可捕集CO_%282%29的纳米碳酸酐酶粒子的高效制备及性能研究.pdf

化工学报 2023年 第74卷 第6期|,2023,74(6):2589-2598 CIESC Journal可捕集CO2的纳米碳酸酐酶粒子的高效制备及性能研究毛磊，刘冠章，袁航，张光亚（华侨大学化工学院，福建 厦门 361021）摘要：利用碳酸酐酶（CAs）捕集CO2更符合可持续发展的理念，但亟需降低其分离纯化的成本和增强在复杂环境的生存能力。以铁蛋白（Ferritin）为标签，经linker把CAs与之相连，在胞内表达形成微米级难溶活性聚集体，经低速离心实现酶高效分离，酶活回收率达84.8%，活性聚集体超声30 min后，50孵育50 d酶活基本不变，在pH=9.0的缓冲液中半衰期为150 d。难溶活性CAs聚集体可转变为可溶性纳米CAs，其活力提升10倍以上，80时半衰期为（21122）h。在15%（质量）离子液体 N1111 Gly（pH=11.64）中半衰期达（40.82.2）h，可用于后续离子液体和重组CAs联合吸收和再生CO2。静电作用是难溶活性CAs聚集体形成的重要原因之一。研究结果表明，CAs融合Ferritin后，既能极大简化制备过程，又能大幅提高稳定性，为酶法捕集CO2奠定了基础。关键词：二氧化碳捕集；铁蛋白；碳酸酐酶；寡聚化；生物催化；酶稳定性；离子液体中图分类号：Q 557+.9；O 643.3 文献标志码：A文章编号：0438-1157（2023）06-2589-10Efficient preparation of carbon anhydrase nanoparticles capable of capturing CO2 and their characteristicsMAO Lei,LIU Guanzhang,YUAN Hang,ZHANG Guangya(College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Xiamen 361021,Fujian,China)Abstract:The use of carbonic anhydrase(CAs)to capture CO2 is more in line with the concept of sustainable development,but it is urgent to reduce the cost of its separation and purification and enhance its survivability in complex environments.Herein,the ferritin with the capability of self-assembling and forming multimers was used as the tag,and the carbonic anhydrase(SazCA)from Sulfurihydrogenibium azorense was linked to the ferritin by a rigid linker.The intracellular difficultly soluble active aggregates were formed during gene expression,which facilitate the purification of SazCA and the activity recovery was as high as 84.8%.The recombinant CAs were obtained after 30 min of sonication of the active aggregates,which was incubated at 50 for 50 days without detectable activity lost,and the half-life in pH=9.0 buffer were 150 days.The difficultly soluble active aggregates can spontaneously re-solubilize and formed nano-scale CAs from the micron-scale CAs.The activity of the nano-scale CA was 10-fold higher than that of the micron-scale one.Encouragingly,they showed significantly improved thermal stability compared with wild-type CAs,with a half-life of(21122)h at 80.More importantly,they had a half-life of up to(40.82.2)h in the ionic liquid N1111Gly(pH=11.64)with the concentration of 15%(mass),which may have great potentials in the combined uptake and regeneration of CO2 by subsequent ionic liquids and DOI：10.11949/0438-1157.20230175收稿日期：2023-03-01 修回日期：2023-04-14通信作者：张光亚（1975），男，博士，教授，第一作者：毛磊（1998），男，硕士研究生，基金项目：福建省自然科学基金项目（2020J01079）引用本文：毛磊,刘冠章,袁航,张光亚.