白芍总苷对系统性红斑狼疮CD4_T细胞ITGAL基因表达和启动子甲基化修饰的影响.pdf

中南大学学报（医学版）J Cent South Univ(Med Sci)2012,37(5)htt p:/www.csumed.org;htt p:/463白芍总苷对系统性红斑狼疮 CD4+T 细胞 ITGAL 基因表达和启动子甲基化修饰的影响赵明，梁功平，罗双艳，陆前进(中南大学湘雅二医院皮肤科，医学表观基因组学湖南省重点实验室，长沙 410011)摘要 目的：探讨白芍总苷(total glucosides of peony,TGP)对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血 CD4+T 细胞甲基化敏感基因 ITGAL(CD11a)表达及启动子甲基化修饰的影响。方法：利用磁珠分选获得外周血 CD4+T 细胞，用不同浓度 TGP(0，62.5，312.5 和 1562.5 mg/L)处理 SLE 患者 CD4+T 细胞，48 h 后收集细胞。MTT 法检测处理后 CD4+T细胞的活力。定量 PCR 检测 ITGAL 基因 mRNA 表达水平。流式细胞术检测 CD4+T 细胞表面 CD11a 分子表达水平。亚硫酸盐测序法分析 ITGAL 基因启动子甲基化水平。结果：TGP 处理 48 h 后，各浓度组 CD4+T 细胞活力无明显差异。与对照组相比，高浓度组(1562.5 mg/L)ITGAL 基因 mRNA 表达水平显著降低(P0.01)，CD4+T 细胞表面 CD11a表达水平亦显著降低(P0.01)。进一步 DNA 甲基化水平检测显示高浓度 TGP 处理组 ITGAL 基因启动子甲基化水平较对照组显著升高(P0.05).Compared with control,the mRNA and protein levels of ITGAL were down-regulated signifi cantly in SLE CD4+T cells treated with TGP(1562.5 mg/L)(P 0.01).Furthermore,the extent of DNA methylation of ITGAL promoter was increased in TGP(1562.5 mg/L)treated CD4+T cells compared with control group(P0.01).Conclusion:TGP can repress CD11a gene expression through enhancing DNA methylation of ITGAL promoter in CD4+T cells from patients with SLE.Th is observation represents a preliminay step in understanding the mechanism of TGP in SLE therapy.KEY WORDS total glucosides of peony;systemic lupus erythematosus;CD4+T cells;ITGAL;DNA methylation白芍总苷对系统性红斑狼疮 CD4+T 细胞 ITGAL 基因表达和启动子甲基化修饰的影响 赵明，等465SYBR Green 定量 PCR 检测试剂盒购自日本 Takara公司。FITC 标记的人 CD11a 抗体购自美国 BD 公司。基因组 DNA 抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。亚硫酸盐处理试剂盒(EpiTect bisulfite kit)购自美国 Qiagen 公司。Taq 聚合酶、DNA 回收试剂盒及 pGEM-T 载体均购自美国 Promega 公司。1.2 CD4+T 细胞分离抽取 SLE 患者外周血 60 mL，加入肝素抗凝。首先利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞；然后利用 CD4 抗体标记磁珠分离 CD4+T 细胞。分离后的 CD4+T 淋巴细胞在含 10%胎牛血清人 T 淋巴细胞培养基中培养。TGP 溶解于 PBS 中加入培养基。分别用不同浓度的 TGP(0，62.5，312.5，1562.5 mg/L)处理 SLE 患者 CD4+T 细胞 48 h。1.3 MTT 法检测细胞存活率TGP 处理 48 h 后，每孔加入 5 g/L MTT 溶液10 L，于 37孵育 4 h。弃去上清，每孔加 200 L DMSO，由 Biorad 自动酶标仪在 570 nm 处测定OD570 nm。根据公式计算细胞存活率：细胞存活率=(A药物处理组A背景)/(A空白组 A背景)100%1.4 RNA 抽提和实时定量 PCR收集 TGP 处理 48 h 的 SLE 患者 CD4+T 细胞，离心去除培养基，用 PBS 洗 2 遍，采用 RNA 抽提试剂盒 RNeasy mini kit 抽提总 RNA。进一步采用反转录试剂盒反转录 RNA 生成单链 cDNA。最后采 用 SYBR Green 定 量 PCR 试 剂 盒 检 测 ITGAL基 因 的 mRNA 表 达 水 平。实 时 定 量 PCR 仪 为Rotergen 3000。-actin 基因表达量作为定量 PCR 的内参。基因表达变化倍数采用 2-Ct计算。计算公式如下：Ct=Ct目的基因Ct内参；Ct=Ct实验组Ct对照组。