根肿菌侵染茎瘤芥不同时期效应子基因表达动态分析.pdf

王香梅等：根肿菌侵染茎瘤芥不同时期效应子基因表达动态分析1-生物技术 遗传育种湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）引用格式：王香梅，田芹，廖静静.根肿菌侵染茎瘤芥不同时期效应子基因表达动态分析 J.湖南农业科学，2023（7）：1-10.DOI:DOI:10.16498/ki.hnnykx.2023.007.0012023（7）：1-10茎瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）又名青菜头、菜头，是一种以瘤状膨大茎供食用的十字花科芸薹属蔬菜，既可鲜食又可腌制加工，是加工榨菜的原材料1。根肿病严重影响涪陵地区茎瘤芥的生产，常给种植户带来巨大的经济损失2。芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron）是引起根肿病的病原菌，它寄生于十字花科植物根部，使根部膨大形成肿瘤，影响植物水分和养分吸收，导致地上部萎蔫或死亡3-4。根肿菌是一种介于粘菌和真菌之间的土传专性活体寄生菌，在土壤中具有很强的存活能力，导致根肿病的防治极为困难5-6。病原菌通过分泌效应子来帮助其侵染植物，效应子在植物与病原菌的互作过程中起重要作用7。在细菌、真菌、卵菌中发现了多种不同的效应子，主要有 6 类，分别为细菌中的 TAL 8-9（transcription activator like）效应子；卵菌中的 RxLR 10（R：精氨酸；X：任意氨基酸；L：亮氨酸）效应子、CRN 11-12（crinkling and necrosis protein）效 应 子；真 菌 中 的 CFEM 13（common in several fungal extracelluar membrane）效应子、LysM 14-15（lysin motif）效应子和 LxAR16-18根肿菌侵染茎瘤芥不同时期效应子基因表达动态分析王香梅1，田芹2，廖静静2（1.重庆三峡学院，重庆 404000；2.长江师范学院，重庆 418000）摘要：效应子在病原菌侵染植物过程中扮演着重要角色，为明确效应子在根肿菌侵染茎瘤芥过程中的功能，首先通过 qRT-PCR 对效应子基因在侵染不同时期的表达量进行分析，从而对根肿菌中效应子进行分类鉴定，然后利用 TBtools 对效应子蛋白进行结构域分析，以期明确效应子所具备的功能。结果表明：根肿菌中的效应子包含 LxAR 类效应子 13 个、RxLR 类效应子 13个和其余未分类效应子 66 个；其中，LxAR 类效应子的表达量在根肿菌侵染茎瘤芥的 0 周和 5 周较高，说明其主要在休眠孢子阶段和孢子成熟阶段起作用；RxLR 类效应子中，RxLR1 类在根肿菌侵染茎瘤芥的 35 周表达量较高，主要在皮层侵染期起作用，RxLR2 类在根肿菌侵染茎瘤芥的 0 周表达量较高，主要在休眠孢子期起作用。由此推测，LxAR 和 RxLR 类效应子可能分别在促进生长发育和控制基因表达、抑制酶活等方面有功能。关键词：茎瘤芥；根肿病；芸薹根肿菌；效应子；基因表达中图分类号：S482.4文献标识码：A文章编号：1006-060X（2023）07-0001-10Dynamic Analysis on Effector Genes Expression of Plasmodiophora brassicae at Different Infection Stages in Tuber Mustard WANG Xiang-mei1,TIAN Qin2,LIAO Jing-jing2（1.Chongqing Three Gorges University,Chongqing 404000,PRC;2.Yangtze Normal University,Chongqing 418000,PRC）Abstract：As one of the main diseases of cruciferous crops,clubroot sharply reduces the yield of cruciferous crops and causes huge economic losses.Effector gene plays an important role for a pathogen infecting hosts.To clarify the function and role of effectors in the process of Plasmodiophora