手持式近红外仪快速测定姜黄丸原料混合物中姜黄素含量_谢梦迪.pdf

书书书药学doi:1013819/jissn2096708X202302001引用本文格式:谢梦迪，桂新景，曹英杰，等手持式近红外仪快速测定姜黄丸原料混合物中姜黄素含量J 湖北医药学院学报，2023，42(2):115120手持式近红外仪快速测定姜黄丸原料混合物中姜黄素含量谢梦迪1，桂新景2，3，曹英杰2，3，4，5，岳佑凇1，王艳丽2，3，4，施钧瀚2，3，4，张璐2，3，4，姚静2，3，4，刘瑞新2，3，4，5(1河南中医药大学;2河南中医药大学第一附属医院药学部;3河南省中药临床应用评价与转化工程研究中心;4河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心;5河南省中药临床药学中医药重点实验室(建设单位)，河南 郑州450000)摘要 目的:建立一种手持式近红外光谱技术与正交投影偏最小二乘法(orthogonal projection partial leastsquares，OPLS)相结合的快速检测姜黄丸原料混合物中姜黄素含量的方法。方法:取姜黄、炒蒺藜饮片，分别粉碎过筛，按照不同比例混合均匀，制备 26 个样本;采用 HPLC 方法测定样品中姜黄素含量，以测定值为标签值(Y)，手持式近红外光谱仪分别采集每批样品的近红外光谱数据 5 次取平均值作为近红外基础数据(X，n=26);利用 SIMCA141 软件进行光谱数据的预处理，利用 k 折交叉验证方法建立姜黄丸的正交投影偏最小二乘法(OPLS)定量校正模型 Y=M(X)。结果:预测 Y 值与实测 Y 值 OPLS 模型回归方程的决定系数 2为 09893，MSECV 为 00751;采用 Permutation(置换检验)对模型进行内部验证，结果发现模型没有出现过拟合，模型预测效果良好。结论:利用手持式近红外光谱仪可以实现对姜黄丸原料混合物的快速、无损检测。关键词 近红外技术;HPLC;姜黄素;定量模型;OPLS 基金项目 国家自然科学基金面上项目(81773892);河南省中医药拔尖人才培养项目(重点项目)(2019ZYBJ07);河南省高层次人才特殊支持“中原千人计划”“中原青年拔尖人才”项目(ZYQ201912158);河南省卫生健康中青年学科带头人专项(HNSWJW2020014);河南省中医管理局 2022 年度河南省中医药科学研究专项课题(2022ZY1050);中管局基地专项(2018JDZX087);河南省中医药科学研究专项课题(2021JDZY104)作者简介 谢梦迪(1996)，女，河南平顶山人，硕士研究生，研究方向:中药饮片临床应用现代化关键技术。通信作者 刘瑞新(1980)，男，河南商丘人，主任药师，硕士生导师，研究方向:中药饮片临床应用现代化关键技术。Email:liuruixin7 163comapid Determination of Curcumin in aw Material Mixture of Jianghuang Pills by Handheld Near Infrared Ana-lyzerXIE Mengdi1，GUI Xinjing2，3，CAO Yingjie2，3，4，5，YUE Yousong1，WANG Yanli2，3，4，SHI Junhan2，3，4，ZHANG Lu2，3，4，YAO Jing2，3，4，LIU uixin2，3，4，5(1Henan University of Chinese Medicine;2Department ofPharmacy，The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine;3Evaluation and Transformation Engineer-ing esearch Center of Clinical Application of Traditional Chinese Medicine in Henan Province;4Coconstruction Collabora-tive Innovation Center for Chinese Medicine and espiratory Diseases by Henan Education Ministry of P China，HenanUniversity of Traditional Chinese Medicine;5Henan Key Laboratory for Clinical Pharmacy of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou，Henan 450000，China)Abstract:Objective