基于内质网应激PERK_eIF2α信号通路探讨温针灸足三里联合香砂六君子汤治疗脾胃气虚型功能性消化不良的作用.pdf

当代医药论丛 2023 年 第 21 卷 第 15 期中医中药1819 李春深主编.黄帝内经 M.天津：天津科学技术出版社,2017.10 王键主编.医说 M.北京：北京科学技术出版社，2019.11 （元）朱震亨撰；王英点评.丹溪心法 M.北京：中国医药科技出版社,2020.12 吴崑岚，薛雅红，郑雪平，等.丁义江教授治疗脾肾阳虚型便秘的经验 J.吉林中医药，2011，31(10):950-951.13 吴棹仙编著；房明东校订.吴棹仙医经精义M.成都：四川科学技术出版社,2013.14 （清）王士雄撰；陆芷青，刘时觉校点.王孟英医案 M.上海：上海科学技术出版社,1989.基于内质网应激PERK/eIF2信号通路探讨温针灸足三里联合香砂六君子汤治疗脾胃气虚型功能性消化不良的作用屈学斌1，廖文力1，卢允健2，黎灿文1，李霭燕1（1.广州市番禺区中医院，广东广州511400；2.广州市番禺区第五人民医院，广东广州511495）摘要 目的：通过观察温针灸足三里联合香砂六君子汤对大鼠 PERK/eIF2 信号通路的影响，探讨温针灸足三里联合香砂六君子汤对脾胃气虚型功能性消化不良的治疗作用。方法：选取 SPF 级 SD 大鼠 60 只，建立功能性消化不良大鼠模型；经验证模型后，随机分为正常组、模型组、西药组、中药组、温针灸组、联合组，每组 10 只。分别进行相应的干预后，测量大鼠的体重、胃排空率；HE 染色观察胃窦组织病理形态变化；免疫组化检测胃窦组织 PERK、p-eIF2 表达情况；Western blot 检测胃窦组织 PERK、p-eIF2、elF2 蛋白相对表达量。结果：在实验第 14 天、实验第 28 天，与正常组相比，模型组的体重均较小，差异有统计学意义（P 0.05）；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组和联合组的体重均较大，差异有统计学意义（P 0.05）；与中药组、温针灸组相比，西药组、联合组的体重均较大，差异有统计学意义（P 0.05）。与正常组相比，模型组的胃排空率较低，差异有统计学意义（P 0.05）；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组和联合组的胃排空率均较高，差异有统计学意义（P 0.05）；与西药组、中药组、温针灸组相比，联合组的胃排空率较高，差异有统计学意义（P 0.05）。与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织的 PERK、p-eIF2 着色显著降低；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组、联合组均表现为 PERK、p-eIF2着色显著增多。与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织的 PERK、p-eIF2 蛋白表达显著降低，eIF2 蛋白表达升高；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组、联合组均表现为 PERK、p-eIF2 蛋白表达显著升高，eIF2 蛋白表达降低，差异均具有统计学意义（P 0.05）。结论：温针灸足三里+香砂六君子汤可以有效治疗脾胃气虚型功能性消化不良可能与其调节内质网应激 PERK-eIF2-ATF4 信号通路的作用有关。