纳米二氧化钛与磷互作对莱茵衣藻砷累积与生物转化的影响.pdf

纳米二氧化钛与磷互作对莱茵衣藻砷累积与生物转化的影响张鑫1,2，杨帆1，于子悦1,2，颜昌宙1*1.中国科学院城市环境研究所城市环境与健康重点实验室2.中国科学院大学摘要纳米材料因其较大的比表面积以及较强的反应活性，对砷（As）的环境行为具有一定的调控作用，而这可能对微藻 As 吸收代谢产生潜在的影响。以模式生物莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为研究对象，探究不同磷酸盐（PO43）浓度下，纳米二氧化钛（nano-TiO2）对莱茵衣藻中 As()累积和生物转化的影响。结果表明：暴露初期（第 1 天）nano-TiO2作为载体显著促进了 0.013、0.100 和 0.500mmol/LPO43处理组藻细胞对 As 的累积，但随着暴露时间的延长，nano-TiO2的载体效应呈下降趋势；暴露结束后（第 8 天），nano-TiO2添加组中，进入藻细胞的 As()除了还原成 As()及甲基化成二甲基砷外，还能进一步转化为一种可能为砷糖的未知化合物，且随着 PO43浓度的降低，藻细胞内这种砷糖所占比例逐渐增加，这可能会抑制 As()的外排；暴露结束后（第 8 天），培养基中主要检测到的 As 形态为 As()和 As()，1.0 和 0.5mmol/L 处理组还有少量二甲基砷。nano-TiO2的添加降低了培养基中 As()的浓度，尤其是 0.5 和 1.0mmol/LPO43处理组。研究结果表明，纳米材料与 PO43的互作可显著改变微藻 As 的累积与代谢过程。关键词莱茵衣藻；砷酸盐；磷酸盐；纳米二氧化钛；砷形态中图分类号：X173文章编号：1674-991X（2023）04-1404-11doi：10.12153/j.issn.1674-991X.20220728The interactive effects of titanium dioxide nanoparticles and phosphate on arsenicaccumulation and biotransformation in Chlamydomonas reinhardtiiZHANGXin1,2,YANGFan1,YUZiyue1,2,YANChangzhou1*1.KeyLaboratoryofUrbanEnvironmentandHealth,InstituteofUrbanEnvironment,ChineseAcademyofSciences2.UniversityofChineseAcademyofSciencesAbstractNanomaterialscanmodifytheenvironmentalbehaviorofarsenic(As)duetotheirlargespecificsurfaceareaandhighreactionactivity,whichmayaffecttheabsorptionandmetabolismofAsinmicroalgae.Inthisstudy,Chlamydomonas reinhardtii was used as model organism to investigate the influence of titanium dioxidenanoparticles(nano-TiO2)on As()accumulation and biotransformation in algal cells at different phosphateconcentrations.Theresultsshowedthatnano-TiO2significantlypromotedAsaccumulationinalgaecellsin0.013,0.100and0.500mmol/Lphosphategroupsatthebeginningofexposure(1d),butthecarriereffectofnano-TiO2decreasedwiththeextensionofexposuretime.After8daysofexposure,inthenano-TiO2additiongroups,As()inalgalcellswasnotonlyreducedtoAs()andmethylatedtodimethylarsenic,butalsofurthertransformedtoanunknownAscompound,possiblyarsenosugars.Andtheproportionofarsenosugarsinalgalcellsgraduallyincreasedwiththedecreaseofphosphateconcentration,whichmightinhibittheeffluxofAs().After8daysofexposure,As()andAs()werethemainAsspeciesintheculturemedium,andasmallamountofdimethylarsenicwasalsodetected.Theadditionofnano-TiO2decreasedtheproportionsofAs()intheculturemedium,especiallyin0.5and1.0mmol/Lphosphategroup.ThisstudyindicatedthattheinteractionbetweennanomaterialsandphosphatesignificantlyaffectedtheaccumulationandmetabolismofAsinmicroalgae,whichfacilitatestheapplicationofmicroalgaeinAsremediation.Key wordsChlamydomonas reinhardtii;arsenate;phosphate;nano-TiO2;Asspecies收稿日期：2022-07-19基金项目：国家自然科学基金项目（21906157）作者简介：张鑫（1997），女，硕士研究生，主要从事水环境与水生态研究，*责任作者：颜昌宙（1969），男，研究员，博士，主要从事污染物环境效应与生态风险研究，Vol.13，No.4环境工程技术学报第13卷，第4期Jul.，2023JournalofEnvironmentalEngineeringTechnology2023年7月张鑫，杨帆，于子悦，等.纳米二氧化钛与磷互作对莱茵衣藻砷累积与生物转化的影响 J.环境工程技术学报，2023，13（4）：1404-1414.ZHANGX,YANGF,YUZY,etal.TheinteractiveeffectsoftitaniumdioxidenanoparticlesandphosphateonarsenicaccumulationandbiotransformationinChlamydomonas reinhardtiiJ.JournalofEnvironmentalEngineeringTechnology，2023，13（4）：1404-1414.砷（As）是一种广泛存在于水、大气、土壤、岩石和生物体的有毒类金属，被世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构（IARC）定级为一类致癌物质。As 在天然水体中的浓度范围很大，从小于 0.5g/L到大于 5000g/L 不等，在地表富氧水体中主要以砷酸盐As()的形态存在1。越来越多的证据表明，即使是在较低的 As 暴露水平（10g/L）下也会对人体健康产生影响2。藻类修复是一种绿色、低成本、可持续的水环境污染原位生物修复方法。浮游藻类细胞壁具有较大的表面积与黏性，可提供多种官能团与 As 结合，使其可有效地吸附和富集 As 等离子3。李妍丽4研究了 5 种淡水绿藻对 As 污染水体的生物修复，发现 1.0107个/mL 藻细胞作用 24h后 As()（1mg/L）的去除率为 68.35%85.45%，该研究还指出微藻在 As()修复过程主要涉及细胞表面官能团，如羧基、氨基、羟基、磺酸基等。此外，微藻还能通过甲基化等途径对 As 进行代谢转化5，甲基化的 As 还可以继续转化成为毒性相对较低的有机砷，如砷糖和砷脂等6，因而微藻在水体 As 污染修复中具有很大的潜力。然而，自然水环境是一个非常复杂的体系，大部分 As 与环境中的各种颗粒物（纳米颗粒、腐殖酸等）共存。由于环境物质可能会通过与 As 竞争在微藻表面的结合位点7、影响细胞膜的渗透性8等方式改变 As 在藻-液界面的物理化学行为，进而调控 As 在藻细胞中的吸附、吸收与形态转化过程。因此，探究环境物质包括纳米颗粒对微藻 As 吸收转化的调控作用，对于系统了解微藻对As 的代谢机制及其生态修复功能，具有十分重要的理论价值和现实意义。