brassicae infecting tuber mustard(Brassica juncea var.tumida),the expression of different types of effector genes in different stages of infection was quantitatively analyzed by qRT-PCR;furthermore,according to the characteristic conserved sequence motifs and sequence alignment,the effectors were classified and identified;and Tbtools was used for functional analysis on domains of the effector proteins.The results showed that the effectors in Plasmodiophora brassicae were divided into 13 LxAR effectors,13 RxLR effectors and 66 unclassified effectors.The expression of LxAR effector genes was high in 0 and 5th week of the infecting process,indicating that these genes played a role in resting spore stage and spore maturation stage.Of RxLR effectors,RxLR1 expressed high in 3-5 weeks of the infecting process,mainly playing a role in cortex infection stage;RxLR2 expressed high in 0 week of the infecting process,mainly playing a role at resting spore stage.Thereforce,it is speculated that LxAR and RxLR effectors possibly function in promoting growth and development,controlling gene expression and inhibiting enzyme activity.Key words：tuber mustard(Brassica juncea var.tumida);clubroot disease;Plasmodiophora brassicae;effector;gene expression收稿日期：20230313基金项目：重庆市科学技术局面上项目（CSTB2022NSCQ-MSX0980）；重庆市高校创新研究群体资助计划（CXQT21029）；重庆市教委项目（KJZD-k202001401）作者简介：王香梅（1992），女，安徽阜南县人，硕士研究生，研究方向为植物保护。通信作者：廖静静湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）2023 年 7 月2-生物技术 遗传育种效应子。不同效应子的功能具有一定的差异相关性，效应子可以通过调控寄主植物的基因转录，影响寄主植物的抗病过程，如大豆疫霉效应子 PsCRN108可以通过直接靶向植物启动子抑制植物防御相关基因的转录，进而导致植物感病12。效应子还可以通过改变寄主植物的代谢途径，抑制植物的防卫反应，如大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）效应子 Pslsc1和大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）效应子 Vdlsc1均能减少植物细胞水杨酸（Salicylic acid，SA）的积累，从而导致寄主植物中由 SA 介导的防卫反应被抑制19。有些效应子通过抑制寄主 RNA 沉默，阻碍寄主防御反应，如小麦秆锈病病原菌 Puccinia graminis f.sp.Tritici（Pgt）分泌的 PgtSR1 效应子可通过改变 SiRNA 的丰度来抑制植物中的 RNA 沉默并阻碍植物防御20。相比于其他成熟的植物病原系统，根肿菌分泌蛋白组和效应子的相关研究才刚刚起步。