可捕集CO2的纳米碳酸酐酶粒子的高效制备及性能研究J.化工学报,2023,74(6):2589-2598Citation：MAO Lei,LIU Guanzhang,YUAN Hang,ZHANG Guangya.Efficient preparation of carbon anhydrase nanoparticles capable of capturing CO2 and their characteristicsJ.CIESC Journal,2023,74(6):2589-2598研究论文第74卷化 工 学 报CAs.Finally,the molecular mechanism of difficultly soluble reactive aggregate formation was explored and the electrostatic interaction was found to be one of the important factors.The results demonstrated that ferritin was a novel tag that both greatly simplifies the preparation process and substantially improves its stability,laying a solid foundation for industrial CO2 capture by CAs.Key words:CO2 capture;ferritin;carbonic anhydrase;oligomerization;biocatalysis;enzyme stability;ionic liquid引言众所周知，二氧化碳（CO2）是导致全球气候变暖的温室气体，过多CO2排放会造成温室效应，并带来一系列生态问题1。碳捕获、利用和封存（CCUS）是减少 CO2排放的有效方法2，其中碳捕获最为关键。CO2捕获有物理、化学和生物法3。物理法主要是吸附和逐层沉积4，化学法则利用离子液体或有机胺，与CO2反应生成氨基甲酸酯，或者利用酸碱中和反应来吸收CO25。但这些方法对环境不友好，这是由于在CO2解吸过程中需要高温（100200），且需要额外成本实现溶剂再生，同时吸收剂对设备的腐蚀和废弃物的处理也是一大难题3。因此，研究者们把目光放在了更温和的生物法。生物法是指通过生物（如微藻、大型海藻、蓝藻等6）及酶（碳酸酐酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶和甲醛脱氢酶等）固定或转化CO2 7。酶法固定CO2主要是利用碳酸酐酶（CAs，EC 4.2.1.1），CAs主要分为-,-,-,-,-,-,-,-8等类型，其序列相似度较低，能催化可逆水合/脱水反应，可将CO2转化为碳酸氢根离子，同时释放质子9-10。大量研究均证实了CAs捕获CO2的巨大潜力，并且已经开展了分离、纯化和表征新型 CAs 用于CO2捕获的研究11-12。然而，CAs在大规模应用方面仍面临巨大挑战。工业上吸收CO2需要利用碱性溶液，且解吸温度一般高于80。因此，这要求CAs具有优秀的稳定性。研究者利用定向进化、定点突变等技术能有效提高酶稳定性13，而通过引入寡聚化多肽使目标酶形成寡聚体14-15也有助于提高催化性能和稳定性，抵抗更剧烈的环境16。另一个限制CAs大规模应用的因素则是分离与制备。固定化 CAs虽然能提高稳定性和重复使用性17，但固定化载体较昂贵，过程复杂，固定化CAs捕获CO2效率仍有待提升18，且游离CAs制备困难的问题依然未能解决。近年来，研究者提出了细胞内固定化酶的新理念：通过蛋白质工程技术在目标酶内引入特定模块，使其在胞内自发形成纳米或微米级超分子结构，实现胞内无载体固定化，这样既形成了固定化酶又方便了后续分离19，还省去了固定化载体相关费用20-21。基于上述理念，本文选取了既能在细胞内自发形成无载体的固定化酶，又能使目标酶形成寡聚体的多功能标签铁蛋白（Ferritin）。作为主要的铁储存蛋白，Ferritin已被发现存在于大多数活细胞中，其生物相容性好，是由24个亚基组成的高度对称的纳米笼22-23，Ferritin可自发组装24，且具有pH响应的解聚和重组特性25。