纳米二氧化钛（nano-TiO2）因其独特的理化性质在水处理、造纸、纺织等行业中得到广泛应用。预计到 2025 年，nano-TiO2的年产量约为 250 万 t9，这将使其不可避免地暴露于水环境中。根据预测调查，地表水和废水中nano-TiO2浓度为15ng/L16g/L，高暴露情境下地表水中 nano-TiO2浓度可以达到mg/L 级别10-12。nano-TiO2因其较大的比表面积与吸附能力，能作为载体促进 As 在水生生物（鲤鱼13、大型蚤14、丰年虾15）中的摄入，并调控生物对 As 的排泄与利用。针对浮游藻类的研究也发现类似的现象，如 Luo 等5的研究表明，添加 nano-TiO2后铜绿 微 囊 藻（Microcystis aeruginosa）和 斜 生 栅 藻（Scenedesmus obliquus）对 As 的累积和甲基化作用显著增加。Yang 等16研究发现，nano-TiO2与 As()共暴露 24h 后，As 在拟微绿球藻（N.maritima）细胞碎屑组分中的分布显著增加，而在细胞器组分中的占比却显著降低，该研究认为细胞壁对纳米颗粒的拦截效应降低了 As 对微藻的毒性作用。但是，目前关于 nano-TiO2如何影响微藻 As 累积与生物利用方面的研究仍相对较少，尤其是 As 的代谢转化方面，相关调控机理的揭示仍比较零散，缺乏系统性，有待开展深入研究。笔者以模式生物莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）为研究对象，以 PO43为限制性条件，采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）和高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术（HPLC-ICP-MS）分析藻细胞中 As 的累积量以及培养基和藻细胞中As 形态，研究 nano-TiO2存在与否条件下，莱茵衣藻对 As()累积代谢差异，探究 nano-TiO2对莱茵衣藻 As()累积和生物转化的调控作用，以期为应用微藻修复 As 污染水体提供理论依据。1材料与方法 1.1材料与试剂研究用 nano-TiO2为锐钛矿晶型，其粒径小于25nm，纯度大于 99.7%，购于 Sigma-Aldrich 公司。将 nano-TiO2粉末分散于超纯水中，配制成 1g/L 的储备液，冰浴超声 30min 后于 4 避光保存。试验前，将储备液稀释至 2 和 20mg/L，冰浴超声 30min后待用。采用 Na3AsO412H2O(国药集团化学试剂有限公司)配制 1mmol/L 的 As()储备液，试验前稀释至 10mol/L。1.2藻种及培养条件莱茵衣藻购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，在 TAP 培养基（pH=7.0）中悬浮培养，培养温度为 25，光照强度为 2000lx，光暗比为 12h12h。藻种扩增及培养过程中均采用无菌操作。1.3nano-TiO2沉降动力学及对 As()的吸附采用紫外-可见光分光光度法监测 nano-TiO2在不同 PO43浓度 TAP 培养基中的动力沉降过程17：在 nano-TiO2浓度为 2 和 20mg/L 纳米混悬液冰浴超声后的 0、1、2、4、6、12、24、36、48h，吸取适量样品在 370.5nm 处测定样品吸光度，以吸光度的变化表征 nano-TiO2在不同 PO43浓度 TAP 培养基中的动力沉降过程。将 As()和冰浴超声分散后的 nano-TiO2添加到不同 PO43浓度的灭菌 TAP 培养基中，使培养基中 As()终浓度为 10mol/L，nano-TiO2终浓度为2 和 20mg/L，体系 pH 调至 7.0 后密闭置于恒温振荡培养箱（25、175r/min）中，于 0、1、2、4、6、12、第4期张鑫等：纳米二氧化钛与磷互作对莱茵衣藻砷累积与生物转化的影响140524、48h 取适量样品，12000g 离心 10min，稀释、过滤后，使用 ICP-MS 测定上清液中 As 浓度，通过其变化特征分析计算不同 PO43浓度下 nano-TiO2在TAP 培养基中对 As()的吸附。nano-TiO2在不同 PO43浓度 TAP 培养基中对As()的吸附率和吸附量计算公式如下：A=C0CeC0100%（1）B=(C0Ce)Vm（2）式中：A 为吸附率，%；B 为吸附量，g/mg；V 为溶液体积，L；C0为 As()初始浓度，g/L；Ce为吸附后As()浓度，g/L；m 为 nano-TiO2质量，mg。