食品中赭曲霉毒素A检测方法研究进展_蒋彩云.pdf

第 卷 第 期 年 月 贵州师范大学学报（自然科学版）（）引用格式：蒋彩云，胡海祥，赵津津，等 食品中赭曲霉毒素 检测方法研究进展 贵州师范大学学报（自然科学版），（）：，（），（）：食品中赭曲霉毒素 检测方法研究进展蒋彩云，胡海祥，赵津津，李 琰，（江苏经贸职业技术学院 健康学院，江苏 南京；江苏安舜技术服务有限公司，江苏 苏州；江苏经贸职业技术学院 江苏省食品安全工程技术研发中心，江苏 南京）摘要：赭曲霉毒素是一种丝状真菌毒素，有、种化合物，受其污染的食品会对人体产生危害，尤其是赭曲霉毒素 的危害最为突出。目前，对食品中赭曲霉毒素 的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、酶联免疫法、电化学传感器法以及荧光分析法，笔者通过梳理、分析上述检测方法的优缺点，提出：薄层色谱法、酶联免疫吸附等传统方法可在灵敏度和准确性等方面提升；高效液相色谱、液相色谱 串联质谱法等相对比较成熟的方法可在成本、选择性上进一步优化；电化学传感器、荧光传感器等这些具有绿色性和创新性的检测方法，如在电极材料制备技术、核酸适配体筛选及修饰技术上再提高，其应用前景必将更加广泛。关键词：真菌毒素；赭曲霉毒素；检测方法；食品中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）：，（，；（），；，）：，；，；，收稿日期：基金项目：江苏省高校优秀科技创新团队（年）；江苏省高等学校自然科学研究面上项目（）；江苏省 高层次人才培养工程；江苏经贸职业技术学院领军人才项目作者简介：蒋彩云（），女，博士，教授，研究方向：食品安全与营养，：，：；引言研究发现，食物发霉变质是因真菌毒素污染所致。赭曲霉毒素作为第二大真菌毒素（除了黄曲霉毒素外，赭曲霉毒素 是已发现的真菌毒素中危害最大的一种），是一种丝状真菌毒素，有、种化合物，其结构相似，可危及人和动物的肾脏功能。其中，赭曲霉毒素 不仅能致癌、致畸、破坏免疫系统，对肝、肾脏造成损害，还可导致神经中毒，已被国际癌症研究机构（，）确定为 类致癌物的一种真菌毒素。赭曲霉毒素 是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的，动物进食霉变的农作物后，产生的赭曲霉毒素 可进入动物的血液、肝脏及肾脏中，因其不易被代谢降解，最终会随食物链进入人体，进而危害人体健康。为此，许多国家出台了相关政策，并制定了食品中赭曲霉毒素 的限量标准。我国于 年建立了赭曲霉毒素 的相关限量及检测技术标准。由于检测方法直接影响食品中赭曲霉毒素 的监测与控制，因此，研发快速、有效的赭曲霉毒素 检测方法一直备受研究者们的关注，鉴于此，笔者对食品中赭曲霉毒素 现有的检测方法进展进行了梳理、分析，以期为新的检测方法的研发提供参考。食品中赭曲霉毒素 检测方法 薄层色谱测定法薄层色谱法（，）是最早用于真菌毒素检测的传统方法之一，也是最经典的食品中赭曲霉毒素 定性定量的检测方法，通常与其它技术联用。国际分析化学家协会（，）早期多选择薄层色谱法为检测方法，我国在 年以前一直都将薄层色谱法作为国家标准的检测方法，现行的国家标准 .将薄层色谱法收纳其中。薄层色谱测定法的原理是用三氯甲烷磷酸或使用石油醚甲醇水来提取试样中的赭曲霉毒素，经过液液分配后的提取液，根据其在 紫外光灯下会产生黄绿色荧光现象的特点，在薄层色谱板上与标准品进行比较，进而测定待测样品中赭曲霉毒素 的含量。在检测谷物中的赭曲霉毒素 时，横展和纵展相结合应用，常用的横展剂为乙醚，纵展剂为甲苯乙酸乙酯甲酸。薄层色谱测定法虽为最经典，且具有操作简单、使用试剂价格低廉、样品易处理等优点，但因所需试剂较多、检测耗时长、结果的重现性和灵敏度不佳以及耗费人力等问题，给其的应用也带来了诸多局限，以致逐渐被其它更加高效的检测方法取代。.