2015 年，Schwelm 等21从根肿菌全基因组 9 730 个基因中预测到 553 个编码分泌蛋白的基因，筛选到候选效应子基因 92 个，目前尚未对这些效应子进行系统分类。2019年，Chen等22通过转录组数据及信号肽的预测，初步鉴定了 ZJ-1 菌株中 33 个根肿菌效应蛋白，利用烟草瞬时表达技术和原生质体瞬时表达技术对其进行效应蛋白筛选，结果发现根肿菌 PBRA2550 和PBRA9331 蛋白能够直接诱导烟草叶片的细胞死亡，其中效应蛋白 PBRA2550 还可以诱导大白菜下胚轴细胞死亡；其余 31 个效应蛋白中有 24 个效应蛋白对 BAX 诱发的细胞死亡反应具有抑制作用，28 个对 PBRA2550 诱发的细胞死亡反应也具有抑制作用。2021 年，Chen 等23通过酵母双杂交试验、谷胱甘肽 s-转移酶下拉试验和双分子荧光互补试验，发现根肿菌 RxLR 效应子 PBZF1 与 SnRK1.1 相互作用，SnRK1.1 可以促进植物对许多病原体的抗性，效应子 PBZF1 抑制 SnRK1.1 的生物学功能，促进根肿菌侵染植物。不同效应子在寄主植物中的作用方式存在一定的差异性，深入分析不同效应子的作用机制，有助于进一步认识其致病原理。该研究首先对根肿菌效应子进行分类，再对不同类别效应子在根肿菌侵染不同时期的表达进行定量分析，从而明确根肿菌侵染不同时期效应子基因的表达动态，探索效应子基因在根肿菌侵染茎瘤芥过程中的功能和作用，在此基础上分析病原体的致病因素，为茎瘤芥根肿病害的防控提供参考。1材料与方法1.1试验材料从涪陵田间采集茎瘤芥肿根样品于 20保存备用，该样品由蔬菜病虫害防治研究室提供。供试茎瘤芥品种为涪杂 2 号，市售。主要试剂有植物总 RNA 提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；5All-In-One RT Master Mix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）反转录试剂盒，EvaGreen2qPCR Mix-No Dye（ABM）实时荧光定量 PCR 试剂盒，购自上海爱必梦生物科技有限公司。1.2试验方法1.2.1茎瘤芥幼苗的培养涪杂 2 号种子用 50%漂白液处理 1 min，再用 70%酒精处理 1 min，无菌水洗涤 3 次，放入带湿润滤纸的培养皿中（滤纸片和培养皿要提前经过湿热灭菌），24避光催芽，待到种子露白后即可移苗。草炭土过 12 目筛后，和蛭石以 1 3 比例混匀，高压灭菌锅 121湿热灭菌 20 min，取出备用。育苗盆用 3%高锰酸钾消毒处理30 min，再用蒸馏水清洗 23 次。基质装入育苗盆，催芽后的种子移至基质中。1.2.2根肿菌休眠孢子的提取及接种将肿根样品从冰箱取出冲洗干净表面泥土，然后切成小块状放入组织捣碎机中，加入无菌去离子水（ddH2O）。用 8 层纱布过滤浆液后得到休眠孢子悬浮液，用 6 000 r/min高速离心机离心 5 min 后，收集含有休眠孢子的上清液，从上清液中取样 1 mL 稀释 10 倍后，用血球计数板计算休眠孢子浓度，然后用无菌去离子水调整休眠孢子悬浮液的孢子浓度为 1108个/mL24。待茎瘤芥幼苗长至 4 片真叶时，吸取 1 mL 休眠孢子液采用灌根法接种至幼苗根部，接种后幼苗置于24、16 h/8 h 光暗交替温室中培养。1.2.3取样及总 RNA 提取接种前取待接种的孢子作为 0 周的茎瘤芥幼苗样品。接下来 15 周取样，随机取 10 株茎瘤芥幼苗作为 1 个处理，每个处理重复 3 次。从子叶生长处剪下根系，用自来水清洗干净，将 3 次重复的样品分别用锡箔纸包裹液氮处理后-80保存待用。参照植物总 RNA 提取试剂盒说明书提取根肿菌休眠孢子总 RNA。测定 RNA 的浓度后，于 80保存或直接进行下一步骤处理。1.2.4反转录及qPCR使用5All-In-One RT Master Mix试剂盒进行反转录，具体操作参照说明书。对根肿菌中 92 个效应子基因采用 SYBR-Green 染料法进行定量 PCR，定量 PCR 部分引物详见表 1。qPCR 体系配置参照 EvaGreen2qPCR Mix-No Dye（ABM）实时荧光定量 PCR 试剂盒配制。