1.4莱茵衣藻试验设置分别设置了 1 个 As()浓度（10mol/L），3 个nano-TiO2浓度（0、2、20mg/L）和 4 个磷酸盐（PO43）浓度（0.013、0.1、0.5、1.0mmol/L）进行交叉试验（表 1）。PO43浓度梯度设置，主要参考 Zhang 等18的研究以及地表类水中 PO43浓度。通过高浓度的 PO43限制藻细胞对游离态 As()的吸收，比较莱茵衣藻对 nano-TiO2结合态 As()、游离态 As()吸收与代谢的差异。将预培养至对数生长期的莱茵衣藻在 4 下于 2500r/min 离心 15min，弃去上清液，用灭菌的无磷 TAP 培养基清洗 3 次，去除细胞表面吸附的PO43。将藻细胞重新分散于无磷 TAP 培养基中缺磷驯化 3d，以耗尽藻细胞内储存的 PO43，确保试验不受藻细胞内 PO43的干扰。将达到对数生长期的缺磷莱茵衣藻重悬于 200mL 灭菌 TAP 培养基中，接种初始 OD680为 0.06（藻细胞密度约为 1105个/mL）。各试验组设置 3 个重复，培养条件与预培养一致，每天手摇 3 次以保证气体交换以及 nano-TiO2颗粒与藻细胞充分接触。暴露周期为 8d，每天定时测定藻细胞生长密度，并于第 1、4、8 天收集一定量的藻液，测定不同处理条件下生长初期、对数生长期和静止期莱茵衣藻对 As 的累积，以及暴露结束时（第8 天）培养基和藻细胞中的 As 形态。1.5总 As 和 As 形态分析测定1.5.1藻体总 As 的测定取一定量藻液于 4000r/min、4 下离心 15min 后收集藻细胞，用适量磷酸盐缓冲液1mmol/LK2HPO4、0.5 mmol/L Ca(NO3)24H2O 和 5 mmol/LMES，pH 为 6.0和超纯水清洗 3 遍以去除莱茵衣藻细胞表面吸附的 As。藻细胞冷冻干燥至恒质量后，取 5mg 左右冻干藻样加入纯 HNO3-HF 混合液（二者比例为 51）共 1.2mL 于微波消解（程序为 600W、2 min；0 W、2 min；450 W、45 min），用 2%HNO3定容，经 0.22m水系过滤器过滤后，采用ICP-MS 测定样品中 As 浓度。1.5.2培养基与藻细胞中水溶性 As 形态的提取与测定莱茵衣藻暴露 8d 后取一定量的藻液离心，上清液经 0.22m 水系过滤器过滤后于80 保存，待测。藻细胞中 As 形态的提取参照文献 19-20 的方法：称取一定量冷冻干燥后的藻样，加入 2mL 超纯水为萃取剂，冰浴超声萃取 10min（100W、40Hz）后 4000r/min 离心 5min；重复提取 3 次，将离心的上清液合并后定容，提取液经 0.22m 水系过滤器过滤后于80 保存，待测。培养基和莱茵衣藻藻细胞中的 As 形态采用HPLC-ICP-MS 测定。将前置保护柱（11.2mm，1220m）与阴离子交换柱（HamiltonPRP-X100）串联，使 用 流 动 相 10 mmol/L(NH4)2HPO4，10 mmol/LNH4NO3，pH 为 6.25对各 As 形态进行分离，同时配置不同浓度的 As()、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）和 As()混合标准溶液对样品中 As 的形态与浓度进行鉴定与分析。检测条件：进样体积 50L，流速 1.0mL/min，运行时间 10min。1.6质量控制与数据统计分析在总 As 和 As 形态的测定过程中，以45Sc、72Ge和103Rh 为内标元素，以 As 的标准曲线进行定量。分析过程中每 10 个样品对 5.0 和 20.0g/LAs 标准样品进行回测，确保测试信号的稳定性和数据的准确性。总 As、As()、MMA、DMA 和 As()的检出限分别为 0.01、0.07、0.12、0.07 和 0.20g/L。使表 1 试验分组设计Table1Experimentalgroupdesign试验组别As()浓度/(mol/L)PO43浓度/(mmol/L)nano-TiO2浓度/(mg/L)P0.013T0100.0130P0.013T2100.0132P0.013T20100.01320P0.1T0100.10P0.1T2100.12P0.1T20100.120P0.5T0100.50P0.5T2100.52P0.5T20100.520P1.0T0101.00P1.0T2101.02P1.0T20101.0201406环境工程技术学报第13卷用紫菜标准品（GBW08521，中国国家标准材料研究中心）进行质量控制，总 As 提取回收率为 107.18%0.43%。