高效液相色谱法目前测定食品中赭曲霉毒素和其他真菌毒素最常见的方法是高效液相色谱法（，），可同时进行定性和定量分析。国标.食品安全国家标准食品中赭曲霉 的测定中，前两法均使用了高效液相色谱法。该法也是国际上检测赭曲霉毒素 最常使用的方法。可结合不同的前处理方法，如免疫亲和层析净化高效液相色谱法、离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法等。.免疫亲和层析净化液相色谱法免疫层析技术是将抗原抗体特异性反应的免疫技术原理与层析净化和色谱技术进行融合发展而得到的一种检测方法。利用免疫亲和柱净化后，再用高效液相色谱与荧光检测器结合测定试样中赭曲霉毒素 的含量，最后用外标法进行定量。李建忠等使用传统的免疫亲和层析净化液相色谱法对小麦、玉米和大米等谷物中的赭曲霉毒素 进行测定。对不同品种谷物中的赭曲霉毒素 进行提取后，经免疫亲和柱净化，高效液相色谱法荧光检测器测定，使用外标法定量。结果显示不同种类的粮食中的赭曲霉毒素 在.浓度范围内皆具有良好的线性关系，在.、.和.浓度下的加标回收率在.，检出限为.，个浓度下 第 期蒋彩云，胡海祥，赵津津，等：食品中赭曲霉毒素 检测方法研究进展 次重复测定的相对标准偏差 值为.，且浓度越高重复性越好。潘迎芬等采用免疫亲和层析净化液相色谱法对花生及其制品进行检测。待测试样经过甲醇水的提取，提取液经过滤、稀释之后，得到的滤液经过含有对赭曲霉毒素有特异的抗体免疫亲和层析净化，再用甲醇洗脱，所得的洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪测定赭曲霉毒素的含量。该方法对花生中赭曲霉毒素 的检出限为.。该方法还可以检测黄曲霉毒素、，结果同样准确可靠。相比于其它检测方法，免疫亲和层析净化液相色谱法具有操作简便、快速准确、回收率高、精密度良好、重现性好等优点，适合谷物中赭曲霉毒素 的检测。.离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法作为一种相对廉价且可以有效提取净化食品中赭曲霉毒素 的技术，离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法一直深受大家的关注，主要用于玉米、稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆、咖啡、葡萄酒等食品中赭曲霉毒素 的定性和定量检测。孙月等建立了一种固相萃取高效液相色谱串联质谱的检测方法，将小麦、大豆等粮食的样品用乙腈水溶液提取后，采用氨基固相萃取柱进行富集，然后洗脱，最后使用高效液相色谱串联质谱法进行检测。该研究结果显示不同粮食中赭曲霉毒素 在一定浓度范围内线性关系良好，定量限为.，这与免疫亲和层析柱测定小麦粉中赭曲霉毒素 的方法一致，该方法的检出限为.，重复性偏差为.，回收率为.。由于传统的离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法大部分是应用正、反相固相萃取技术，故净化效果和回收率不佳。为此，薛斌等开创性地建立了一种阴离子交换混合反相吸附固相萃取技术。结果显示，用该方法检测的各种粮食中的赭曲霉毒素 回收率在 ，平均回收率在以上，平均 值为.，检测限为.。该方法充分发挥了高效液相色谱技术检测赭曲霉毒素 的高效性和灵敏性，结果稳定，与其它赭曲霉毒素 的检测方法相比，节约了检测成本，提高了检测效率。之后薛斌等又建立了一种将 固相萃取柱与离子交换混合反相固相萃取柱联用，对花生及其酱制品中赭曲霉毒素 进行提取、净化、富集和浓缩的双柱固相萃取技术，富集后的赭曲霉毒素 再经高效液相色谱检测。该方法提高了花生中赭曲霉毒素 的回收率，花生酱中赭曲霉毒素 的回收率也可控制在标准之间。高效液相色谱法是现行最普遍的检测方法，其检测结果更加准确，灵敏度高。