To establish a method for the rapid determination of curcumin in Jianghuang pills by handheld nearinfrared spectroscopy combined with orthogonal projection partial least squares(OPLS)Methods 26 samples were pre-pared by pulverizing turmeric and stirfried tribulus teristus and mixing them evenly according to different proportions Thecontent of curcumin in powder samples was determined by HPLC，and the value was taken as the label value(Y)Thenearinfrared spectral data of each batch of mixed powder samples were collected by handheld NI spectrometer for 5511谢梦迪，等手持式近红外仪快速测定姜黄丸原料混合物中姜黄素含量times，and the mean value was taken as the basic nearinfrared data(X，n=26)SIMCA141 software was used to prepro-cess the spectral data，and the kfold crossvalidation method was used to establish the orthogonal projection partial leastsquares(OPLS)and quantitatively calibrate Y=M(X)model of Jianghuang Pills esults The determination coefficient2of the OPLS model regression equation between predicted and measured Y values was 09893，and MSECV was0.0751 Permutation test was used to verify the model internally，and the results showed that the model did not appear over-fitting，and the model prediction effect was goodConclusion The use of a handheld nearinfrared spectrometer can achieverapid and nondestructive detection of raw material mixtures of Jianghuang pillsKey words:Near infrared technology;HPLC;Curcumin;Quantitative model;OPLS姜黄丸主要由姜黄与炒蒺藜组成，具有通经活血、散风行气的功效，用于治疗白癜风。姜黄素是从姜黄中提取得到的一种酸性多酚化合物，具有抗炎、抗氧化应激等多种药理作用，临床上主要用于改善或减轻炎性反应12、肝脏组织病理变化、胰岛素抵抗3、高胆固醇血症4;同时还具有良好的抗炎及抗肿瘤5 作用;可改善 AD 小鼠、大鼠和非灵长类模型的认知和记忆功能6。姜黄丸以姜黄作为主药，实际质量检测工作中常用 TLC 法对姜黄素定性分析，HPLC 法进行定量测定。但上述方法存在以下缺点，如耗费提取溶剂和色谱柱;样品前处理和含量测定操作时间长、效率低;频繁使用有机试剂对操作人员的健康存在一定危害;实验环境或者操作人员的不同会对实验结果造成影响等。近红外光谱(near infrared，NI)采集的波段范围是 7802500 nm(波数范围 12 5004000 cm1)，是一种介于可见光波段和中红外光波段间的电磁波，可反映含氢基团的倍频信息和合频信息7，具有分辨率高，检测速度快89，样品分析时不破坏分析样品，适用于在线和现场分析等优势10;既能对复杂样品进行定性、定量分析，也可满足固体、液体和粉末等多种类型样品的检测需求1113。NI 技术已在食品、药品、饲料、农业和石油化工等领域广泛应用11，1417，但在医院制剂方面使用较少。因传统近红外仪器较大，且需要连接配套的电脑软件才能使用，不利于生产过程中快速及时的测定。