采用 Origin2021b 软件对数据进行处理和作图，运用 SPSS22.0 软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析（one-wayANOVA）检验 PO43和 nano-TiO2共同作用下藻细胞密度、As 的累积和 As 形态的差异，差异显著性水平设置为 P0.05）；但随着 nano-TiO2浓度增至 20mg/L，P0.1T20和 P0.5T20处理组生长受到显著抑制图 3(b)、图 3(c)，其藻密度仅是无 nano-TiO2添加组的 81.96%和 74.27%。研究表明23,27，nano-TiO2团聚物会附着在藻细胞表面，这可能会减少被包裹的藻细胞所能获得的光和养分，从而抑制其生长。Chen 等23还发现 nano-TiO2在莱茵衣藻藻细胞表面的团聚作用呈现剂量效应，浓度越高团聚体数量越多。这也在一定程度上解释了本研究中nano-TiO2浓度与藻生长所受抑制之间的关系。而对 P0.013T20组而言，高浓度 nano-TiO2（20mg/L）与相对低 PO43浓度（0.013mmol/L）共同作用，使得莱茵衣藻在试验初期就停止了生长，因此图表中无P0.013T20试验组数据。但 P1.0T20处理组藻细胞的生图 2 nano-TiO2在 TAP 培养基中对 As()的吸附率及吸附量Fig.2AdsorptionrateandadsorptioncapacityofAs()ofnano-TiO2inTAPmedium1408环境工程技术学报第13卷长并未受到 nano-TiO2浓度升高的影响图 3(d)，这可能是因为充足的 PO43促进了藻细胞的生长，减轻nano-TiO2对藻细胞抑制作用。2.3nano-TiO2与 PO4 3互作对莱茵衣藻 As 累积效果的影响不同处理下莱茵衣藻细胞不同生长阶段对As 的累积如图 4 所示。由图 4 可知，暴露初期（第1 天），P0.013T0、P0.1T0处理组莱茵衣藻 As 累积量为分别为（40.346.68）和（50.212.94）g/g，显著高于P0.5T0和 P1.0T0处理组（12.890.98）和（21.615.56）g/g（P0.05）。经饥饿处理的微藻恢复到适宜生长的条件后，由于超补偿效应会显著增加对营养盐的吸收28，且砷酸盐与磷酸盐有着相同的内化机制，能通过多种磷酸盐转运蛋白进入藻体29，因此在0.013 和 0.1mmol/LPO43处理条件下，As()在与PO43的竞争转运系统中占优势，同时藻细胞倾向于合成更多的磷酸盐转运蛋白以减轻磷限制30-31，进而促进了 As 的累积。Wang 等32研究了不同 PO43浓度下杜氏盐藻对砷酸盐的累积动力学，亦发生类似的现象。而在第 4、8 天，P0.013T0、P0.1T0处理组 As的累积水平和变化规律与 P0.5T0和 P1.0T0处理组规律基本一致，这可能和微藻的超补偿作用随培养时间的延长而降低有一定的关系33。Nano-TiO2的加入显著促进了第 1 天 0.013、0.1 和 0.5mmol/LPO43处理条件下藻细胞对 As 的累积，且随着 nano-TiO2浓度的升高，藻细胞对 As 的累积量也随之增加。尤其是 0.013、0.1mmol/LPO43浓度下，P0.013T2处理组（99.6214.57）g/g的藻细胞As 累 积 量 是 P0.013T0处 理 组 （40.346.68）g/g的 246.95%，P0.1T2（105.707.58）g/g 和 P0.1T20（155.0113.93）g/g处理组的藻细胞 As 累积量分别是 P0.1T0处理组（50.212.94）g/g的 210.52%和 308.72%。nano-TiO2对 As 很强的吸附能力26，可作为载体促进藻细胞对 As 的累积。Luo 等34在研究 nano-TiO2对铜绿微囊藻和斜生栅藻 As 生物利用和转化的影响中也发现了类似的结果。与 PO43浓度为 0.013、0.1 和 0.5mmol/L 的处理组不同，1.0mmol/LPO43处理条件下 nano-TiO2的载体效应暴露初期较低，这可能是因为高浓度PO43(1.0mmol/L)条件下 nano-TiO2对 As 的吸附率较低（图 2）、载体效应不明显所致。