定量体系正、反向引物各 0.5 L，按顺序加 3.5 L ddH2O，再加入 0.5 王香梅等：根肿菌侵染茎瘤芥不同时期效应子基因表达动态分析3-生物技术 遗传育种表 1该研究 qRT-PCR 部分引物 类 别基 因正向引物（5-3）反向引物（5-3）内 参PbActinGGGACATCACCGACTACCTGACTGCTCCGAGTTGGACATCLxAR1PBRA0733CGCACAACCTCATGTTCGACTGTCGTGGTCGAGCATGTCPBRA6988TACAACTCGTCGCGATCCATGGATCATCATGTCGATCGTGACGPBRA6871AGACGCAAAACTCGGACATGTGCACATCGATTTGCCAGTGPBRA9634ACACTGACAAACGCGATTGGAACGTGCACCCAAATCTGTGLxAR2PBRA7521ATCGGCGCCAAATTCACTTGAATAATGGTCAGAGGGCAGCTCPBRA6312ACTTCATGAACGCGCAGTACTACTTGGCGTGGTTGCAATCPBRA7575TCTTGTCCCAAAACGTACGCAGCTGATCGTAACGCTGAACPBRA5577ATCCTCGACGCTGACGAATACTGGGATACACCTGCACTGTTCPBRA1204TTGTCGATGCGCAAGGAAACGCAGCATTGTGGCAAAACACPBRA0190AAATGGCCATGTCACTGCTGTTGAGCGCTTCGTATTCCTCPBRA8630CGTTAACTCATCGTCGTTTCGGTTGTTCAAAACCGGGACCTGPBRA5027ACGACGTGCATTTCGTGTTGTCGAAAAAGTTGCGCACGACPBRA8088TGCAAATCGGCGGCAATAACAGCGTTCGTAGTTGGGTAAGAGRxLR1PBRA5609GGACCCTAATGCCCAGAAGTTGAACGACTGCTTGTTGCTPBRA5624ACTTCCGCACGTATCTCGACAACGCTTCACCAGGGTATTGPBRA0444ATTGCTGCTGTCGATGTACGGAAGCTTTGACCAGGACAGGPBRA5439GACACCTGACACACCATTGCATTTCCTTGACCGCTGCTTRxLR2PBRA8556ACATCGCCTTCGTCAACAGTCGCTTAACAGCAACTCAGCAPBRA7566ACGAACCCGTCCTTAGTCAGCGACAACCGCTACCTCTTCTPBRA0023CGAGAATGGAGGAGGACAAGCGGAAGAATCCACACCAAACPBRA3405AATGTGCTCTGGCTCGTTCTATCCACGCCTTCTCTTCGPBRA7977TCTTCTGCGTGTGCGTAGTCGCCGTTCTCACTGGACCTATPBRA7592TCTCTCTGCTTGGGAGAAGCAACGATGCTTTGGAAGATGCPBRA8439GATCTTCTCCCGTGTTGCAGGTTCACTATTGCGTGCGTTGPBRA2550GACTCGTGGGATTCGTCAAGCACCGTTCTTCTCGGACACPBRA6928ACTTGCTGGAATGGGTATCGGGCTTTGCTGATGAAGGAGAL cDNA，最后加入 5 L Mix。qPCR 反应程序为：95 1 min；95 15 s，60 15 s，72 20 s，40 个循环；95持续。1.2.5效应子基因表达及结构域分析从 NCBI 数据库中分别下载卵菌和真菌中的 5 类效应子的一条序列（表 2），以这些效应子序列或保守结构域25-26比对根肿菌 e3生理小种中的效应子序列，由此将根肿菌中的效应子基因进行分类。利用在线分析软件MEME5.4.1（https:/memesuite.org/meme/index.html）和 SMART（http:/smart.embl-heidelberg.de/）对效应子氨基酸序列中的保守基序（motif）和保守结构域进行分析，然后通过 TBtools 1.09854 程序包 Simple MAST Wrapper 进行可视化图的输出27。1.2.6数据分析及绘图基因表达数据采用 2-Ct进行分析，并在 Excel 中绘制表达柱形图。不同采样时间基因表达差异采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，采用单因素 ANOVA（LSD，P 0.05）分析差异显著性。