0 0.05 g、Fe S0 4 7H,0 0.01 g、MnS044H,0 0.01 g、Na Cl 5.0 g、1 0 0 0 m L蒸馏水,pH7.0。1.2实验方法1.2.1拮抗菌的筛选（1）初筛：采集青蛙养殖稻田土壤样品，加10倍体积的BHI液体培养基，30 0 r/min离心，上层液体2 8 下18 0 r/min摇床上振荡培养过夜。随后采用平板对峙法筛选抗菌。取浓度为1.0 10lCFU/mL的米尔伊丽莎白菌30 0 L涂布于BHI琼脂培养基上并铺贴6 mm无菌滤纸片，分别滴加30 L样品菌液至滤纸片上，1h待干后置于2 8 培养箱中恒温培养2 4h，观察是否有抑菌圈出现，选取出现抑菌圈的样本进行下一步的分离纯化。（2）复筛：将出现抑菌圈的混合菌在BHI固体平板上进行划线分离、培养，挑取形态大小不一的菌落接种至BHI液体培养基中培养，将拮抗菌液的浓度调整为0 D600 m=0.60.8用于拮抗菌的复筛。重复上述平板对峙法，观察抑菌圈大小，找到具有较强拮抗作用的菌株。用游标卡尺测量抑菌圈的直径，这个实验独立地重复三次，选择拮抗效果明显的菌株进行后续研究。1.2.2拮抗菌的鉴定选取出现抑菌圈最大的菌株活化培养2 4h，分别对其进行革兰氏染色和磷钨酸负染，分别在油镜和电子显微镜下观察其形态特征，再通过16 SrD-NA序列进行扩增、测序、比对，结合其形态学特征及16 SrDNA序列系统发育分析，最终确定拮抗菌种类。系统发育分析采用MEGA7软件，以邻位法构建系统发育树。1.2.3X2菌株在不同培养条件下的生长特性（1）p H：用0.1mol/L NaOH 溶液或0.1mol/LHCl溶液将BHI液体培养基pH分别调张虹等：米尔伊丽莎白菌抗菌的筛选鉴定及其特性分析拮抗菌的筛选经过多轮的初筛和复筛，获得1株抑菌效果较好的菌株X2。X2 的3个平行都出现抑菌圈，其抑菌圈直径为（16.6 0.2）mm。表明菌株X2对病原菌米尔伊丽莎白菌具有稳定的拮抗能力。2.2菌株形态特征对X2的革兰氏染色结果显示，菌体绝大多数是革兰氏阴性呈红色，少数菌体是革兰氏阳性呈现紫色。透射电子显微镜下观察显示，X2为棒状杆菌，周生多根鞭毛，长约2 m，宽（直径）约0.8m（图1）。这符合芽孢杆菌的形态学特征。55至3、5、7、9、11，取1mL浓度为1.0 10 lCFUm L的X2菌液接种到10 0 mLBHI液体培养基中用18 0 r/min摇床（2 8）培养2 0 h，每2 h用紫外分光光度计于6 0 0 nm波长下测量菌液的吸光值（O D 6 0 0 m），每次重复测定3次2 1（2）盐度：用NaCl配制5%o、10%o、2 0%o、30%o、40%o 和50%o不同盐度梯度的10 0 mLBHI液体培养基2 1，分别接种1mL浓度为1.0 10 10CFU/mL的X2培养液，每个盐度梯度设3个平行，180 r/min（2 8 ）培养 2 0 h，每 2 h 测一次OD600m值。（3）温度：将1mL浓度为1.0 10 lCFU/mL的X2接种于10 0 mL BHI液体培养基中，分别于20、2 5、30、35和40 1 恒温摇床中180r/min培养2 0 h，每个温度设置3个平行，每2 h测量 OD600 m值。1.2.4X2对氨氮和亚硝酸盐的降解作用将1mL浓度梯度为5.0 10、5.0 10 7、5.010、5.0 10 3和5.0 10 CFU/mL的X2菌液，分别加人到2 0 mL氨氮浓度稀释至1mg/L的氨氮培养基和亚硝酸盐浓度稀释至0.4mg/L的亚硝酸盐培养基中，18 0 r/min摇床培养，每2 4h分别测定培养基中氨氮或亚硝酸盐浓度。氨氮浓度测定采用纳氏试剂比色法2 ，亚硝酸盐浓度测定采用分光光度法2 3。计算氨氮和亚硝酸盐的去除率，实验重复三次，计算公式如下：氨氮去除率=（初始氨氮浓度接种后氨氮浓度)/初始氨氮浓度10 0%亚硝酸盐去除率=（初始亚硝酸盐浓度接种后亚硝酸盐浓度）/初始亚硝酸盐浓度10 0%2结果2.156淡水渔业2023 年2.316S rRNA 基因序列分析将菌株X2的16 S rDNA序列在GenBank数据库进行核苷酸序列BLAST比对分析，结果显示，X2的16 SrDNA序列与数据库中的4株侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）的同源性相似性达到99%。在基于 16 S rDNA 基因序列构建的系统发育AFig.1 Morphological characteristics of antagonistic bacteria X2A：革兰氏染色后显微镜观察；B：负染后电镜观察56699144940.005Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain X2 and other bacteria括号内为菌株的16 SrDNA基因序列在GenBank中的登录号；分支结点处数字为Bootstrap值；标尺的数据为进化距离。统发育分析，鉴定菌株X2为芽孢杆菌属的侧孢短芽孢杆菌（B.laterosporus）。2.4X2在不同培养条件下的生长特性菌株X2在pH59均能生长，在pH为7 时，X2生长状态达到最佳（图3A），这表明X2能耐受较大范围的酸碱环境。在 pH 为3或 pH 为11时，X2几乎不能生长，说明X2在过酸过碱的环境中无法生存。