同时，研究表明，As()、PO43与nano-TiO2在藻细胞表面有着相同的结合位点图 3 不同 PO43-及 nano-TiO2浓度下莱茵衣藻的藻密度变化Fig.3DensitychangesofChlamydomonas reinhardtiiunderdifferentconcentrationsofPO43andnano-TiO2第4期张鑫等：纳米二氧化钛与磷互作对莱茵衣藻砷累积与生物转化的影响1409（COOH 和NH2）35-38。高浓度的PO43（1.0mmol/L）在一定程度上抑制了 As()、nano-TiO2在莱茵衣藻上的吸附，进而降低了纳米的载体效应，从而导致藻细胞对 As 的累积量不高。对数生长期（暴露第 4 天），培养基中 PO43浓度为 0.013 和 0.1mmol/L 时，P0.013T2处理组藻细胞中As 累积量（22.213.72）g/g仅有第 1 天累积量的22.29%，P0.1T2处理组藻细胞中 As 累积量（26.023.95）g/g仅有第 1 天累积量的 24.62%。这可能是因为随着培养时间的延长，nano-TiO2的载体效应呈降低趋势。李金丽等39的研究表明，nano-TiO2在SM7 培养基中迅速团聚成大颗粒并发生沉降。本试验结果也表明，48h 后 2、20mg/Lnano-TiO2在培养基中的保持率分别仅有 29.60%57.76%和 9.65%13.53%，这将不利于 nano-TiO2颗粒携带 As 进入藻细胞。微藻因其较大的比表面积及较多的官能团，可以吸附、吸收水环境中的金属离子和纳米颗粒而被广泛应用于水处理中。从本试验的结果来看，在0.013、0.1mmol/LPO43浓度下，nano-TiO2持续暴露1d 均能有效促进藻细胞对 As 的吸收与吸附。其中，0.1mmol/LPO43条件下微藻能耐受更高浓度的nano-TiO2（20mg/L），且获得更高的累积量。但是，0.1mmol/LPO43显著高于自然环境下 PO43浓度，在去除 As 污染的同时可能会增加水体磷负荷。因此，在应用微藻和纳米材料处理 As 污染水体时，应合理设置 PO43浓度以及藻细胞、纳米材料和 As 作用时间，以获得最佳的 As 去除率。2.4nano-TiO2与 PO4 3互作对莱茵衣藻 As 生物转化的调控作用不同处理下莱茵衣藻细胞中各 As 形态占比如图 5 所示。由图 5 可知，培养 8d 后，P0.1T0、P0.5T0和 P1.0T0处理组藻细胞内检测到的水溶性 As 有As()、As()和 DMA，但是 P0.013T0处理组仅检测到 As()，这可能是因为缺磷条件下藻细胞膜的完整性水平降低40，As()还原生成的 As()更易排出藻细胞所致。Wang 等41研究了不同 PO43浓度下铜绿微囊藻对 As 的吸收和净化，也发现低磷条件下藻细胞中 As 的外排速率显著高于富磷条件。值得注意的是，添加 nano-TiO2后，PO43浓度为0.1、0.5 和 1.0 mmol/L 的 处 理 组 中 藻 细 胞 内 除注：不同字母代表同一时间点组间差异显著。图 4 不同处理下莱茵衣藻细胞不同生长阶段对 As 的累积Fig.4AsaccumulationinChlamydomonas reinhardtiicellsatdifferentgrowthstagesindifferenttreatments1410环境工程技术学报第13卷As()、As()和 DMA 外还检测到一种未知 As 形态(图 5)。根据张金羽等19,42的研究，该未知的As 形态是含氧砷糖的一种磷酸砷糖（phosphatearsenosugar）（图 6）。这表明 nano-TiO2的存在，使得 As()在莱茵衣藻细胞中的生物转化途径发生了转变。Miyashita 等43研究发现脂溶态砷化物磷脂酰砷糖的基本结构中包括甘油砷糖和磷酸砷糖，并指出砷糖可能是合成砷脂的前体化合物。Ender 等44认为砷糖能实现某些基本的细胞功能，比如结合到细胞膜结构中。纳米颗粒能够通过大量积累活性氧（ROS）、物理化学作用或酶活性调节破坏细胞磷脂双分子层结构45，导致磷脂降解，降低细胞膜的完整性、流动性和选择性。nano-TiO2与细胞膜相互作用可能会促进某些酶的表达（arsM 等46），进而促进莱茵衣藻砷糖的生物合成。