而手持式近红外仪能够很好地解决这一问题1820，它具有不受场地、环境、配套设施的限制、方便携带等优点，可以实时对待测样品进行定性和定量分析。然而基于手持式近红外光谱仪对姜黄丸不同比例原料混合粉末中姜黄素含量测定的研究尚未见报道。因此，本研究首先制备了 26 批不同比例的姜黄、炒蒺藜混合样品，利用手持式近红外光谱技术采集光谱信息，以 HPLC 法测定的姜黄素含量作为标签值，结合 SIMCA 141 建立姜黄素的正交投影偏最小二乘法(orthogonal projections to latent structures，OPLS)定量模型，以实现对不同比例粉末样品的快速、无损测定。1仪器与试药11仪器手持式近红外光谱仪(金光 GSA301 型，山东金璋隆祥智能科技有限责任公司，检测波长 1550 1950 nm)，U3000 高效液相色谱仪，美国 Thermo 公司;VWD3X00(S)紫外检测器，Chromeleon 710色谱数据处理系统。高速万能粉碎机(FW100，60180 目，北京科伟永大仪器有限公司);电热鼓风干燥箱(GZX9146MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂);超声波清洗器(HK250，上海科导超声仪器有限公司);电子天平(HZTB6000，华志电子科技 有 限 公 司)，药 典 筛(二 号 筛)，电 子 天 平(BCA2248CW，Sartorius，万分之一天平)，分析天平(CP225D，Sartorius，十万分之一天平)。12饮片及试药姜黄(产地四川，批号:2103181，安徽亳州中药饮片公司)、炒蒺藜(产地内蒙古，批号:2012252，安徽普仁中药饮片有限公司)饮片购自于河南中医药大学第一附属医院。对照品:姜黄素对照品，批号为20200717，HPLC 测定质量分数均98%，上海源叶生物科技有限公司。试剂:乙腈为色谱纯，美国 Sig-ma 公司;其余试剂为分析纯，超纯水(MilliPoreQ，182 MQcm)。2方法与结果21样本制备及姜黄素的含量测定取姜黄 500 g、炒蒺藜 300 g 分别粉碎，过二号筛，按表 1 所示比例称量、混合均匀即为待测样本。按照 2020 版 中国药典 一部21 姜黄中姜黄素的测定方法，测定 26 批混合粉末中姜黄素的含量如表 1所示。供试品制备:分别取混合均匀的样品细粉约 10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 10611湖北医药学院学报(JHBUM)网址:http:/yyyxcbptcnkinet2023 年 4 月，42(2)mL，称定重量，加热回流 30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取上清液 1 mL，置 25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得 26 批供试品溶液。对照品的制备:取姜黄素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成浓度分别为 2 6、5 2、10 4、13.0、182、208、260 g/mL 的对照品溶液。色谱条件:色谱柱为 ShimpacCGISTC18AQ 色谱柱(46 mm250 mm，5 m)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈4%冰醋酸溶液(48 52)为流动相;流速 1 mL/min，进样量 10 L，检测波长为 430 nm。方法学考察参照 2020 版中国药典 一部21，精密度、重复性和稳定性 SD 值均小于 5%，姜黄素在 26260 g/mL 范围内呈良好的线性关系。表 1姜黄与炒蒺藜混合比例及姜黄素的含量序号姜黄 炒蒺藜姜黄素含量(mg/g)序号姜黄 炒蒺藜姜黄素含量(mg/g)145 1511121428 146421240 1486231527 143690339 1511291626 140212438 1492521725 143455537 1514631825 145727636 1509481924 142472735 1486572023 143994834 1494812122 143071933 1484932221 1415351032 1489212320 1395481131 1477562420 1400801230 1481452515 1357831329 1445902610 12981322近红外仪光谱采集取待测样本 3 g，每个样本重复装样置于石英样品池中，每个样本平行扫描 5 次;每次扫描前摇荡石英杯，使样品均匀平整，于室温(23 25)下用opus 图谱采集软件采集光谱，取平均值作为 NI 基础数据，每个样品导出 CSV 文件，每个 CSV 文件包含两列共 201 行数据，第一列为波长(nm)，第二列为每个波长对应的吸光度。