大多数Ferritin纳米笼在 80下孵育 10 min仍保持构象不变26，例如，源于大豆的Ferritin熔点（Tm）约为106，而人源 Ferritin 约为 8225。Ferritin 独特的纳米笼结构和生化特性非常符合 CO2捕集过程中的环境要求。本课题组在前期研究中利用Ferritin作为标签，实现了牛CAs（单体酶）的高效制备，其制备过程简单，效率高，成本低27；但该方法是否适用于多亚基的CAs仍不清楚，且牛CAs稳定性较差，不适用于CO2捕集过程。因此，本文把从嗜热菌Sulfurihydrogenibium azorense筛选得到的-CAs（SazCA目前已知催化速率最高的 CAs，稳定性较好且为二聚体）通过linker 与 Ferritin 融合，同时研究了离心力对重组CAs纯化效果的影响，考察了重组CAs的热稳定性和pH稳定性及其在可高效捕集CO2的离子液体（四甲基铵甘氨酸）中的稳定性。1 实验材料与方法1.1 材料对硝基苯酚乙酸酯(p-NPA)、对硝基苯酚（p-NP）、乙腈、Tris-HCl缓冲液、十二烷基硫酸钠，阿拉丁生物科技(上海，中国)；氨苄青霉素钠、异丙基-硫代半乳糖苷（IPTG），Solarbio；BCA蛋白定量试剂盒，上海炎熙生物科技有限公司；四甲基铵甘氨酸（N1111Gly），兰州物理化学研究所。所有化学试剂均为分析纯。第6期1.2 重组蛋白的设计与目的基因构建基于CAs和Ferritin N端和C端相对位置，将目标蛋白设计为 CAs+linker+Ferritin，见图 1(a)，其中CAs（PDB ID：4X5S）来 源 于 Sulfurihydrogenibium azorense，linker为刚性28，Ferritin序列来源于人类重链 Ferritin（PDB ID：2FHA），该 融 合 蛋 白 命 名 为SazCA-Ferritin。融合蛋白的编码基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成，经测序验证无误后由Nde 和Hind 克隆至pET-22b（+）后导入宿主大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）。1.3 重组CAs的表达、纯化与保存重组大肠杆菌在含100 g/L氨苄青霉素钠的LB培养基中，于37、200 r/min活化12 h后，按照体积比1 100（菌液 培养基）接种到TB培养基中扩大培养，培养条件与活化条件相同，当OD600值处于0.60.8之间时，加入 IPTG，在条件为 18、180 r/min下诱导培养20 h。收集菌体于缓冲液 Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.3）中冰浴超声破碎。破碎条件为：功率420 W，工作2 s，停顿4 s，超声时间2025 min。最佳离心力的确定：先测定细胞破碎液的酯酶活性（1.5节），然后将细胞破碎液均匀分装，分别于4，（10005000）g下离心10 min，取离心后的上清，再次测定酯酶活性。根据式(1)计算酶活回收率，选择酶活回收率最高的离心力。酶活回收率=()IU-IU0IU 100%（1）式中，IU为粗酶活力；IU0为离心后上清酶活力。经过 23 次低速离心后，蛋白纯度用 SDS-PAGE鉴定。纯化后的蛋白加少量 Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.3）缓冲液，放置在-80冰箱，待酶冻实后进行冷冻干燥。1.4 重组CAs浓度的测定采用 BCA（bicinchonininc acid）法测定蛋白浓度。配制不同浓度（02000 g/mL）的牛血清白蛋白（BSA）标准溶液。配制BCA工作液，包含A液和B液，其中A液 B液体积比为50 1。取100 l不同浓度梯度BSA加入2 ml工作液中，37反应30 min，立刻用分光光度计测定OD562值。以BSA浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。重组CAs蛋白浓度参照标准曲线制作方法测定，利用标准曲线计算CAs浓度。1.5 重组CAs酶活力的测定CAs 酯酶活性测定：配制含 10%乙腈的 Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.3）缓冲液，以此来配制不同浓度（10100 mol/L）的p-NP溶液，室温下测定OD348值。以p-NP的浓度为横坐标，OD348值为纵坐标，绘制标准曲线。将200 l酶溶液加入1780 l的Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 8.3）中，再加入 20 l的p-NPA，反应5 min，然后短暂离心1 min（4500g），测定348 nm处吸光度，空白对照组加入相应不含酶的缓冲溶液，依据OD348值和标准曲线计算产物的量。