而且在 nano-TiO2浓度相同时，随着 PO43浓度的降低，藻细胞内砷糖所占的比例逐渐增加(图 5)。Glabonjat 等47的研究也得到类似的结果，富磷条件导致 PicocystisML 菌株砷糖下调，反之上调。这在一定程度上印证了 nano-TiO2和磷限制处理可以促进藻细胞合成含氧砷糖等化合物来代替实现 PO43的功能这一推测。与 PO43浓度为 0.1、0.5 和 1.0mmol/L 的处理组不同，P0.013T2组藻细胞内仅检测到 As()和 As()，这可能是因为 nano-TiO2和缺磷共处理使莱茵衣藻生长受到抑制，无法进行无机 As 的甲基化。2.5nano-TiO2与 PO4 3互作对莱茵衣藻 As 外排的调控作用莱茵衣藻可以对 As()进行吸收、转化以及外排。经过 8d 的暴露，培养基中主要检测到的 As 形态为 As()和 As()，0.1 和 0.5mmol/LPO43处理组中还有少量 DMA（图 7）。Guo 等48的研究也发现铜绿微囊藻在磷有限和富磷条件下培养基中仅观察到 DMA 和无机砷。笔者认为这可能是因为 MMA只是作为 As()生物转化的中间体被迅速转化为DMA49，也说明 DMA 这种甲基砷形态在 As 的生物转化中的优势。PO43浓度对培养基中 As 的形态有很大影响。随着 PO43浓度从 0.013mmol/L 增至 1.0mmol/L，培养 8d 后单独的 PO43处理组培养基中 As()的浓度分别为（744.243.42）、（710.388.60）、（577.0413.95）、（33.563.30）g/L，分别占培养基中总 As 浓度的99.19%、96.66%、87.10%和 5.38%，呈显著下降趋势（图 7）。Zhang 等18在研究不同 PO43浓度下蓝藻对As 的氧化还原时也发现了同样的现象。由于 PO43与 As()的结构类似，在微藻对 As()的吸收与吸附过程中存在竞争效应。随着 PO43浓度降低，藻细胞对 As()的吸收增加18，进而促进了 As()的还原与外排。研究表明30，莱茵衣藻对 As()的耐受性（EC50为 132.2mg/L）50高于 As()（33.5mg/L）。因此，在 0.013 和 0.1mmol/LPO43浓度下，虽然培养基中 As()的浓度和占比显著提高，但是对莱茵衣图 5 不同处理下莱茵衣藻细胞中各 As 形态占比（第 8 天）Fig.5PercentageofAsspeciationinChlamydomonasreinhardtiicellsindifferenttreatments(Day8)图 6 不同形态 As 的 HPLC-ICP-MS 谱图Fig.6HPLC-ICP-MSspectraofAsspecies第4期张鑫等：纳米二氧化钛与磷互作对莱茵衣藻砷累积与生物转化的影响1411藻生长没有显著影响。与单独的 PO43处理组相比，nano-TiO2和 PO43共处理组培养基中 As()占比和浓度随着 nano-TiO2浓度的增加而降低，尤其是 0.5mmol/LPO43浓度 下，2 和 20 mg/L nano-TiO2添 加 组 培 养 基 中As()占比分别为 44.99%和 30.76%，显著低于PO43单独处理组（87.10%）。微藻能够将 As()在细胞内还原为As()并进行甲基化，Xue 等42研究利用 Synechocystissp.PCC6803 证明了 DMA 参与砷糖的生物合成。细胞内的 As 形态结果表明，nano-TiO2添加组砷糖为主要形态的 As，这可能是由于其暴露细胞内还原的 As()作为底物参与砷糖的生物合成，而不是简单的外排。此外，Chen 等51将斜生栅藻暴露在 2mg/L的 nC60 中，发现在各亚细胞组分中纳米颗粒在藻细胞壁（细胞碎屑中的一部分）中占比最高；Geitner 等52做了类似的研究，也观察到金纳米粒子主要分布于小球藻细胞壁组分中。这些研究结果均表明细胞壁是藻细胞阻挡纳米颗粒的主要屏障，进而抑制藻细胞对纳米结合态 As()的吸收、还原与外排。而且，细胞壁对纳米材料的拦截作用在一定程度上也可以解释以下现象，即相同PO43浓度下培养基中 As()占比随着 nano-TiO2浓度的增加而降低，因为 nano-TiO2对 As()的吸附随纳米颗粒浓度的增加而增加。3结论（1）莱茵衣藻生长受 PO43和 nano-TiO2共同影响，0.013mmol/L 的 PO43和 20mg/L 的 nano-TiO2均能显著抑制藻细胞的生长。