采集的 NI 图见图 1。图 1姜黄丸原料混合物近红外原始光谱图23姜黄丸模型建立与优化本研究使用近红外采集 26 批样本 201 个色度信息平均值(26201)，利用 SIMCA 141 软件中OPLS 法建立定量分析模型 Y=M(X)。在光谱数据建模之前需先进行数据预处理，提取特征变量，以消除基线漂移和噪声对光谱带来的干扰。本研究对比了以 下 几 种 预 处 理 方 法2223:标 准 正 则 变 换(SNV)、多元散射校正(MSC)、标准正则变换+SG 卷积平滑+一阶导数(SNV+SG 卷积平滑+1ST Der)、多元散射校正+一阶导数(MSC+SG 卷积平滑+1STDer)、标准正则变换+多元散射校正+SG 卷积平滑+一阶导数(SNV+MSC+SG 卷积平滑+1ST Der)。将经过预处理光谱数据代入 SIMCA 141 软件建立OPLS 模型。不同预处理方法建立的 OPLS 模型结果见表 2。一般认为，交叉验证均方根误差(MSECV)表征测量曲线和真值曲线的拟合程度，MSECV 值越小，预测精度越高。建立模型考察的主要参数是2、Q2、MSECV，预处理方法中 MSC SG 卷积平滑1ST Der、SNV SG 卷积平滑 1ST Der 的 2=0.9893、Q2=09860，MSECV=00751，因此，最终选择 MSC SG 卷积平滑1ST Der、SNV SG 卷积平滑1ST Der 作为最优的预处理方法。711谢梦迪，等手持式近红外仪快速测定姜黄丸原料混合物中姜黄素含量表 2不同预处理方法建立的 OPLS 模型结果22X(cum)2Y(cum)Q2(cum)MSECV无预处理0910709990092500897001753SNV0964309990092500897001238MSC0964309380096700941001238SG1ST Der0852907070087100837002228SG2nd Der0873005080088300831002408SG3ST Der0862803150087600689003435SNV1ST Der0989308190099100986000751SNV2nd Der0873005080088300831002408SNV3ST Der0920802980092900730002892MSC1ST Der0989308190099100986000751MSC2nd Der0960206930096500953001431MSC3ST Der0920802980092900730002892SNVMSC0982609630098100971000869SNV+MSC+SG1ST Der0988107630099100989000604SNV+MSC+SG2nd Der0981206550098400979000803SNV+MSC+SG3ST Der0946803670095400900001877将处理好的近红外光谱数据导入 SIMCA 141 数据统计分析软件中，预处理方法采用 MSC SG 卷积平滑1ST Der、SNV SG 卷积平滑1ST Der，建立OPLS 模型。Permutation 对模型进行置换检验，判断模型是否出现过拟合，通过随机改变分类变量 Y 的排列顺序，多次建立对应的 OPLS 模型以获取随机模型的 2、Q2值。图 2 横坐标表示经过 200 次置换检验后随机模型与原模型的相似度，纵坐标表示2、Q2的值。是否过拟合的判断标准:2回归线在Y 轴的截距小于 04，Q2回归线在 Y 轴的截距小于005，2、Q2拟合回归线斜率大于 0，则说明模型没有出现过拟合。另外，大多数情况下 Q2回归线在 Y轴的截距是负值。本研究进行 200 次置换检验，结果发现:置换检验的 2回归线的 Y 轴截距为0.0355，Q2回归线的 Y 轴截距为0753，表明建立的模型没有出现过度拟合，预测能力良好，结果见图2。图 2姜黄丸原料混合物 OPLS 模型置换检验结果图 3 为姜黄丸原料混合物 OPLS 模型获取其变量重要性投影图，通过该模型获取其变量重要性投影(variable importance for the project，VIP)值，VIP值是反映自变量对因变量的解释能力的重要指标，VIP 值越大说明自变量对因变量解释能力越强，其中红框中的波长 VIP 值1，说明在 16521938 nm波长范围是影响姜黄丸定量模型的重要变量。