关键词 内质网应激；PERK/eIF2 信号通路；足三里；香砂六君子汤；消化不良 中图分类号 R57 文献标识码 A 文章编号 2095-7629-（2023）15-0181-05功能性消化不良是临床上常见的消化系统疾病之一。此病的发病率较高。据统计，在世界范围内，功能性消化不良的发病率达到了 20.8%1。虽然功能性消化不良不会严重威胁患者的生命，但它会严重影响患者的生活质量2。有研究指出，功能性消化不良的病机主要是脾虚气滞，中医认为气机失调与胃肠动力紊乱密切相关，而健脾理气对增强胃动力有显著作用3。香砂六君子汤是健脾理气方中最有代表性的一种药方。大量临床观察证实，香砂六君子汤治疗功能性消化不良在缓解症状和降低复发率方面具有一定优势4-5。丁伯龙6的研究显示，香砂六君子汤可通过调控内质网应激信号通路 PERK/eIF2 来改善胃肠运动障碍，治疗脾气虚证。非药物治疗功能性消化不良，如艾灸治疗功能性消化不良的疗效显著，应用前景广阔，显示了中医治疗的独特优势7。温和的艾灸既能促进胃的运动，调节胃肠蠕动，又能改变神经细胞的可塑性，调节相关蛋白和细胞因子的表达；其起效机制较为复杂。相关研究表明，艾灸足三里在治疗功能性消化不良方面的临床疗效和安全性优于西医疗法，且在改善患者生活质量方面具有独特的优势8。吴阳阳等9发现，针灸“曲池”和“足三里”可以通过抑制氧化应激和内质网应激来缓解肠道疾病。已有大量研究显示，持续的内质网应激可通过 P-EIF2诱导 ATF4 的翻译过程，而 ATF4 可导致促凋亡基因CHOP 表达的升高，从而促使细胞死亡10。由此可见，PERK/EIF2 是细胞凋亡或由内质网应激产生自噬的共同途径11。因此，推测香砂六君子汤联合温针灸足三里治疗功能性消化不良的作用机制可能与内质网应激 PERK/eIF2 通路的调控有关。本研究以内质网应激的 PERK-eIF2 信号路径为切入点，以大鼠为模广州市番禺区科技计划项目:基于内质网应激PERK/eIF2信号通路探讨温针灸足三里联合香砂六君子汤治疗脾胃气虚型功能性消化不良的作用及机制（课题编号:2022-Z04-005）当代医药论丛 2023 年 第 21 卷 第 15 期中医中药182型，对大鼠脾胃气虚型功能性消化不良的调节机制和治疗作用进行了研究。1实验材料及主要试剂、耗材1.1大鼠模型建立及分组选取 SPF 级 SD 大鼠 60 只，在进行实验前，给予 3 d 适应性饲养，然后用随机数表法分为正常组、模型组、西药组、中药组、温针灸组、联合组，每组 10只。分别用苦味酸在各组实验大鼠的皮毛上进行标识。除了正常组实验鼠外，其余 5 组实验鼠根据改进的夹尾刺激法+不规则喂养+冷生理盐水灌胃法建立功能性消化不良大鼠模型，即将同组实验鼠放入同一笼中，用医用纱布将长柄金属钳端部进行 3 4 层紧密包裹，将包裹部分钳夹在实验鼠尾部后 1/3 段，强度以刺激实验鼠发出尖叫声或打斗为宜，每次刺激 30 min，每日早晚各 1 次；用冷生理盐水（2 mL）灌胃，每次早晚各 1 次；同时，建模期间单日禁食，并在双日内正常喂食。功能性消化不良大鼠建模成功的标准：实验大鼠毛发干枯发黄、大便溏泄、进食量和体重明显下降，情绪状态由开始时的烦躁不安转变为精神不振、活动度减弱，随机抽取 1 只大鼠进行解剖，未发现其肠胃组织出现器质性病变。具体分组：正常组：10 只 SPF级 SD 鼠；模型组：10 只功能性消化不良大鼠；西药组：10 只用多潘立酮药液进行灌胃治疗的功能性消化不良大鼠；中药组：10 只用香砂六君子汤药液进行灌胃治疗的功能性消化不良大鼠；温针灸组：10 只采用温针灸疗法进行治疗的功能性消化不良大鼠；联合组：10只联合应用温针灸+香砂六君子汤灌胃疗法进行治疗的功能性消化不良大鼠。