（2）暴露初期（1d），nano-TiO2的添加显著促进了 PO43浓度为 0.013、0.1 和 0.5mmol/L 时藻细胞对 As 的累积，且随着 nano-TiO2浓度的升高，藻细胞对 As 的累积量也随之增加。但是随着培养时间的延长，nano-TiO2的载体效应逐渐降低。因此，在应用微藻和纳米材料处理含 As 废水时，应合理设置微藻、nano-TiO2和 As 作用时间以获得最佳的去除率。（3）当 nano-TiO2存在时，进入藻细胞的 As()除了还原成 As()并甲基化生成 DMA 外，还能转化为结构更复杂、毒性更低的砷糖；且随着 PO43浓度的降低，藻细胞内砷糖所占的比例逐渐增加，这可能会抑制 As()的外排。此外，nano-TiO2对 As()的吸附作用以及藻细胞壁对 nano-TiO2的拦截作用也可能会抑制微藻对 As()的吸收，进而降低培养基中 As()的浓度。（4）研究表明，纳米颗粒改变了 As()在莱茵衣藻藻细胞中的生物转化途径，但 nano-TiO2介导下微藻 As 吸收转化的分子机制还需要进一步研究。参考文献王振红,李金丽,严雅萌,等.纳米二氧化钛对三价砷在大型蚤体内累积与毒性的影响J.环境科学研究，2018，31（6）：1123-1128.WANGZH,LIJL,YANYM,etal.Influenceofnano-TiO2onaccumulation and toxicity of arsenite in Daphnia magnaJ.ResearchofEnvironmentalSciences，2018，31（6）：1123-1128.1曾晨,郭少娟,杨立新.汞、镉、铅、砷单一和混合暴露的毒性效应及机理研究进展J.环境工程技术学报，2018，8（2）：221-230.ZENGC,GUOSJ,YANGLX.Toxiceffectsandmechanismsofexposuretosingleandmixtureofmercury,cadmium,leadandarsenicJ.Journal of Environmental Engineering Technology，2018，8（2）：221-230.2张道勇,赵勇胜,潘响亮.胞外聚合物(EPS)在藻菌生物膜去除污水中Cd的作用J.环境科学研究，2004，17（5）：52-55.ZHANG D Y,ZHAO Y S,PAN X L.The role of EPS inremoving cadmium in sewage by algae-bacteria biofilmJ.ResearchofEnvironmentalSciences，2004，17（5）：52-55.3李妍丽.微型绿藻对砷污染水体的生物修复研究D.广州:华南理工大学,2012.4LUO Z X,WANG Z H,YAN Y M,et al.Titanium dioxidenanoparticles enhance inorganic arsenic bioavailability andmethylation in two freshwater algae speciesJ.EnvironmentalPollution，2018，238：631-637.5JIANG Y,PURCHASE D,JONES H,et al.Technical note:effects of arsenate(As5+)on growth and production ofglutathione(GSH)and phytochelatins(PCS)in ChlorellavulgarisJ.International Journal of Phytoremediation，2011，13（8）：834-844.6图 7 不同处理下培养基中各 As 形态占比（第 8 天）Fig.7PercentageofAsspeciesinculturemediumofdifferenttreatments(Day8)1412环境工程技术学报第13卷ZHANGJY,NIYY,DINGTD,etal.Theroleofhumicacidinthe toxicity of arsenite to the diatom Navicula spJ.Environmental Science and Pollution Research International，2014，21（6）：4366-4375.7NAVARRO E,BAUN A,BE