图 4 为姜黄丸原料混合物 Y 值与预测 Y 值的回归分析图，横坐标表示的是姜黄丸 OPLS 模型中的预测 Y 值，纵坐标表示的是姜黄丸实测 Y 值。从图中可以看出，回归方程为 Y=1008X+003961，2=09893，说明该模型预测能力强。3讨论31样本的选择本院姜黄丸的制备是基于小米起模泛制水丸法由姜黄和炒蒺藜两种药材制备的水丸，水丸制备的基本工艺流程为:原料的准备、起模、成型、盖面、干811湖北医药学院学报(JHBUM)网址:http:/yyyxcbptcnkinet2023 年 4 月，42(2)图 3姜黄丸原料混合物 OPLS 模型获取其变量重要性投影图图 4姜黄丸原料混合物 Y 值与预测 Y 值的回归分析图燥、选丸、质检、包装。本研究的目的是从姜黄丸的原料控制其质量，每批药从原料、半成品、成品每一步都需要进行严格的质量检测。因此选择姜黄与炒蒺藜两味饮片的混合粉末样品进行含量测定，模拟姜黄丸制备过程中的第一步即“原料的准备”。因为用小米起模，成品姜黄丸在模型验证时考虑到小米的影响会对模型的验证结果产生一定程度的偏差，因此本次研究并没有用本院的成品姜黄丸进行验证。后期将继续研究小米的影响能否在模型中进行排除，并针对姜黄丸的半成品及成品进行更加深入的质量控制研究。32模型数据对预测性能的影响本研究自制 26 个样本，每个样本平行测定 5次，本研究将 5 次测定的数据取平均值代入软件，分别对数据进行 16 种预处理，结果发现在预处理方法采用 MSC1ST Der、SNV1ST Der 时模型预测性能最好，并且两种预处理方法建立的模型预测能力完全相同，因此最终采用这两种模型预处理方法。33手持式近红外光谱仪优点中药有效成分含量测定的方法有高效液相法、紫外可见分光光度法、液质联用技术、红外光谱法、核磁共振波谱法等。高效液相色谱法进行中药有效成分含量测定时，应根据被测成分的特点选择不同的检测器，但存在样品前处理时间长，流动相等有机试剂的使用会对人体健康造成影响等问题;紫外可见分光光度法虽运用广泛，使用频率高，但需要大量代表性样品进行建模、实验过程复杂、工作量大;核磁共振波谱法测定的样品要求一般为溶液，固体样品的测定需要配备特定装置的核磁共振波谱仪才能完成。红外光谱仪实验室常见的是大型仪器，需要与配套的软件联合使用，具有不方便携带、不适合制药制剂的在线含量控制。手持式 GSA(golden-pro spectral analyzer，GSA)近红外光谱仪主要应用于制药行业领域，核心采用微型芯片分光模块，是目前世界上最小的近红外分光系统，信噪比是线性阵列光谱仪的 3 倍。仪器可以通过视窗模块对生产设备内的样品进行快速无损检测。微型设计使之具有良好的便携性，为快速现场分析提供了更为灵活的整体解决方案。34OPLS 模型的应用有监督的 OPLS 是一种标准的高维数据分析方法，通过 k 折内部交叉验证的方式，建立预测集和响应集的线性关系对样本进行分类，进而提取样本的特征性差异信息。2X(cum)、2Y(cum)代表模型所能够解释 X、Y 矩阵信息的百分比，验证结果中2为决定系数，代表模型的拟合度;Q2代表通过交叉验证计算得到，用于评价模型的预测能力。2和Q2大于 05 说明此模型构建成功，具有很好的拟合度和预测能力24。2越接近 1，表明模型描述的数据越完整;Q2越接近 1，表明模型的预测能力越高。樊秦等25 采用 OPLS 建立当归药材质量与生态因子回归模型，得出 2=079，Q2=069，优选出影响911谢梦迪，等手持式近红外仪快速测定姜黄丸原料混合物中姜黄素含量当归药材质量的 4 个因素。本文采用不同的预处理方法，最终优选出 MSC1ST Der、SNV1ST Der 为最终的预处理方法，运用 OPLS 建立姜黄丸定量模型。该预处理方法保留了样本主要信息，实现了 Q2高达09860，模型预测能力强。利用近红外光谱仪采集不同比例姜黄丸的光谱信息，与高效液相法测定的含量结果相对照，SIMCA141 软件载入全光谱数据，采用 MSCSG 卷积平滑1ST Der、SNVSG 卷积平滑1ST Der 法进行样本预处理，建立 OPLS 姜黄素定量分析模型，结果姜黄素预测值与实测值之间 2为 09893，MSECV 为0.0751，相关性好，所选光谱最佳预测模型的准确性高，鲁棒性好，可完全满足近红外光谱技术对姜黄素含量检测的要求。近红外光谱技术在姜黄丸的质量控制方面具有重要意义，为中药质量控制提供良好借鉴。参考文献 1曹立花，李丽娟，胡晓丹，等姜黄素对子宫内膜异位症大鼠 PI3K/AKT/GSK3 通路及肥大细胞活化的影响 J 中国免疫学杂志，2021，37(4):480485 2赵克昌，吴世乐，杨金煜，等姜黄素对亚急性肝内胆汁淤积大鼠肠内菌群变化的影响及其机制研究 J 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