如图3-B所示，X2在盐度5%o50%内均能生长，最适生长盐度为5%。在盐度为50%时，X2生长缓慢，明显受到了抑制，但在低于（含）40%o的盐度范围内，X2都能获得较好的生长。结果表明X2对盐度的耐受性比较强，能适应包括海水在内的绝大多数水体。不同温度下的生长结果显示（图3C），X2 在B10 um图1拮抗菌X2的形态特征-B.invocatus strain NCIMB13772(NR112210.1)-B.centrosporus strain DSM 8445(NR112211.1)-B.nitrificans strain DA2(NR112926.1)96B.renszeristrainDSM9887(NR040982.1)-B.massiliensis strainphR(NR118322.1)图2 基于X2菌株16 SrDNA序列构建的系统发育树对低温的适应性较弱。2.5X2降氨氮和亚硝酸盐的能力不同浓度的X2对培养基中氨氮和亚硝酸盐的去除效果如图4所示，除了最高浓度组外，X2对氨氮的去除率与X2的接种浓度呈正相关，并随时间先上升后保持稳定趋势，在第3天时氨氮去除率达到最高值。在X2接种浓度为5.0 10 CFU/mL时对氨氮的降解效果最好，去除率最高达到74.95%。最高浓度组的不佳表现，可能跟菌株自身的代谢排氨有关。0.5 m51Brevibacilus laterosoprus strain DSM 25(NR112212.)29B.laterosoprus strain LAM12465(NR037005.1)96B.laterosoprs srain NCDO 1763(NR118957.1)100B.laterosoprusstrainNBRC15654(NR112727.1)X2-B.flunrinis strainCJ71(NR116293.1)B.ginsengisoli strain Gsoil 3088(Nr041376.1)树中，菌株X2与侧孢短芽孢杆菌（GenBank 登录号 NR112212.1、NR0 37 0 0 5.1、NR118 957.1、NR112727.1）位于同一分支（图2），关系最近。根据菌株X2的形态特征以及16 SrDNA序列的系-B.sedinrinis strainYIM78300(NR148612.1)2040温度内均能生长，2 0 35范围内X2的生长活力随着温度的上升而增长。在温度为35时，菌株X2表现出了明显的生长优势，温度达40 时，X2生长活力降低；2 0 时菌株的生长活力相对最差。说明X2对高温的适应性较强，第4期Fig.3 The growth curves of strain X2 under different pH(A),salinity(B)and temperatures(C)conditions去除亚硝酸盐方面，X2接种在浓度为5.0 1055.0 10 CFU/mL时均能获得很好的去除效果，其中X2接种浓度为5.0 10 CFU/mL在第31005.010(a)+5.0107%8060402000Fig.4 Degradation of ammonia nitrogen and nitrite by different concentrations of X23讨论目前，我国已报道的有良好拮抗效果的芽孢杆菌有短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）等2 4。本实验获得的菌株X2对米尔伊丽莎白菌具有良好的体外拮抗作用，并通过对菌体形态学特征以及16 S rDNA序列分析鉴定其为侧孢短芽孢杆菌。侧孢短芽孢杆菌因其能产生抗虫、抗细菌和抗真菌物质，已被作为拮抗菌应用2 5.2 6 ，SAIKIA等2 7 在2 0 11年报道了侧孢短芽孢杆菌对重要植物病原菌和革兰氏阳性菌具有抑菌作用。本实验结果显示侧孢短芽孢杆菌X2株对米尔伊丽莎白菌具有较强的拮抗能力，能张虹等：米尔伊丽莎白菌拮抗菌的筛选鉴定及其特性分析pH33.5(A)3.02.52.01.51.00.50.002468101214161820时间/h3.5(C)3.02.52.031.51.00.50.002468101214161820时间/h图3菌株X2在不同pH(A)、不同盐度(B)和不同温度(C)下的生长曲线天时对亚硝酸盐的去除率最高，达到99.8 9%。接种浓度为5.0 10 3CFU/mL和5.0 10 CFU/mL的X2对亚硝酸盐的去除效果相对较差。100(b)80+5.0105+5.0103+5.010l12时间/d图4不同浓度(CFU/mL)的X2 对氨氮(a)和亚硝酸盐(b)的降解作用575%0+pH53.5(B)pH73.0+pH92.5+pH112.01.51.00.5三0.0024683101214161820时间/h+20+25+30+35+40604020034+10%0+20%0+30%0+40%0+50%0+5.010+5.0107+5.0105+5.0103+5.01001时间/d在蛙类疾病防控中发挥作用，将具有较大的应用价值。对拮抗菌生长特性的研究是其规模化生产应用的基础，研究菌株的最适培养温度、盐度和pH,有利于指导其规模化生产和应用。