但由于仪器价格及维护使用费用高，也提高了检测成本，故很难满足大批量快速检测的需要。.液相色谱串联质谱法液相色谱串联质谱法（）的原理是将液相色谱与质谱结合，广泛应用于检测领域，由于可用来进行定性判定和定量分析，现如今也被运用到赭曲霉毒素 的检测当中。张琼等使用液相色谱串联质谱法对玉米和小麦进行了深入研究，试样经提取液提取后，再通过免疫亲和柱净化，用液相色谱串联质谱法对其中的赭曲霉毒素 进行测定。该实验在玉米、小麦样品中分别添加.、.和.个浓度水平的赭曲霉毒素 标准溶液，并进行 次重复实验，结果显示，在此添加浓度范围内，玉米、小麦中赭曲霉毒素 的回收率为，变异系数小于。曾羲等以赭曲霉毒素 的一种化合物作内标，采用液相色谱串联质谱法检测了 个批次的粮食及其制品中赭曲霉毒素 含量，通过几种分析仪器进行比较，发现使用同位素标记法结合液相色谱串联质谱法测定的粮食及其制品中的赭曲霉毒素 的检测限最低，灵敏度也较高。该方法准确性高，操作简单，适合粮食及其制品中低浓度赭曲霉毒素 的定性定量检测。液相色谱串联质谱法普遍具有设备造价检修昂贵，操作技术复杂，检测周期长等问题，故其的推广与应用也受到了限制。.酶联免疫法酶联免疫法是一种免疫化学方法，一般用于定性检测。该法利用抗原和抗体之间具有特异性反应的原理，再通过酶的反应放大检测信号，进而测定样品中待测组分含量。.直接竞争荧光酶联免疫法裴可研究了一种可定量检测的直接竞争荧光酶联免疫法，将尿素水解产生的氨与硝酸银还原产生的银纳米粒子组成壳核结构，再通过观察其等离子共振峰与溶液颜色的变化来进行待测物定量 贵州师范大学学报（自然科学版）第 卷及定性检测。检测限低于商业化赭曲霉毒素 检测试剂盒近 倍，赭曲霉毒素 定量检测范围也变得更加精准，可以实现高灵敏及裸眼检测。对玉米、面粉、大米、白葡萄酒进行加标实验，结果显示 种样品加标平均回收率为.，变异系数为.。余厚美等利用单克隆抗体和酶标抗原，建立了与竞争酶联免疫吸附测定法不同的快速检测方法。实验过程中发现随着添加的活性炭量的增高，检测吸光度也会随之升高，说明活性炭对降低基质干扰有一定的影响。该方法的灵敏度为.，样本回收率稳定在 ，检测限为.。.等离子共振酶联免疫法梁毅设计了一种可以对赭曲霉毒素 进行裸眼检测的等离子共振酶联免疫法。该方法利用辣根过氧化物酶、络氨酸酶以及过氧化氢体系诱导金纳米粒子聚集而产生胶体金使颜色发生变化。将该现象作为酶联免疫法的信号输出，以过氧化氢酶作为抗原标记酶。此方法结合了过氧化氢酶的催化活性高和金聚集反应颜色变化迅速的优点，裸眼检测赭曲霉毒素 的 值为 ，定量检测赭曲霉毒素 的线性范围为.，线性相关指数 为.，对玉米加标实验显示平均回收率在.。此方法有望应用于资源匮乏地区的食品安全检测，或是需要大批量高效率的检测场景。.生物荧光酶联免疫分析法包昆鹭等开发了一种基于纳米抗体纳米荧光素酶融合蛋白的生物荧光酶联免疫分析法。通过优化竞争反应时间、甲醇浓度以及盐离子的强度达到更好的实验结果，检测范围为.。该方法特异性好，与赭曲霉毒素的其他化合物以及其它几种常见真菌毒素，如黄曲霉毒素等，无明显的交叉反应，回收率均在规定范围内，具有良好的检测性能。章先等将赭曲霉毒素 单克隆抗体包裹于纳米磁珠表面制得具有免疫活性的磁珠抗体复合物，再制备生物素标记的偶联抗原，通过链酶亲和素标记过的纳米金颗粒对底物进行催化，从而实现信号检测。该方法缩短了检测时间，提高了检测灵敏性，对玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达.。对天然样本中赭曲霉毒素 含量的检测结果表明，该方法与 相关性良好。该方法可实现赭曲霉毒素 的低成本、高灵敏度、高效率的定量，在饲料及谷物中赭曲霉毒素 的检测中具有很好的应用前景。酶联免疫吸附测定法是一种可以快速筛查食品中赭曲霉毒素 的检测方法，虽具有耗时短、选择性强、灵敏度高、样品预处理过程简单等优点，但因抗原抗体的特殊性而不易制备，且具有寿命短、重现性差、只能用于食品中赭曲霉毒素的定性判断、容易出现假阳性现象等缺点，故不能作为最可靠有效的赭曲霉毒素 的检测方法，通常需要 法进一步确认。.