基因表达数据采用在线软件 Omicshare（https:/ 2效应子类别及详细信息类 别结构特征LxAR保守基序 LxAR（Leu-x-Ala-Arg，x 为任意氨基酸）CRN信号肽后接高度保守的 FLAK 基序（Phe-Leu-Ala-Lys）RxLR信号肽后4090个氨基酸位置接RxLR保守基序（Arg-x-Leu-Arg）LysM含有溶菌素基序（Lysin motifs）CFEM含有 8 个半胱氨酸2结果与分析2.1根肿菌 e3菌株候选效应子基因分类根据不同类别效应子的特征保守基序，结合序列比对，明确根肿菌 e3生理小种中 92 个候选效应子可分为 2 类，其中 LxAR 类效应子 13 个，RxLR 效应子 13 个（表 3），其余未分类效应子 66 个。2.2根肿菌效应子在不同侵染时期的表达分析茎瘤芥幼苗接种根肿菌后 05 周，不同时期就表现出不同染病程度。总的来说，01 周肿根表型还无变化，处于休眠孢子、休眠孢子萌发阶段；24周根肿菌大量分化、繁殖，茎瘤芥的根部开始肿大，且在第 4 周时侧根明显肿大，处于根毛和皮层侵染阶段；待到第 5 周时，根部出现龟裂，大量根肿菌湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）2023 年 7 月4-生物技术 遗传育种表 3根肿菌效应子分类效应子类别鉴定依据含有的根肿菌效应子功 能LxAR 效应子拥有保守基序 LxAR（Leu-x-Ala-Arg，x为任意氨基酸）PBRA0190；PBRA1204；PBRA5027；PBRA6871；PBRA7521；PBRA8088；PBRA9634；PBRA0733；PBRA6312；PBRA5577；PBRA6988；PBRA7575；PBRA8630可导致毒性生理小种转为无毒生理小种RxLR 效应子拥有保守基序 RxLR（Arg-x-Leu-Arg，x为任意氨基酸）PBRA0444（PbBSMT）；PBRA2550；PBRA3405；PBRA5439；PBRA5609；PBRA6928；PBRA7566；PBRA7592；PBRA7977；PBRA8439；PBRA8556；PBRA0023；PBRA5624负责将效应蛋白转运到植物体内PBRA8088PBRA6988PBRA0733PBRA6871PBRA9634PBRA7521PBRA6312PBRA7575PBRA5577PBRA1204PBRA0190PBRA8630PBRA5027051234a1.510.50-0.5-1-1.5LxAR1LxAR2timebcacccab0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 012345PBRA6988相对表达水平相对表达水平相对表达水平相对表达水平 bacccbc0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 012345PBRA6871timeabbbbb0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 0W1W2W3W4W5WPBRA8630 0 1 2 3 4 5abbbbab0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 0W1W2W3W4W5WPBRA80880 1 2 3 4 5b取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）图 113 个 LxAR 效应子基因在侵染 05 周的表达分析（a：表达热图；b：个别基因的相对表达量；下同）被释放到土壤中，成为下一次的侵染源，处于孢子成熟阶段。2.2.1根肿菌 LxAR 效应子基因的表达分析通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR），以 PbActin 为内参，对根肿菌中 13 个 LxAR 类效应子在根肿菌侵染茎瘤芥 05 周间的表达量进行分析，结果如图 1a 所示，13 个效应子中有 4 个基因（LxAR1）在侵染 1周内的表达量最高，有 9 个基因（LxAR2）在侵染 0王香梅等：根肿菌侵染茎瘤芥不同时期效应子基因表达动态分析5-生物技术 遗传育种周和 5 周的表达量最高。这说明 LxAR1 类效应子是在根毛侵染时期起作用，LxAR2 类效应子在休眠孢子、休眠孢子成熟期起作用，而 LxAR 类效应子在中间时期低表达可能是避免引起寄主的防御反应。从LxAR1 类中选择 PBRA6988 和 PBRA6871、从 LxAR2类效应子中选择 PBRA8630 和 PBRA8088 基因分别进行验证，结果如图 1b 所示，与表达热图相一致。2.2.2根肿菌 RxLR 效应子基因的表达分析对根肿菌中 13 个 RxLR 类效应子在根肿菌侵染茎瘤芥 05 周间的表达量进行分析，结果如图 2a 所示，13 个效应子基因中，有 5 个基因（RxLR1），包括PBRA0444，在侵染 3、4、5 周表达量较高；有 8 个基因（RxLR2）在 0 周的表达量最高。