从拮抗菌X2的生长特性来看，菌株X2在pH5、p H 9 的条件下都能生长，pH5的生长优于pH9，这表明该菌株耐酸碱能力强，且对偏酸性环境的适应性要强于偏碱性环境。盐度方面，X2在5%o40%o 的范围内都能较好生长，这表明X2强大的盐度耐受性能使其广泛应用于淡水和海水的水产养殖中。X2对温度的适应性表明，其对高温的适应性较强，对低温的适应性较弱，其繁殖活力随温度的升高而增强。23458在病害频发的高温季节，X2能更有效发挥作用。氨氮在水体中以游离氨（NH，）和离子铵（NH）相互转化的形式存在2 8。亚硝酸盐（NO z）是氨氮转化为硝酸盐（NO；）的中间态，6 VERSCHUERE L,ROMBAUT G,SORGELOOS P,et al.Probiotic它以不稳定形式存在，在水体溶氧充足时，容易转bacteria as biological control agents in aquaculture J.Microbiology化为无毒的硝酸盐，缺氧时可转化为毒性更强的and Molecular Biology Reviews,2000,64(4):655-71.7 GANGULY N K,BHATTACHARYA S K,SESIKERAN B,et al.Ic-氨。过高的氨氮浓度会导致养殖中鱼虾生长缓慢，幼体成活率低，严重时甚至导致死亡2 8 ，而亚硝酸盐能促使血液中的血红蛋白转化为高铁血红蛋白，高铁血红蛋白不易与氧结合，降低了血液输送氧气的能力，从而造成水生动物缺氧，进而引起一系列的生理机能紊乱和病理损伤。目前，除氮脱氮的方法主要有物理法、化学法和生物法，物理化学法通过过滤、沉淀、离子交换等手段使含氮物质转化为无害或少害物质2 9，这种方法见效快但二次污染严重。生物除氮法主要是应用微生物及其它生物将含氮有机物或无机物进行转化利用，具有经济、易操作、无公害等优势30 。2 0 世纪90 年代以来，微生态制剂就开始在水产养殖中投人使用31,其中光合细菌、硝化细菌、假单胞菌、芽孢杆菌被分离出来用于水产养殖业32 。易弋等3 从鲤（Cy p r i n i d a e）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）混养池中分离出一株能显著降解水体氨氮的巨大芽孢杆菌X1，其接种2 4h和48 h对氨氮的去除率分别达97.7%与98.4%；杭小英等34 应用枯草芽孢杆菌改善养殖罗氏沼虾水体后，氨氮和亚硝酸盐的最大去除率分别达到59.6 1%和8 6.7 0%。本实验中的侧孢短芽孢杆菌X2对氨氮和亚硝酸盐的去除率最高分别达到7 4.95%和99.8 9%，除氮效果显著。综上所述，拮抗菌侧孢短芽孢杆菌X2具有较强的耐酸碱性、耐盐性，适温性广等特性，同时具有较强的去除氨氮和亚硝酸盐的能力，可作为益生菌应用于蛙类养殖中防控米尔伊丽莎白菌感染和水质调控，为蛙类绿色健康养殖提供新的技术手段。参考文献：1J LEI X P,YI G,WANG K Y,et al.Elizabethkingia miricola infectionin Chinese spiny frog(Quasipaa spinosa)J.Transboundary and E-merging Diseases,2019,66(2):1049-1053.2 HU R,YUAN J,MENG Y,et al.Pathogenic Elizabethkingia Miricolainfection in cultured Black-Spotted frogs,China,2016 J.Emer-ging Infectious Diseases,2017,23(12):2055-2059.3】单晓枫,张洪波,郭伟生，等.嗜水气单胞菌拮抗菌的筛选J.淡水渔业,2 0 0 7,37(6)：45-47.4刘有华,许赛，王倩楠，等.泥鳅白头病病原菌的分离鉴定、药敏淡水渔业试验及拮抗菌的筛选J.淡水渔业，2 0 2 1,51（3）：41-47.5 LI X,GAO X,ZHANG S,et al.Characterization of a Bacillus velezen-sis with antibacterial activity and inhibitory effect on common aquaticpathogens J.Aquaculture,2020,523(19):735165.mr-Dbt guidelines for evaluation of probiotics in Food J.IndianJournal of Medical Research,2011,134(1):22-25.8 CASTELLAZZI A M,VALSECCHI C,CAIMMI S,et al.Probioticsand food allergy J.Italian Journal of Pediatrics,2013,39:47.9 BOMBA A,NEMCOVA R R,MUDRO N OVA D,et al.The possibil-ities of potentiating the efficacy of probiotics JJ.Trends in Food Sci-ence&Technology,2002,13(4):121-126.10 FOOKS L J,FULLER R,GIBSON G