温针灸组的治疗方法是：将大鼠的四肢固定在手术台木板上，用电推刀剔除其下肢后关节外侧（腓骨小头前下方 5 mm 处足三里穴区2 cm2 cm 的位置）的鼠毛。剃净后，先用华佗牌毫针直刺足三里穴，深度约为 5 mm，以实验大鼠能够耐受为度，然后用特制的香烟型艾条在距离足三里穴2.0 cm 处进行悬灸，每次温针灸 15 min，每日一次，连续治疗 28 d。联合组的治疗方法是：使用香砂六君子汤（1.5 mL）进行灌胃，每日早晚各一次；温针灸干预每日早上开展一次，连续治疗 28 d。1.2主要试剂于武汉博士德生物工程有限公司采购多聚甲醛溶液；二甲苯、石蜡、苏木素、伊红、中性树胶等购于上海国药集团化学试剂有限公司；一抗（PERK 单克隆一抗、p-eIF2 单克隆一抗）、二抗和 SDS-PAGE电泳液等购于碧云天生物技术研究所。2实验方法2.1测量大鼠的体重、胃排空率在开始建模当日、建模第 7 天、建模成功当日以及干预首日、第 7 天、第 14 天、第 21 天、第 28 天的早上 7 点用电子秤称量大鼠的体重。在末次灌胃干预后，实验大鼠均禁食 12 h（无需禁水），然后每只灌胃 2 mL 的半固体米糊（将 16 g 奶粉、8 g 淀粉、8 g 糖、10 g 羧甲基纤维素钠、2 g 活性炭、250 mL蒸馏水混合均匀，配制为黑色半固体糊状物，1 g/mL，放入冰箱冷藏，使用时先恢复室温）。灌胃 30 min 后，使用剂量为 0.2 0.3 mL/100 g 的 10%水合氯醛进行腹腔麻醉。麻醉起效后，将实验大鼠固定在操作台上，用酒精对腹部进行消毒，沿腹部正中线剖腹。找到胃部后，用缝合线结扎幽门、贲门，间断结扎线外侧。将胃部摘取下来。利用断头法处死大鼠，用电子天秤称量全胃重。将胃体剪开后，检测胃内容物；并用冷生理盐水冲洗干净，用滤纸擦干，观察胃黏膜的表面有无潮红、肿胀、溃疡、糜烂等病理变化，并用电子秤称量空胃重量。2.2大鼠胃窦组织组织形态的检测方法胃窦组织 HE 染色：（1）固定：用眼科剪剪取实验大鼠幽门上部的胃窦组织，置于含有 4%多聚甲醛溶液的刻度管中固定 24 h。（2）石蜡包埋：固定好胃窦组织后，进行酒精梯度脱水，依次放入二甲苯、中透明处理10 min。将其浸泡于已加热溶解的液体石蜡中，并于 60恒温箱中浸蜡 2 h。用石蜡包埋机包埋胃窦组织。（3）切片：将包埋的石蜡块切成 4 m 石蜡切片，在温水中展平，然后将其转移到载玻片上，烤干待用。（4）染色：对切片进行脱蜡、酒精水化处理，然后将载玻片浸泡到苏木素中染色 5 min，洗涤后再放入 0.5%伊红溶液中复染 2 min，用自来水冲洗后再进行脱水、烘干。在载玻片表面滴加中性树胶，加盖玻片，用光学显微镜观察胃窦组织黏膜、腺体、肌层、黏膜层等的变化情况。2.3免疫组化检测胃窦组织 PERK、p-eIF2 表达情况具体方法：（1）抗原修复：切片行常规脱蜡水化，加入柠檬酸缓冲液中浸泡并加热修复 5 min。（2）封闭：在切片上滴加 3%过氧化氢溶液，避光 10 min，再滴加山羊血清封闭，在室温下孵育 10 min。（3）滴加抗体：滴加一抗（PERK 单克隆一抗、p-eIF2 单克隆一抗），然后滴加二抗，在 37室温环境中孵育15 min。（4）显色复染：在切片上滴加 100 L 显色剂显色 3 5 min 后用蒸馏水冲洗，并置于陈旧苏木精溶液中浸泡 1 min 复染，最后按照酒精梯度法对切片进行脱水，用中性树胶封片。