这说明 RxLR1类效应子在皮层侵染期起作用，RxLR2 类效应子在休眠孢子期起作用，而 PBRA0444 基因能够甲基化寄主体内的水杨酸，降低寄主的防御能力，帮助根肿菌侵染。从 RxLR1 类效应子中选择 PBRA0444、PBRA5439，从 RxLR2 类效应子中选择 PBRA7977、PBRA8439 基因分别进行验证，结果如图 2b 所示，与表达热图一致。2.2.3根肿菌其他效应子基因的表达分析对根肿菌中 66 个未分类效应子在根肿菌侵染茎瘤芥 05 周相对表达水平相对表达水平相对表达水平相对表达水平PBRA8439PBRA7977PBRA5439aabbbcbcac0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 0W1W2W3W4W5WPBRA7977aabbbbb0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 0W1W2W3W4W5WPBRA8439bccbaaa0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 0W1W2W3W4W5WPBRA5439bcddcdabbc0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 0W1W2W3W4W5WPBRA0444PBRA5609 RxLR1012534PBRA5624PBRA0444PBRA8556PBRA7566PBRA0023PBRA3405PBRA7592PBRA2550PBRA6928RxLR20 1 2 3 4 50 1 2 3 4 50 1 2 3 4 50 1 2 3 4 5ab10-1取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）图 213 个 RxLR 效应子基因在侵染 05 周的表达分析湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）2023 年 7 月6-生物技术 遗传育种PBRA6676PBRA6634PBRA7419PBRA6649取样时间/wpi Sampling timeG1PBRA1477PBRA0030PBRA6681PBRA4539PBRA2061PBRA1436PBRA8221PBRA1988PBRA1430G2 2 3 4 0 1 510-1PBRA7823PBRA2230PBRA0043PBRA0634PBRA9391PBRA5666PBRA5941PBRA8942PBRA8941PBRA2462PBRA5498PBRA8608PBRA8176PBRA3510PBRA5421PBRA0499G3G4取样时间（周）图 3其他效应子在侵染 05 周的表达热图聚类分析的表达量进行分析，从中挑选 29 个进行表达热图聚类（图 3）。结果表明，29 个效应蛋白中有 8 个基因（G1）在侵染3、4、5周的表达量较高，有5个基因（G2）在侵染 0、1 和 5 周的表达量较高，有 8 个基因（G3）在侵染 0 周的表达量较高，有 8 个基因（G4）在侵染 1 周的表达量较高。这说明 G1 组效应子在皮层侵染期起作用，G2 组效应子在休眠孢子成熟期起作用，G3 组效应子在休眠孢子期起作用，G4 组效应子在根毛侵染期起作用。从各组效应子中选择 2 个基因进行验证（图 4），其结果与表达热图一致。2.3根肿菌 e3菌株中 LxAR 和 RxLR 类效应子结构域分析使用 TBtools 对根肿菌 e3菌株中的 LxAR 类和RxLR 类效应子进行结构域分析。由图 5 可知，不同的基因拥有不同的结构域。LxAR 类的 13 个蛋白中，PBRA5027 含有 PPP1R42 superfamily，该结构域与保守的信号蛋白磷酸酶-1（PP1）相互作用，从而增加PP1 的活性，对抗中心体分离；抑制 PPP1R42 的表达会增加细胞中心体数量，减少 PP1 的活性，导致NEK2 的激活（负责中心体连接蛋白磷酸化），促进中心体分离28。因此，PBRA5027 在侵染 15 周时表达显著低于 0 周，预测该基因的低表达可能与根肿菌游动孢子鞭毛形成和有丝分裂相关。PBRA6871和 PBRA9634 含有 AnK 类结构域，该结构域的重复序列参与介导蛋白间相互作用27；PBRA7521 含有PHA02875 superfamily，该结构域也属于 ANK 类结构域，即重复序列介导蛋白间相互作用。