1个酶活力单位（IU）定义为每分钟生成1.0 mol p-NP所需的酶量，比活力定义为每毫克酶所含的酶活力单位（IU/mg）。CAs 水 合 CO2活 力 测 定：将 20 l 酶 溶 液（500 g/ml）加 入 2 ml 冰 冷 的 Tris-HCl 缓 冲 液（25 mmol/L，pH 8.3）中，再加入200 l 0.05%（质量）溴百里酚蓝，充分混匀后加入1 ml冰冷的饱和CO2溶液（取50 ml去离子水，冰浴下，以50 ml/min流速通入纯CO2气体至少30 min）的同时开始计时，直到溶液由蓝色变成黄色停止计时。根据Wilbur Anderson方法定义酶活性，按式(2)计算酶活力，比活力定义为1 mol酶所含的酶活力单位（WAU/mol）29。Wilbur Anderson单位(WAU)=t-t0t0（2）式中，t为空白对照反应时间；t0为加酶实验组反应时间。1.6 重组CAs酶学性质测定为了快速获取可溶性纳米 CAs，对难溶活性CAs 聚集体进行超声。称取 0.015 g 冻干酶，加入30 ml Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH=8.3），此时酶浓度为 500 g/ml，超声功率为 510 W，最开始超声时间为30 min，在30 min基础上依次累加15 min，直到酶活力下降或者不变。每次超声过后测定CAs水合CO2活力。CAs最适温度测定：按照-CAs酯酶活性测定其最适温度，缓冲液的 pH改为 7.5（降低 p-NPA自分解率），设置一系列的温度梯度（50、60、70、80、90），测定酶活力，以最高酶活力为100%。CAs热稳定性测定：将超声获取的可溶性纳米CAs 溶液，在 80条件下保温，间隔一定时间测定CAs水合CO2活力，作为CAs短期热稳定性。CAs长期热稳定性测定：对高浓度（浓度约为4 mg/L）微米CAs溶液超声30 min，形成既有微米CAs又有可溶2591第74卷化 工 学 报性纳米 CAs 的混合溶液；然后分装在 40、45、50 和55条件下保温，间隔一定时间测定CAs酯酶活性，以最高酶活力为 100%，并根据式(3)计算酶活力下降一半所需的时间（半衰期）。t1 2=0.693Kc,Kc=2.0303tlgE0E（3）式中，Kc为衰减常数；E0为初始酶活；E为t时残留酶活。pH稳定性测定：将CAs溶解在pH为8.5、9.0的Tris-HCl 缓冲液中（50 mmol/L），浓度约为 4 mg/L，超声30 min获取可溶性纳米CAs和难溶性微米CAs的混合溶液，在60条件下保温，间隔一定时间测定CAs酯酶活性，按照式(3)计算半衰期。可溶性纳米 CAs 捕集 CO2能力测定：在（241）和50，将0.01 g冻干酶分散在20 ml Tris-HCl缓冲液（400 mmol/L，pH 8.3）中，冰浴超声 3 h，以100 ml/min恒定流速向溶液中吹入CO2，反应5 min，每15 s用pH计测一次溶液的pH并记录。1.7 重组CAs形成聚集体的分子机制探究各取0.01 g蛋白冻干粉，分别放入20 ml，pH为8.0（50 mmol/L,Tris-HCl）、9.0（50 mmol/L,Tris-HCl）、11.0（50 mmol/L，Na2HPO4-NaOH）和 12.0（50 mmol/L，Na2HPO4-NaOH）的缓冲液中，以510 W超声功率超声，每隔一段时间测定溶液的OD600。1.8 重组 CAs 对 N1111 Gly 离子液体的耐受测定配制浓度为 1 mol/L 的N1111Gly。在 30 ml N1111Gly中加入0.015 g酶，冰浴超声10 min。然后把样品放置在60的恒温水浴锅中，每隔24 h测定酶活力（CAs水合 CO2活力），按照式(3)计算 CAs在1 mol/L N1111Gly中的半衰期。2 结果与讨论2.1 重组CAs的表达与纯化表达后的菌体经超声破碎，静置发现有白色沉淀，测定沉淀活力，发现具有较高CO2水合活力。这个现象表明形成了难溶活性CAs聚集体，可经离心实现酶分离。离心力的优化结果如图1(b)所示，除5000g离心力外，其他离心力作用下的酶活力回收率与 4500g 离心力下的回收率有显著差异（p0.01）。表明 4500g离心 10 min时即可达到最高酶活回收率（84.8%）。相较于之前的61.1%30（Ferritin介导的地衣多糖酶）和 78%27（Ferritin 介导的牛CAs），SazCA-Ferritin自发形成难溶活性CAs聚集体的酶活回收率显著提高，可能是SazCA作为二聚体，重组蛋白之间的相互作用力比单体更强，在相同的离心力作用下回收率更高。经过 23 轮低速离心后，SDS-PAGE 结果如图1(c)所示。在50 kDa有一条很明显的粗条带，其分子量与SazCA-Ferritin的理论分子量（51 kDa）接近，这说明添加了Ferritin标签后，重组蛋白可以自发形成难溶活性CAs聚集体，通过简单的低速离心可实现酶分离纯化。