当代医药论丛 2023 年 第 21 卷 第 15 期中医中药1832.4Westernblot检测胃窦组织PERK、p-eIF2、elF2 蛋白相对表达量具体步骤：（1）提取胃窦组织总蛋白：取适量胃窦组织，称取其重量。按照 1 mg 胃窦组织添加 10 L RIPA 裂解液的比例在 EP 管中加入胃窦组织和裂解液，再添加 PMSF（RIPA 裂解液:PMSF=100:1）。用组织剪剪碎胃窦组织，并用超声波细胞破碎仪打碎组织，随后将组织放在冰上裂解 30 min，并进行低温离心处理，吸取上清液，即得胃窦组织总蛋白标本。（2）检测浓度：应用 Nanodrop 2000 分光光度计测量胃窦组织总蛋白质的浓度及其液体量。（3）SDS-PAGE 电泳：应用 8%SDS-PAGE 分离胶配制 PERK 分离胶，应 用 12%分 离 胶 配 制 p-eIF2、elF2、Tubulin 分离胶，匀速缓慢注入玻璃板间隙中。然后制作 5%PERK、p-eIF2、elF2、Tubulin 浓缩胶，于分离胶上方的玻璃板间隙缓慢注入浓缩胶。最后上样进行电泳操作。（4）转膜：应用湿转法对 PERK 蛋白进行转膜，应用半干转法对 p-eIF2、elF2、Tubulin 蛋白进行转膜。（5）封闭和杂交：取出 PVDF 膜，将其浸泡到 5%脱脂奶粉封闭液中，常温封闭 1 h。然后，加入相应的一抗工作液（PERK、p-eIF2、elF2为目的蛋白，Tubulin 为内参蛋白），4孵育 24 h。经 TBST 冲洗后，加入二抗，室温孵育 2 h，用 TBST 洗涤。（6）检测：应用 Odyssey 扫膜仪扫膜，通过 Odyssey 软件进行定量分析，检测条带的灰度值。3实验结果3.1实验大鼠体重在实验第 14 天、实验第 28 天，与正常组相比，模型组的体重均较小，差异有统计学意义（P 0.05）；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组和联合组的体重均较大，差异有统计学意义（P 0.05）；与中药组、温针灸组相比，西药组、联合组的体重均较大，差异有统计学意义（P 0.05）。见图 1。图中从左到右依次表示正常组、模型组、西药组、中药组、温针灸组、联合组大鼠的体重。图 1 大鼠实验不同天数的体重变化3.2实验大鼠的胃排空率根据下述公式计算胃排空率；胃排空率=1-（全胃重-空胃重）/所灌米糊重量 100%。与正常组相比，模型组的胃排空率较低，差异有统计学意义（P 0.05）；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组和联合组的胃排空率均较高，差异有统计学意义（P 0.05）；与西药组、中药组、温针灸组相比，联合组的胃排空率较高，差异有统计学意义（P 0.05）。见表 1。表 1 实验大鼠的胃排空率（%，sx）分组胃排空率显著性正常组6 1.7 1 5.9 5模型组4 0.0 2 7 0 1与正常组比,P=0.0 0 4西药组5 5.1 8 6.9 0与模型组比,P=0.0 2 1中药组5 3.3 3 4.2 5与模型组比,P=0.0 1 8温针灸组5 6.2 5 9.5 1与模型组比,P=0.0 1 1联合组6 3.8 6 4.6 7与模型组比,P=0.0 0 33.3胃窦组织形态学比较由图 2 可以看出，正常组和联合组的腺体排列规则，存在少量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞；模型组可观察到：少量嗜酸性粒细胞、大量淋巴细胞及中性粒细胞，腺体呈现不规则排列，其余则无明显异常；西药组、中药组和温针灸组可以观察到：腺体排列尚规则，可见少量淋巴细胞、中性粒细胞，以及个别嗜酸性粒细胞，炎性细胞浸润较模型组减轻。