PBRA8088含有 LRR_8 superfamily 和 LRR_4 superfamily，即富亮氨酸的重复序列，通常涉及蛋白之间的相互作用29-30。PBRA8630 含 有 Fasciclin superfamily，fasciclin 结 构域含有 128 个氨基酸残基，广泛分布于植物体内的富含羟脯氨酸的糖蛋白，在植物生长发育和形态构建中发挥着重要作用31，但缺少病原菌中相应的功能研究。王香梅等：根肿菌侵染茎瘤芥不同时期效应子基因表达动态分析7-生物技术 遗传育种abbbababa0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 0W1W2W3W4W5WPBRA0030abbbbba0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 0W1W2W3W4W5WPBRA7823aabbababab0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 0W1W2W3W4W5WPBRA2230abbbbb0.00 0.50 1.00 1.50 0W1W2W3W4W5WPBRA14360 1 2 3 4 50 1 2 3 4 50 1 2 3 4 50 1 2 3 4 5aabbbbab0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 0W1W2W3W4W5WPBRA82210 1 2 3 4 5cdcddabbca0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 0W1W2W3W4W5WPBRA8941cddbcdabcaba0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 0W1W2W3W4W5WPBRA24620 1 2 3 4 50 1 2 3 4 5aabbbbab0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 0W1W2W3W4W5WPBRA66760 1 2 3 4 5取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）取样时间（周）相对表达水平相对表达水平相对表达水平相对表达水平相对表达水平相对表达水平相对表达水平相对表达水平图 4各组效应子在侵染 05 周的相对表达量分析由图 6可知，RxLR 类的 13个蛋白中，PBRA0444（PbBSMT）含有Methyltransf_7 superfamily，能甲基化水杨酸、茉莉酸等。研究表明，与野生型拟南芥相比，该基因超表达的拟南芥对根肿菌更敏感32-34。PBRA3405含有 BTB_POZ superfamily、AnK_2 superfamily 和ANKYR superfamily，其 中 BTB_POZ superfamily 家族可能具有介导蛋白 蛋白二聚体和多聚体形成的功能，可以改变染色质的结构，从而调节基因的开关35；ANK 类结构域可能参与介导蛋白间相互作用36。PBRA7977 和 PBRA8439 分 别 含 有 PHA02874 和 PHA03095 超家族保守结构域，均属于 Ankyrin-like蛋白，可能介导蛋白间的相互作用36。PBRA6928 含有 cupin_RmIC_like superfamily，该结构域的功能是影响蛋白的-淀粉酶抑制活性，且该功能具有湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）2023 年 7 月8-生物技术 遗传育种PBRA0190PBRA1204PBRA5027PBRA6871PBRA7521PBRA8088PBRA9634PBRA0733PBRA6312PBRA5577PBRA6988PBRA7575PBRA8630PPP1R42 superfamilyAnk_2 superfamilyANKYR superfamilyAnk_4 superfamilyPHA02875 superfamilyLRR_8 superfamilyLRR_4 superfamilypepsin_retropepsin_like superfamilyPRK10507 superfamilyFasciclin superfamily0 100 200 