R.Prebiotics,Probiotics andhuman gut microbiology J.International Dairy 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River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory ofFreshwater Biodiversity Conservation,Ministry of Agriculture,Wuhan 430223,China)Abstract:A strain X2 with strong inhibitory effect on Elizabethkingia miricola was isolated from the soil of rice-frog culture paddy field by plate confrontation method in this study to screen antagonistic bacteria which can an-tagonize pathogenic bacteria of E.miricola,and to analyze its growth characteristics and its effects on reducing am-monia nitrogen and nitrite nitrogen.X2 was identified by morphological observation and 16S rDNA sequencinganalysis,and then the growth curve of X2 under different pH,salinity and temperature was determined to e-valuate its environmental adaptability.X2 was inoculated in ammonia nitrogen and nitrite medium,and the re-moval rate was determined to assess its ability to remove ammonia nitrogen and nitrite.Combined with morpho-logical characteristics and 16S rDNA sequence analysis,X2 was identified as Brevibacilus laterosporus.The growthresults under different culture conditions showed that X2 could grow in the range of pH 5 9,salinity 5%50%0 and temperature 20 40.T h e o p t i mu m p H,s a l i n i t y a n d t e mp e r a t u r e w e r e 7,50%o a n d 35 C,r e s p e c-tively.The results showed that X2 has strong adaptability to the environment.It had strong acid and alkali re-sistance,salt tolerance,wide temperature adaptability.X2 also showed a strong ability to remove ammonia ni-trogen and nitrite.While the inoculation concentration of X2 was 5.0 107 CFU/mL,the removal rate of am-monia nitrogen was the highest,reaching 74.950%.The removal rate of nitrite was the highest,reaching99.89%whilethe inoculation concentration was 5.0 105 CFU/mL.The results showed that B.laterosporus X2had strong antagonism to E.miricola,strong environmental adaptability and strong ability to remove ammonia ni-trogen and nitrite.It can be used as probiotics to prevent and control E.miricola infection and water quality regu-lation in frog culture.Key words:Elizabethkingia miricola;Brevibacillus laterosporus;antagonistic bacteria;identification;ammonia nitro-gen degradation