此外，目标酶产量也较高，达到800 mg/L。此方法简单易行，仪器设备要求低，极大降低了分离纯化成本，考虑到目标酶产量较高，该法可望大规模制备CAs，为其走向应用奠定基础。图1重组CAs的纯化与验证Fig.1Purification and verification of the recombinant CA第6期2.2 难溶活性CAs聚集体的自发复溶取适量冻干酶加入 Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.3）缓冲液中，室温孵育过程中发现，随着时间延长，上清CO2水合活力变得越来越强，推测重组酶形成的难溶活性酶聚集体具有自发复溶特性。为此测定了上清和沉淀的酶活力、蛋白浓度和比活力，结果如图2所示。随着时间的推移，上清酶活力占比越来越大，沉淀则相反，第8天上清酶活占比达到了90%图2(a)。与此同时，总酶活力随着时间越来越高，但总蛋白浓度几乎无变化。总酶活力上升可能由于上清酶活力显著增加，于是分别测定上清、沉淀的比活力，结果发现沉淀比活力大致稳定在120 WAU/mg左右，而上清的比活力则随着时间的推移逐渐上升，第4天达到了1300 WAU/mg，随后基本稳定在此活力范围图2(b)。上清比活力上升的原因可能是难溶活性CAs聚集体逐渐复溶，形成可溶性纳米CAs（2.5节），底物的传质障碍减小，催化活性得到提升。图2(c)进一步证明自发复溶现象的存在，在检测时间内，上清蛋白浓度逐渐上升，第8天上清约占总蛋白浓度的51%。由此可见，难溶活性CAs聚集体可自发复溶形成可溶性纳米CAs，使得 CAs催化活性进一步提升（一般所需时间在 4 d左右）。超声可加速自发复溶过程，进而获得可溶性纳米CAs。为此，对超声时间进行了优化，结果见图2(d)，随着超声时间的增加，酶活力越来越高，最后可达61000 WAU/mol（约为难溶活性CAs聚集体的10倍），与市售牛CAs结果接近（70000 WAU/mol27），说明超声可以破坏难溶活性 CAs聚集体分子间相互作用，加速其形成可溶性纳米CAs，也从侧面证明重组CAs聚集体结构较稳定，不易被外力破坏。2.3 可溶性纳米CAs酶学性质研究利用-CAs具有酯酶活性来测定其最适温度，结果如图3(a)所示。与野生酶相比，其最适温度变化不大，均为8031。由于测定酯酶活性的底物在高温下不稳定，故而以CO2水合能力来考察可溶性纳米CAs短期高温稳定性，结果表明，该酶在80表现出优秀的稳定性，见图3(b)。经计算，其半衰期为图2难溶活性CAs聚集体自发复溶和超声加速形成可溶性纳米CAsFig.2The difficultly soluble CAs aggregates spontaneously redissolved and transformed into soluble nano-CAS through ultrasound acceleration2593第74卷化 工 学 报(21122)h，与游离酶半衰期仅为3 h31相比，提高了约70倍，可见Ferritin能显著提高SazCA的热稳定。Kumari等32把融合了M（人类受体型酪氨酸蛋白磷酸酶C中长度为60个氨基酸的胞外结构域）和CBM 3（来自 Clostridium thermocellum 的纤维素结合模块）的 SazCA 固定在微晶纤维素珠表面，固定后的BMC-SazCA在90孵育24 h后保留了70%的原始活性。考虑到工业上应用 CAs 常常在 4055吸收CO2，测定了重组 CAs在此温度范围的长期热稳定性。由图4可以看出，在40和45孵育情况下，CAs酯酶活性先上升后下降再上升。40和45酶活力先上升归结于难溶活性CAs聚集体形成可溶性纳米CAs。50和55不同在于前期酶活力下降，可能是因为温度升高纳米CAs的稳定性下降。由此过程还可以看出，难溶活性CAs聚集体具有缓释能力，这赋予了整个CAs体系优秀的稳定性，55时其半衰期为（19625）d。Zhu等33研究结果显示，游离SazCA在50孵育下 12 h 相对酶活下降到 40%左右，固定化酶则是80%左右。Hsieh 等34研究显示，R5-SazCA 在 50孵育3 h后相对酶活下降到63%，R5-SazCA经过二氧化硅包封后，50孵育 3 h 后相对酶活为 73%。Kumari等32研究了固定化的 BMC-SazCA 长期稳定性，结果发现70孵育6周后酶活力只下降了不到10%。相比较之下，本文所得重组CAs长期热稳定性有望超过上述结果，该重组CAs（SazCA-Ferritin）优秀的热稳定性主要是因为：（1）SazCA本身具有良好的热稳定性；（2）难溶活性CAs聚集体对纳米CAs的缓释保护作用；（3）SazCA与Ferritin相连后，单个SazCA-Ferritin之间分子间作用力，相互聚集形成微米级的蛋白酶聚集体，使得每个酶分子都被Ferritin表面和相邻分子“限制”，从而降低了拥挤分子的熵（Entropy）35-37；（4）难溶活性CAs聚集体形成可溶性纳米CAs之后，其粒径显著下降（2.5节），底物更容易接近酶活性位点，有利于传质。