电化学传感器电化学传感器主要是基于待测物的电化学性质，将待测物的化学量转为电学量后进行检测的一种传感器。具有高特异性、强亲和力、高灵敏性和反应性等优点。.电化学发光免疫传感器曹宏梅等通过对吸收了金离子的蛋壳粉进行干燥、焙烧处理，得到 纳米颗粒，将其分散到 溶液中，得到 纳米颗粒，再将该纳米颗粒固载在电极表面并进行修饰，得到（）电极，将该电极与赭曲霉毒素抗体进行孵育，最终得到可检测赭曲霉毒素的电化学发光免疫传感器，该传感器通过检测电化学发光信号，从而实现对赭曲霉毒素 的定量分析。对咖啡样品进行加标回收实验，结果显示：个浓度下 次重复测定的相对标准偏差 值为.，回收平均率达到了.，具有高灵敏度、高特异性、高回收率等优点。.分子印迹电化学传感器分子印迹电化学传感器是一种将分子印迹技术和电化学传感技术相结合的分析方法，该传感器具有专一性强，稳定性高，成本低等优点。贺博等以赭曲霉毒素 为模板分子，将掺杂 的硅溶胶为功能单体，与模板分子赭曲酶毒素 产生强的配位作用，制得了更具识别能力与更高稳定性的印迹电化学传感器。此方法优化了实验条件，且可以进行更具选择性的检测研究。检测结果显示：赭曲霉毒素 在.范围内与峰电流相关系数为.，检出限为.。等用多壁碳纳米管和分子印迹聚合物改善玻碳电极，用赭曲霉毒素 印迹的聚吡 第 期蒋彩云，胡海祥，赵津津，等：食品中赭曲霉毒素 检测方法研究进展咯作为识别元件，研发了分子印迹电化学传感器。对啤酒和葡萄酒样品的加标回收率为 ，相对标准偏差在.。检测范围为.，检测限.。电化学传感器与普通的检测分析方法相比，具有高灵敏度、高选择性等优势，但在电极的稳定性等方面仍需进一步改进。.荧光分析法荧光是指荧光分子或荧光纳米材料从激发态返回基态时发出的光，荧光分析法是利用荧光信号所建立的分析方法。荧光分析方法具有灵敏度高、操作简便的特点，但选择性不佳。作为有“化学抗体”之称的核酸适配体，与传统抗体相比，具有分子量小、稳定性高、易修饰、识别靶标广泛和无免疫原性等优点，因此近年来以核酸适配体作为识别元件建立的荧光传感器逐渐成为食品检测领域的研究热点。吕蕾等利用荧光素（）修饰 适配体，通过纳米金对 荧光信号的淬灭作用，将适配体对 的识别过程转换为荧光信号的变化，建立了一种高灵敏度的 荧光检测方法。该方法线性范围为 ，为.，检测限为 。郭婷等构建了基于核酸染料 和适配体的荧光传感体系用于 检测。由于 适配体与其互补链形成的双链结构与 染料结合后可产生较强的荧光信号，当 加入后，适配体与 结合形成四链体结构，双链被破坏，进而导致染料的荧光强度降低。利用 浓度与荧光强度变化之间的关系建立线性方程，为.，线性范围为 ，实际 为 ，且该传感体系对 具有较强的选择性。张红艳等以氨基化的介孔二氧化硅纳米材料（）为载体，以罗丹明 为荧光信号分子，利用适配体与 之间的静电吸附作用，将适配体与 相结合，再通过 与适配体之间的特异性反应，实现 的快速检测。将该方法应用于山药及薏苡仁等实际样品中 的测定中，其线性范围为 ，相关系数为.，检出限为.。该方法具有操作简单、特异性强、稳定性好的优势，可用于 的现场快速检测。目前基于核酸适配体的 检测技术取得了较为显著的成果，但也存在合成修饰过程成本较高等问题。总结与展望研究对食品中赭曲霉毒素 的检测方法进行了介绍，并对各类方法的优缺点进行了分析。薄层色谱测定法具有操作简单、价廉、样品易处理等优点，但存有检测耗时长、结果的重现性和灵敏度不佳等问题；高效液相色谱法、液相色谱质谱联用技术具有检测结果准确，灵敏度高的优点，但仪器投入成本高（尤其是结合先进的样品处理方式）；酶联免疫法具有耗时短、选择性强、灵敏度高、样品预处理过程简单等优点，但容易出现假阳性现象等缺点；电化学传感器具有高特异性、强亲和力、高灵敏性和反应性等优点，但由于电极的稳定性问题容易影响检测的稳定性和重现性；荧光检测法结合核酸适配体标记技术，具有特异性强、稳定性好的优势，但荧光探针的合成修饰需要较高的实验成本，且荧光信号检测结果还容易受到背景荧光信号和待检样品基质成分的干扰。