定量 PCR 所用引物如下：ITGAL 上游5-TGAGAGCAGGCTA TTTGGGTTAC-3，下 游5-CGGCCCATGTGCTGGTAT-3；-actin 上游 5-CGCG AGAAGATGACCCAGAT-3，下 游5-GCACTGTGTTG GCGTACAGG-3。1.5 流式细胞检测收集 TGP 处理 48 h 的 SLE 患者 CD4+T 细胞，离心去除培养基，用 PBS 洗 2 遍，用预冷的 PBS 重悬 CD4+T 细胞达到 1105/mL，加入 FITC 标记的人 CD11a 抗体，孵育 20 min，用 PBS 洗涤 3 遍，重悬后使用流式细胞仪 FACScalibur 检测。CellQuest用于数据分析。1.6 基因组 DNA 抽提与亚硫酸盐测序收集 TGP 处理 48 h 的 SLE 患者 CD4+T 细胞，离心去除培养基，用 PBS 洗 2 遍，按 DNA 抽提试剂盒说明书提取基因组 DNA。根据 EpiTect bisulfite kit 说明书处理基因组 2 g 基因组 DNA。利用巢式PCR 扩增 ITGAL 基因启动子区 CG 富集区 DNA 序列 310 bp(1289 979)。PCR 产物克隆到 pGEM-T载体，转化感受态细菌，每个样本挑取 10 个克隆测序。根据测序结果分析每个 CG 位点的甲基化水平。巢式 PCR 引物如下：外引物(上游)5-GGTGAATTCTTTAAGGTTAGGAGTTTAAGTTTAG TT-3，外引物(下游)5-CAATCTAGAACTACACATTTATTAAAAATTAAATT A-3；内引物(上游)5-GTTGAATTCGGTTAATATGGTGAAATTTTATTTTTA T-3，内引物(下游)5-CACTCTAGATACAACAAACATCCAAAAATTAAAAATA-3。1.7 统计学处理实验数据显示为均数 标准差(xs)。数据分析采用单因素方差分析和 t 检验。所有分析使用 SPSS 13.0 软件完成。P 0.05，表 1)。表 1 不同浓度 TGP 对 SLE 患者 CD4+T 细胞活力的影响(n=3，xs，%)Table 1 Effect of TGP with different concentrations on the viability of CD4+T cells from SLE patients(n=3，xs,%)Groups Cell viabilityControl100.00 5.3262.5 mg/L 99.12 6.13#312.5 mg/L 97.09 8.06#1562.5 mg/L 94.37 7.74#与对照组比较，#P 0.05。2.2 不 同 浓 度 TGP 对 SLE 患 者 CD4+T 细 胞 中ITGAL 基因 mRNA 水平的影响高浓度组(1562.5 mg/L)ITGAL 基因表达显著降低(P0.05，图 1)。中南大学学报(医学版),2012,37(5)htt p:/www.csumed.org;htt p:/466图 1 不 同 浓 度 TGP 对 SLE 患 者 外 周 血 CD4+T 细 胞 中ITGAL 基因 mRNA 表达水平的影响(n=3,xs)。与对照组比较，*P0.01。Figure 1 Effect of TGP with different concentrations on ITGAL mRNA expression in CD4+T cells from patients with SLE(n=3,xs).*P 0.01 vs the control group.图 2 不同浓度 TGP 对 SLE 患者外周血 CD4+T 细胞表面 CD11a 抗原表达水平的影响。A：对照(0 mg/L)；B：62.5 mg/L；C：312.5 mg/L；D：1562.5 mg/L；E：CD11a 表达阳性 CD4+T 细胞百分比(n=3，xs)。与对照组比较，*P 0.01。Figure 2 Effect of TGP with different concentrations on CD11a expression in CD4+T cells from patients with SLE.A:Control(0 mg/L);B:62.5 mg/L;C:312.5 mg/L;D:1562.5 mg/L;E:Percentage of CD11a+CD4+T cells(n=3,xs).*P 0.01 vs the control group.2.3 不同浓度 TGP 对 SLE 患者 CD4+T 细胞表面CD11a 抗原分子表达的影响收集不同浓度 TGP 处理的 SLE CD4+T 细胞，利用流式细胞仪检测 ITGAL 基因编码蛋白 T 细胞表面抗原 CD11a 水平。与对照组相比，CD11a 蛋白水平呈浓度依赖性降低，其中高浓度组 CD11a蛋白水平降低最显著(P0.01，图 2)。2.4 不 同 浓 度 TGP 对 SLE 患 者 CD4+T 细 胞ITGAL 基因启动子甲基化水平的影响利 用 亚 硫 酸 盐 测 序 方 法 检 测 TGP(1562.5 mg/L)处理组和对照组 CD4+T 细胞中 ITGAL 基因启动子甲基化水平。ITGAL 基因启动子区 7 个 CG位点甲基化水平均明显升高。统计学分析显示：与对照组相比，高浓度 TGP 处理组启动子区平均甲基化水平显著增加(P0.01，图 3)。