CAs的pH稳定性对于捕集CO2也十分重要，工业上需要在碱性溶液中吸收CO2，对于酶促反应来说，pH主要影响酶活性区域38。本文考察了重组CAs在pH为8.5和9.0的稳定性，结果（图5）显示，孵育42 d后CAs仍保持80%的初始活性，经计算，纳米CAs在pH为8.5和9.0的半衰期分别为144和150 d，一般而言，CAs在碱性环境下活性保持更好33-34。2.4 可溶性纳米CAs吸收CO2实验为了评估 CAs的 CO2水合能力，依照 CAs催化CO2与水反应生成碳酸氢根，导致溶液pH下降的原理，以溴麝香草酚蓝水溶液为指示剂（在pH 8.3显示蓝色，pH 6.3显示黄色）来验证其催化活性，结果图3 重组CAs酶学性质Fig.3 Enzymatic properties of the recombinant CAs图4 重组CAs长期热稳定性Fig.4 Long-term thermal stability of the recombinant CA第6期如图6(a)所示。实验组在12 s时几乎完全变色，而空白组在 90 s才有明显变色，直到 120 s才完全变色。此外，分别测定了25和50下缓冲液吸收CO2过程中pH的变化，结果如图6(b)所示。25下，加入纳米CAs比空白对照组pH下降更明显，而CO2在50溶解度较低，在此温度下CAs的作用不明显39，但较空白组pH下降更快。2.5 重组 CAs 形成难溶活性 CAs 聚集体的机理探究取少量混合物通过结晶紫染色，光学显微镜下，其形态有杆状和椭球形，见图7(a)，大小约为1.5 m。同时对难溶活性CAs聚集体进行透射电镜观察，结果见图7(b)，其形态与光学显微镜观察结果类似，大小也比较接近，约为1 m。图7(c)显示可溶性纳米CAs形态为球形，大小约为20 nm，与Ferritin粒径理论值接近40。重组蛋白在大肠杆菌体内形成难溶聚集体的现象常有报道11-13。大肠杆菌细胞内环境接近中性，经计算，SazCA 单体、Ferritin 单体和 SazCA-Ferritin 单体在pH为7.0时净电荷分别为15.08、-2.69和-1.46（表1），实验过程还观察到，pH=7.0时，即使超声也很难使难溶活性CAs聚集体变为可溶性纳米CAs（超声处理103 min之后，酶活仅有大约100 WAU/mg），这意味着pH 7.0时该聚集体结构十分稳定，这与此时的净电荷较低有关（仅为-1.46）。因此，考虑表面电荷是聚集体形成的原因之一。为此，计算了它们在不同pH下的表面净电荷，结果如表1所示，随着pH升高，表面净电荷越来越高，电荷排斥力越来越大，重组蛋白形成聚集体需要克服的静电斥力也就越大41。因此，在接近中性的胞内环境中容易形成难溶活性CAs聚集体，而在胞外，pH越大时，活性聚集体越容易形成纳米级 CAs。如图 7(d)所示，pH 为8.0时，OD600下降到一半需要250 min，而pH为9.0时需25 min，而当pH升高到12.0时，则仅需1 min。可见，表面电荷相互作用力是影响聚集体结构稳定性的重要因素之一。除此之外，蛋白过量表达也容易形成聚集体42，大分子拥挤与蛋白质聚集体的形成也有关43-44。另有报道，蛋白质具有以可逆方式自我结合的能力，单体蛋白通过构象变化可逆聚合成低聚状态，低聚体进一步可逆形成淀粉样纤维蛋白，随着时间的推移，这些可逆寡聚体变成不可逆聚集体41,45。2.6 可溶性纳米CAs对 N1111 Gly 耐受研究CO2在水溶液中的溶解度低是吸收CO2的一个较大障碍，因此，有研究者利用离子液体来吸收CO2，其中甘氨酸形成的离子液体具有良好的CO2吸收能力46。但是其缺点在于 CO2再生过程相对困难47，为此，研究者开发出既具有氨基酸盐吸收CO2能图6重组CAs催化CO2水合Fig.6CO2 hydration catalyzed by recombinant CAs图5 重组CAs长期pH稳定性Fig.5 Long-term pH stability of recombinant CAs2595第74卷化 工 学 报力又能再生富集的CO2的离子液体，其中N1111Gly是一种有效吸收 CO2的离子液体48，但其再生的过程仍需在高温下进行，能耗较大。而CAs能催化碳酸氢根形成CO2，从而大幅提高再生效率，降低再生温度，进而为离子液体的实际应用打下基础。为此，本文配制浓度为1 mol/L的N1111Gly，相当于15%（质量）N1111Gly，在25时其pH约为11.64。加入一定量的可溶性纳米CAs，每隔一定时间测定水合能力，结果如图 8 所示。重组 CAs 对N1111Gly有一定的耐受能力，半衰期为（40.82.2）h。根据周兰娟49的研究，减压加热法 15%（质量）N1111Gly溶液在75下，4 h最佳再生效率为92.99%，第二次循环再生效率为88.89%，第三次可保持82.46%以上，常压加热法需要在150下进行，再生效率为78.16%。