图 2 组织病理学染色图（2 0 0）3.4免疫组化检测胃窦组织 PERK、p-eIF2 表达情况通过免疫组化检测胃窦组织 PERK、p-eIF2 表达情况，如图 3 和图 4 所示：与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织的 PERK、p-eIF2 着色显著降低；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组、联合组均表现为 PERK、p-eIF2 着色显著增多。当代医药论丛 2023 年 第 21 卷 第 15 期中医中药184图 3 免疫组化检测胃窦组织 P E RK表达情况图 6 We s t e r n b l o t 检测大鼠胃窦组织 P E RK、p-e I F 2 蛋白相对表达量4结论本研究发现温针灸足三里+香砂六君子汤可以有效治疗脾胃气虚型功能性消化不良可能与其调节内质网应激 PERK-eIF2-ATF4 信号通路的作用有关。p-eIF2 可诱发 ATF4 的翻译过程，促凋亡基因 CHOP 通过 ATF4 可上调其表达水平，进而可导致细胞死亡。上述研究结论为针药治疗功能性消化不良提供了坚实的理论基础。图 4 免疫组化检测胃窦组织 p-e I F 2 表达情况3.5Westernblot检测胃窦组织PERK、p-eIF2、elF2 蛋白相对表达量由图 5 和图 6 可知，与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织的 PERK、p-eIF2 蛋白表达显著降低，eIF2 蛋白表达升高；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组、联合组均表现为 PERK、p-eIF2 蛋白表达显著升高，eIF2 蛋白表达降低，差异均具有统计学意义（*表示 P 0.05；*表示 P 0.001）。(A)正常组，(B)模型组，(C)西药组，(D)中药组，(E)温针灸组，(F)联合组。图 5 We s t e r n b l o t 检测大鼠胃窦组织 P E RK、p-e I F 2、e l F 2 蛋白相对表达量当代医药论丛 2023 年 第 21 卷 第 15 期中医中药185参考文献1 黄蜜，丁晓华，徐小艳，等.针灸推拿法治疗功能性消化不良的研究进展 J.中医临床研究,2018,10(21):89-92.2 刘红静,张云静,刘贺丽.祖国医学对功能性消化不良的认识及治疗概况 J.健康必读旬刊,2012(9):66-67.3 赵鹏.健脾理气方治疗脾虚气滞型痞满病及其对胃动力影响的临床研究 D.广州:广州中医药大学,2008.4 马继红.香砂六君子汤治疗功能性消化不良脾胃虚弱型临床观察 J.辽宁中医杂志,2014,41(1):2.5 张娇.健胃消食口服液联合香砂六君子汤治疗脾胃气虚型功能性消化不良的临床观察 J.中国中西医结合消化杂志,2015(4):4.6 丁伯龙.香砂六君子汤修复脾气虚证大鼠肠神经和肠神经-ICC 间信号转导通路的实验研究 D.大连:大连医科大学,2013.7 刘钺,胡卡明,郭耀光,等.温和灸治疗功能性消化不良脾气虚证疗效评价 J.四川中医,2011,29(11):3.8 王 淑 红,王 彦 梅.耳 穴 贴 压 联 合 揉 按 足 三 里 治疗 功 能 性 消 化 不 良 临 床 观 察 J.中 医 临 床 研究,2019,11(17):35-37.9 吴阳阳,刘明江,殷韶杰,等.