300 400 50035PBRA0444PBRA2550PBRA3405PBRA5439PBRA5609PBRA6928PBRA7566PBRA7592PBRA7977PBRA8439PBRA8556PBRA0023PBRA56240 100 200 300 400 50035Methyltransf_7 superfamilyAnk_2 superfamilyANKYR superfamilyBTB_POZ superfamilycupin_RmlC-like superfamilyPHA02874 superfamilyPHA03095 superfamilyPTZ00035 superfamily图 5LxAR 类效应子蛋白结构域分析图 6RxLR 类效应子蛋白结构域分析普遍性37。PBRA8556 含有 AnK_2 superfamily，该结构域介导蛋白间的相互作用36。PBRA0023 含有PTZ00035 superfamily，被定义为 Rad51 蛋白。据报道，在恶性疟原虫中，该蛋白可能在引起抗原变异的DNA重组过程中发挥核心作用38。而在根肿菌中，该蛋白是否也参与根肿菌的 DNA 重组过程需要进一步探索。还有 6 个基因可能由于是小分泌蛋白，蛋白的氨基酸序列较短，所以无明显结构域。3讨论近年来，随着根肿菌基因组的公布，越来越多的生理小种被测序，从中鉴定出了许多候选的效应子基因，一些效应子基因的功能也逐渐被揭示22-23,39，但大量效应子基因的功能仍需要深入研究。根肿菌侵染十字花作物根部主要包括 4 个阶段：孢子萌发、根毛侵染、皮层侵染和孢子成熟40。在侵染的过程王香梅等：根肿菌侵染茎瘤芥不同时期效应子基因表达动态分析9-生物技术 遗传育种中，不同的效应子基因会在不同的阶段发挥主要作用。因此，明确不同类别效应子的作用时期，对深入研究效应子基因的功能非常关键。该研究将根肿菌效应子进行了分类，筛选出了真菌 LxAR 类效应子、卵菌 RxLR 类效应子和其他未分类效应子。LxAR 类效应子首先是在稻瘟病菌无毒基因 AVR-Piz-t 和 AVR-Pii 中被报道16-18。AVR-Piz-t 可抑制由 BAX 介导的细胞死亡，且转该基因的水稻对稻瘟病菌抵抗力较弱。AVR-Pii 蛋白可攻击氧化还原中间体，抑制寄主水稻细胞氧爆发。韩艺娟等16通过生物信息学方法，从稻瘟病菌中鉴定出 99 个含有 LxAR 基序的分泌蛋白。张幸41则从稻瘟病菌基因组中发现 162 个 LxAR 类效应子，其中 14 个能够显著抑制 BAX 诱导的过敏性细胞坏死（Hypersensitive cell death，HCD），2 个效应蛋白能诱导烟草细胞死亡。这表明部分 LxAR 效应分子可能起到毒性功能从而抑制植物的防卫反应，而一些效应分子也可激活寄主防卫反应。该研究发现，LxAR类效应子在根肿菌侵染茎瘤芥 0 周、5 周时表达量较高，说明 LxAR 类效应子主要是在根肿菌休眠孢子期起作用，推测这些基因如果在侵染过程中高表达可能会被寄主中的抗病蛋白识别从而引起寄主植物的防御反应，因此才在休眠孢子期表达。通过对LxAR 类效应子结构域的分析，发现部分效应子可能在促进细胞生长和促进植株生长发育方面有一定功能，而在根肿菌侵染寄主过程中，LxAR 类效应子如何作用仍需进一步探索。卵菌 RxLR 效应子 N 端的信号肽和 RxLR motif的作用分别是将效应蛋白分泌到细胞外，然后转运到寄主细胞内，这些效应蛋白结合并改变多种宿主蛋白的稳定性、活性和亚细胞定位，包括蛋白酶、激酶、磷酸酶、转录因子、泛素连接酶、RNA结合蛋白、自噬相关蛋白和囊泡运输相关蛋白10。RxLR1 类效应子在根肿菌侵染茎瘤芥的 35 周表达量较高，说明该类效应子主要在皮层侵染和孢子成熟期起作用；RxLR2 类在根肿菌侵染茎瘤芥的 0 周和 5 周表达量较高，说明该类效应子主要在休眠孢子期和皮层侵染期起作用，推测该类效应子可能分泌一些蛋白，帮助侵染寄主细胞。RxLR1 中的PBRABSMT（PBRA0444）效应子在皮层侵染期的表达量较高，与前文的研究结果一致，且与茎瘤芥被侵染后水杨酸的变化趋势一致25。PBRABSMT 能甲基化水杨酸，使植物的防御反应减弱，从而有利于病原菌的侵染33。通过结构域分析，LxAR 和 RxLR 类效应子含有ANK 类锚蛋白重复结构域、LRXs 蛋白结构域等，推测 LxAR 和 RxLR 类效应子可能分别在促进生长发育和控制基因表达、抑制酶活等方面有功能。今后可深入研究这些具有结构域效应子的功能，为防治根肿病提供新途径。参考文献：1 刘义华，莫言玲，曾静，等.茎瘤芥特晚熟种质资源的鉴定与筛选 J