有研究指出，CAs可在 87使吸收 CO2的有机胺再生50，若可溶性纳米 CAs 能大幅降低N1111Gly再生温度，则具有较大的应用潜力。图7重组CAs形态学观察及溶解性研究Fig.7Morphological observation and solubility of recombinant CAs aggregates表1三种不同的单体在不同pH下的净表面电荷Table 1Net surface charges of three different monomers at different pHCategorySazCA-Ferritin monomerSazCA monomerFerritin monomerpH=7.0-1.4615.08-2.69pH=8.0-8.519.07-6.19pH=9.0-12.555.03-8.1pH=11.0-34.69-12.72-17.64图8 重组CAs在N1111Gly中的稳定性Fig.8 The stability of recombinant CAs in N1111G第6期3 结论Ferritin 和 CAs形成的融合蛋白在体内能形成无载体自固定化酶，通过低速离心实现CAs的分离，酶活回收率达到84.8%，此法操作简单，易放大，降低了分离纯化酶的设备与时间成本。静电作用力是聚集体形成的原因之一，这种聚集体有缓释可溶性纳米CAs能力，能抵抗更加严峻的环境，在50可保持50 d酶活力不变，在pH为9.0的缓冲液中半衰期为150 d，稳定性得到了极大提高。而可溶性CAs的酶活力则提高了10倍以上，且比野生酶具有更好的稳定性，在80时半衰期为211 h，在15%（质量）离子液体N1111Gly（pH 11.64）半衰期为40.8 h。本文建立了一种绿色、简便和成本低的CAs高效制备方法，使利用CAs捕集CO2具有更大可行性。后续研究将进一步探究CAs用于离子液体N1111Gly捕集和再生CO2的工艺参数，以期在此工艺过程中发挥更重要作用。参考文献1Zhang Y M,Zhu J Y,Hou J W,et al.Carbonic anhydrase membranes for carbon capture and storageJ.Journal of Membrane Science Letters,2022,2(2):100031.2Talekar S,Jo B H,Dordick J S,et al.Carbonic anhydrase for CO2 capture,conversion and utilizationJ.Current Opinion in Biotechnology,2022,74:230-240.3Effendi S S W,Ng I.The prospective and potential of carbonic anhydrase for carbon dioxide sequestration:a critical reviewJ.Process Biochemistry,2019,87:55-65.4Patel H A,Byun J,Yavuz C T.Carbon dioxide capture adsorbents:chemistry and methodsJ.ChemSusChem,2017,10(7):1303-1317.5Al-Mamoori A,Krishnamurthy A,Rownaghi A A,et al.Carbon capture and utilization updateJ.Energy Technology,2017,5(6):834-849.6Farrelly D J,Everard C D,Fagan C C,et al.Carbon sequestration and the role of biological carbon mitigation:a reviewJ.Renewable and Sustainable Energy Reviews,2013,21:712-727.7Pu X,Han Y J.Promotion of carbon dioxide biofixation through metabolic and enzyme engineeringJ.Catalysts,2022,12(4):399.8Yoshimoto M,Schweizer T,Rathlef M,et al.Immobilization of carbonic anhydrase in glass micropipettes and glass fiber filters for flow-through reactor applicationsJ.ACS Omega,2018,3(8):10391-10405.9Kanth B K,Lee J,Pack S P.Carbonic anhydrase:its biocatalytic mechanisms and 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