针刺对溃疡性结肠炎大鼠氧化应激和内质网应激的影响 J.针刺研究,2020,45(1):7.10 连闻雨,杨春启,林毅,等.黄连碱通过线粒体损伤及内质网应激 PERK-ATF4-CHOP 通路导致 L02 细胞毒性 J.军事医学,2021,45(11):9.11 袁婷.PERK/eIF2 通路负调控内质网应激抵抗 COPD气道上皮细胞凋亡的机制研究 D.长沙:中南大学,2013.瓜蒌散合活络效灵丹加减治疗带状疱疹对患者疼痛的影响分析韦艳芹（连云港市赣榆区人民医院皮肤科，江苏连云港222100）摘要 目的：探讨带状疱疹患者采用瓜蒌散合活络效灵丹加减治疗的临床效果及对疼痛的影响。方法：选择2021 年 1 月至 2022 年 12 月连云港市赣榆区人民医院收治的带状疱疹患者 80 例作为研究对象，按照随机编号计算机抽选结果进行分组，其中对照组 40 例接受西药常规治疗，观察组 40 例在此基础上联用瓜蒌散合活络效灵丹加减治疗。记录并比较两组的止疱、完全结痂、皮损愈合用时、治疗前后的症状评分、疼痛评分及治疗期间的不良反应发生率。结果：（1）观察组的止疱、完全结痂及皮损愈合用时均显著短于对照组（P 0.05）。（2）治疗前，两组的红斑、水疱、作痒、发热评分比较无统计学差异（P 0.05）；治疗后，观察组的红斑、水疱、作痒、发热评分均显著低于对照组（P 0.05）。（3）治疗前，两组的视觉模拟评分法（VAS）评分比较无统计学差异（P 0.05）；治疗后 3 d、5 d、7 d 及 14 d，观察组的 VAS 评分均显著低于对照组（P 0.05）。（4）治疗期间，观察组的不良反应发生率为 5.00%，与对照组的 2.50%比较无统计学差异（P 0.05）。结论：临床治疗带状疱疹可采用瓜蒌散合活络效灵丹加减，相比单纯西药治疗效果更佳，能有效缓解患者的症状表现，促进皮损愈合，减轻疼痛程度，值得临床运用推广。关键词 瓜蒌散；活络效灵丹；带状疱疹；疼痛；不良反应 中图分类号 R275.9 文献标识码 A 文章编号 2095-7629-（2023）15-0185-04带状疱疹的临床发病率相对较高，其属于皮肤感染性疾病的一种，具有急性发病的特征。患者在感染水痘-带状疱疹病毒后会感到四肢无力，且长时间处于低烧状态，随着病程的增加，感染处皮肤会逐渐由烧灼感转变为疼痛感，且接触、按压均会加剧疼痛1。患处早期表现为局部红斑，后逐渐发展为丘疹及水疱样皮疹，且覆盖面积逐渐增加，并呈带状分布，给患者的生理、心理均会造成严重的影响。目前，临床常规干预方式虽然能够达到缓解带状疱疹症状的目的，但患者后遗神经痛的发生率相对较高，可对其整体康复质量造成影响2。近年来随着现代中医药学的发展，更多中药方剂被应用于临床治疗当中3。本次研究选择 2021 年 1 月至 2022 年 12 月连云港市赣榆区人民医院收治的带状疱疹患者 80 例为研究对象，探讨瓜蒌散合活络效灵丹加减治疗本病的临床效果及对患者疼痛的影响，现报道如下。1资料与方法1.1一般资料选择 2021 年 1 月至 2022 年 12 月连云港市赣榆区人民医院收治的带状疱疹患者 80 例作为研究对象。纳入标准：（1）确诊为带状疱疹，符合中国带状疱疹诊疗专家共识（2022 版）4中的相关诊断标准；（2）病程不超过 14 d；（3）同意参与研究，能够配合治疗。排除标准：（1）合并其他皮肤病；（2）对治疗用药或中药成分过敏；（3）合并精神疾病；（4）中途退出治疗。按照随机编号计算机抽选结果进行分组，其中对作者简介：韦艳芹（1980），女，汉族，江苏赣榆人，本科学历，主治中医师，研究方向：皮肤科常见病、多发病方面