未来，薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附等相对比较成熟的传统方法，可在成本、检测性、灵敏度、选择性上进一步发展与优化。一些具有绿色性和创新性的检测方法，如电化学传感器、荧光传感器等，会因电极材料制备技术和核酸适配体筛选及修饰技术的不断提高，应用前景越来越广阔。除此外，如何研发快速、灵敏、绿色、可用于现场检测的新方法也需广大研究者们积极探索。参考文献：疏秀林，施庆珊，欧阳友生，等 赭曲霉毒素的产生及鉴别 中国卫生检验杂志，（）：郭晶，芮玉奎，金银花，等 赭曲毒素 的危害及其检测方法研究进展 生物技术通讯，（）：食品安全国家标准食品中真菌毒素限量：北京：中国标准出版社，翟若涵，蔡瑞，高振鹏，等 食品中赭曲霉毒素 检测方法研究进展 食品安全质量检测学报，（）：食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素 的测定：北京：中国标准出版社，桑晓霞，马江媛，黄登宇 赭曲霉毒素 检测方法的研究进展 食品安全质量检测学报，（）：贵州师范大学学报（自然科学版）第 卷 李建忠，张舸 免疫亲和层析净化液相色谱法检测谷物中赭曲霉毒素 粮食科技与经济，（）：潘迎芬，郑育莉，方成俊，等 免疫亲和层析净化高效液相色谱法同时检测几种食品中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素 福建分析测试，（）：孙月，赵晋铭，贾雯晴，等 固相萃取高效液相色谱串联质谱法检测粮食中赭曲霉毒素 江苏农业学报，（）：薛斌，吕艳春，何志军 离子交换固相萃取 检测粮食赭曲霉毒素 研究 粮食与油脂，（）：薛斌，曹文明，吕艳春，等 双柱固相萃取 检测花生和花生酱中赭曲霉毒素 粮油食品科技，（）：张琼，任君妍，吴振兴，等 免疫亲和层析液相色谱串联质谱法测定玉米和小麦中的赭曲霉毒素 食品安全质量检测学报，（）：曾羲，林子豪，雷芬芬，等 同位素内标高效液相色谱串联质谱法测定粮食及其制品中赭曲霉毒素、和 食品工业科技，（）：裴可 基于脲酶的两种检测赭曲霉毒素 的高灵敏酶联免疫吸附法 南昌：南昌大学，：余厚美，王琴飞，林立铭，等 木薯叶粉中赭曲霉毒素 快速检测方法的建立 食品安全质量检测学报，（）：梁毅 两种检测赭曲霉毒素 的新型酶联免疫吸附方法的研究 南昌：南昌大学，：包昆鹭，苏本超，刘星，等 咖啡中赭曲霉毒素 一步生物荧光酶联免疫分析法的研究 西安：中国食品科学技术学会，：章先，何珂，黄志伟，等 基于纳米颗粒的赭曲霉毒素 高灵敏酶联免疫检测方法的建立及应用 菌物学报，（）：高栋，陈秀金，李兆周，等 电化学传感器在赭曲霉毒素 检测中的应用研究进展 食品与发酵工业，（）：曹宏梅，李林芝，李瑞，等 一种检测赭曲霉毒素 的电化学发光免疫传感器的制备和应用：贺博，王茜，陈苗苗，等 掺杂的溶胶凝胶分子印迹膜修饰电极测定赭曲霉毒素 湖北大学学报（自然科学版），（）：，：，：褚庆华，郭德华，王敏，等 谷物和酒类中赭曲霉毒素 的测定 中国国境卫生检疫杂志，（）：刘继红，胡颖，洪慧杰，等 赭曲霉毒素 核酸适配体筛选 食品安全质量检测学报，（）：，（）：，：，：，（）：吕蕾，赵阳阳，刘仁杰，等 基于纳米金与适配体的赭曲霉毒素 检测方法研究 食品与机械，（）：郭婷，叶志杰，周鸿媛，等 基于染料 和适配体的荧光传感体系检测赭曲霉毒素 食品科学，（）：张红艳，黄丽珊，魏小红，等 基于适配体荧光传感器检测山药和薏苡仁中的赭曲霉毒素 食品安全质量检测学报，（）：责任编辑：赵建华 第 期蒋彩云，胡海祥，赵津津，等：食品中赭曲霉毒素 检测方法研究进展