20016012080400100 101 102 103 1040 62.5 312.5 1562.5FITCPercentage of CD11a staining cells/%CountsCountsCountsCountsFITCFITCFITC100 101 102 103 104100 101 102 103 104100 101 102 103 104200160120804002001601208040020016012080400Concentrations of TGP/(mg/L)Concentrations of TGP/(mg/L)Relative mRNA expression白芍总苷对系统性红斑狼疮 CD4+T 细胞 ITGAL 基因表达和启动子甲基化修饰的影响 赵明，等4673 讨 论CD11a 在活化的 T 淋巴细胞表面过度表达。在正常的 T 淋巴细胞中过度表达 CD11a 可诱导 T细胞的自身反应性，在小鼠体内可复制出狼疮样疾病表型5,17。笔者先前的研究1819表明 SLE 患者 CD4+T 细胞中 CD11a 过度表达，其表达水平与SLE 疾病活动性呈正相关。为了揭示 TGP 抑制自身免疫反应的分子机制，本研究检测了不同浓度 TGP对 SLE 患者 CD4+T 细胞中 CD11a 表达的影响。RealtimePCR 和流式细胞检测结果均显示 1562.5 mg/L TGP 处理 SLE 患者 CD4+T 细胞 48 h 后显著降低 ITGAL 基因 mRNA 和蛋白的表达水平。该研究结果提示 TGP 可抑制 T 细胞自身免疫反应，降低自身免疫性炎症反应发生。DNA 甲基化修饰可在不改变基因核苷酸序列条件下调控基因表达水平。DNA 甲基化修饰在机体的生理和病理过程中发挥重要的调控作用。大量研究2022表明 DNA 异常低甲基化修饰是导致 SLE患者 CD4+T 细胞异常活化，过度刺激 B 细胞产生大量自身抗体的关键分子机制之一。笔者以往的研究5结果已证实在 SLE 患者 CD4+T 细胞中 ITGAL基因启动子异常低甲基化，从而导致 CD11a 过度表达。本研究探讨了 TGP 对 ITGAL 基因启动子甲基化状态的影响。利用亚硫酸盐测序检测 ITGAL 基因启动子甲基化水平，结果显示在高浓度TGP处理组，ITGAL 启动子甲基化水平显著升高。由此笔者推测，TGP 抑制 CD11a 表达可能是通过升高 ITGAL 基因启动子甲基化水平实现。总之，以上研究结果表明 TGP 对 SLE 患者CD4+T 细胞中自身免疫相关基因 ITGAL 表达具有抑制作用。TGP 可通过升高 CD4+T 细胞 ITGAL 基因启动子甲基化水平抑制 ITGAL 基因表达。本研究初步揭示了传统中药 TGP 抑制自身免疫反应的分子机制，为 TGP 应用于治疗 SLE 等自身免疫性疾病提供实验依据。参考文献1.Kyttaris VC,Juang YT,Tsokos GC.Immune cells and cytokines in systemic lupus erythematosus:an updateJ.Curr Opin Rheumatol,图 3 高浓度 TGP 对 SLE 患者外周血 CD4+T 细胞中 ITGAL 基因启动子区甲基化水平的影响。A，B：分别为对照组和 1562.5 mg/L TGP 组 ITGAL 基因启动子区每个 CG 位点的甲基化状态；C：启动子区甲基化水平(n=3,xs)。与对照组比较，*P0.01。Figure 3 Effect of TGP on DNA methylation status of ITGAL promoter in CD4+T cells from patients with SLE.A:DNA methylation status of each CG pair in ITGAL promoter region in the groups of control and 1562.5 mg/L TGP,respectively;B:Mean DNA methylation level of promoter region(n=3,xs).*P0.01 vs the control group.1300 1250 1200 1150 11001300 1250 1200 1150 1100ABCD11aCD11aCLevel of methylationControlTGP/(1562.5 mg/L)10.5010.50中南大学学报(医学版),2012,37(5)htt p:/www.csumed.org;htt p:/4682005,17(5):518-522.2.Dean GS,Tyrrell-Price J,Crawley E,et al.Cytokines and systemic lupuserythematosusJ.Ann Rheum Dis,2000,59(4):243251.3.Bleijs DA,Binnerts ME,van Vliet SJ,et al.Low-affinity LFA-1/ICAM-3 interactions augment LFA-1/ICAM-1-mediated T cell adhesion and signaling by redistribution of LFA-1J.J Cell Sci,2000,113(Pt3):391400.4.Varga G,Nippe N,Balkow S,et al.LFA-1 contributes to signal I of T-cell 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