神经酰胺激酶抑制剂NVP-...腺癌细胞恶性表型效应的研究_余明皓.pdf

论著神经酰胺激酶抑制剂 NVP231 对去势抵抗性前列腺癌细胞恶性表型效应的研究*基金项目:国家自然科学基金资助项目(81970657)1通讯作者，E-mail:qijun xinhuamedcomcn200092上海上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科余明皓，上官勋，周嘉统，丁杰，齐隽1【摘要】目的探讨神经酰胺激酶(CerK)抑制剂 NVP-231 对去势抵抗性前列腺癌(CPC)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法采用 Western blotting 法检测 VCaP、LNCaP 两株雄激素依赖性前列腺癌细胞与 C4-2B、PC3 两株 CPC 细胞内 CerK 蛋白水平。用 DMSO 或不同浓度(500、1000 nmol/L)NVP-231 分别处理 C4-2B 和 PC3 细胞。采用 CCK-8 法、克隆形成实验、Hoechst 染色法、划痕愈合实验和 Transwell 小室实验分别检测处理 48 h 的细胞增殖、克隆形成、凋亡、迁移和侵袭能力。结果与 VCaP、LNCaP 两株雄激素依赖性前列腺癌细胞比较，C4-2B、PC3 两株 CPC 细胞中 CerK 蛋白水平明显升高，差异均有统计学意义(P0.05)。与 DMSO 处理组比较，C4-2B 和 PC3 细胞经 NVP-231处理后细胞增殖能力降低，细胞克隆形成数目减少，细胞凋亡率升高，划痕愈合率降低，穿膜细胞数减少，差异均有统计学意义(P0.05)，且均具有浓度依赖性。结论CerK 抑制剂 NVP-231 能通过抑制细胞增殖与生长，促进凋亡，降低细胞侵袭和迁移能力，进而逆转 CPC 细胞的恶性表型。【关键词】去势抵抗性前列腺癌;神经酰胺激酶;恶性表型中图分类号:737.25文献标识码:A文章编号:10090460(2023)03019307The effects of ceramide kinase inhibitor NVP 231 on the malignant phenotype of castrationresistantprostate cancer cellsYU Minghao，SHANGGUAN Xun，ZHOU Jiatong，DING Jie，QI Jun Department of Urology，XinhuaHospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200092，ChinaCorresponding author:QI Jun，E-mail:qijun xinhuamedcomcn【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of the ceramide kinase(CerK)inhibitor NVP-231 on cell proliferation，apoptosis，invasion and migration of castration resistant prostate cancer(CPC)cells MethodsWestern blotting was used to detectthe CerK protein level in the human prostate cancer(PCa)cell lines，including CPC cell lines(C4-2B and PC3)and androgen-dependent PCa cell lines(VCaP and LNCaP)C4-2B and PC3 were treated with NVP-231 at different concentrations(500，1000 nmol/L)，respectively CCK-8，clonogenesis test，Hoechst staining，scratch healing test and Transwell test were used to detectthe cell proliferation，clonogenesis，apoptosis，migration and invasion after 48 h of treatment esultsCompared with VCaP andLNCaP androgen-dependent prostate cancer cells，the level of CerK protein in CPC cells of C4-2B and PC3 increased significantly(P0.05)Compared with DMSO treatment group，C4-2B and PC3 cells after the treatment of NVP-231，the proliferative capacity andthe number of cell clones decreased，the rate of apoptosis increased，the rate of scratch healing and the number of penetrating cellswere also decreased The difference was statistically significant(P0.05)，and the results were concentration-dependent ConclusionCerK inhibitor NVP-231 can reverse the malignant phenotype of CPC cells by inhibiting cell proliferation and growth，promotingapoptosis，reducing cell invasion and migration【Key Words】Castration-resistant prostate cancer;Ceramide kinase;Malignant phenotype391临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3前列腺癌是全球男性第二常见的恶性肿瘤，已成为癌症相关死亡的主要原因之一1-2。雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy，ADT)通过各种手段消除患者体内雄激素或抑制雄激素活性以抑制癌细胞生长，这是目前治疗前列腺癌的主要手段。若前列腺癌患者首次持续抗雄激素治疗后病情复发或进展，则转变为去势抵抗性前列腺癌(cas-tration-resistant prostate cancer，CPC)，预后差、死亡率高。CPC 现已成为前列腺癌治疗的难点，临床上亟待 CPC 的有效疗法3-4。神经酰胺激酶(ceramide kinase，CerK)是唯一已知的在哺乳动物细胞中催化神经酰胺(ceramide，Cer)磷酸化为 1-磷酸神经酰胺(ceramide-1-phosphate，C1P)的脂质蛋白类酶。现有研究表明，CerK、Cer 及 C1P 均参与肿瘤细胞增殖、存活、凋亡与迁移/转移的调控机制，与肿瘤的发生和发展密切相关，是抗肿瘤治疗的潜在靶点5-6。研究显示，雄激素能抑制前列腺癌细胞中 CerK 表达与 C1P 产生，从而影响细胞增殖和迁移，提示抗雄激素疗效可能受 CerK 酶促代谢过程重新激活的限制7。本研究在发现 CPC 细胞内CerK 水平增高的实验结果基础上，为阐明该变化与CPC 细胞生物学行为的关联性，观察了 CerK 特异性抑制剂 NVP-231 对 CPC 细胞恶性表型的效应。现报告如下。1材料与方法1.1材料人雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP、人 CPC 细胞株 C4-2B 和 PC3 购自美国ATCC 细胞库，人雄激素依赖性前列腺癌细胞株VCaP 为本课题组留存。NVP-231 购自美国 CaymanChemical 公司。PMI 1640 培养基、胎牛血清(FBS)购自美国 Gibco 公司，胰蛋白酶购自上海雅酶生物医药公司。二甲基亚砜(DMSO)、兔抗人 CerK 抗体和兔抗人 GAPDH 抗体购自美国 Abcam 公司，山羊抗兔二抗购自武汉 Abclonal 生物科技公司。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、Hoechst33342 染色试剂盒和苏木素染料均购自上海碧云天生物技术有限公司。Transwell 小室购自美国 Corning 公司。1.2方法1.2.1体外细胞培养在 37、5%CO2的培养条件下，用含 10%FBS、1%青霉素-链霉素的PMI 1640完全培养液培养细胞。各株细胞均呈上皮细胞样形态贴壁生长，其中 C4-2B 细胞呈散在斑片状生长。取生长状态良好的细胞用于后续实验。1.2.2CCK-8 检测将对数生长期的细胞制备成单细胞悬液(即对数生长期单细胞悬液)，并进行细胞计数，以 2103个细胞/孔的密度接种于 96 孔板，对照组用 0.1%DMSO 处理(即 DMSO 处理组)，实验组分别用不同浓度(500、1000 nmol/L)NVP-231处理。为了评估每个时间点的细胞增殖能力，各组分别于 24、48、72、96、120 h 按 CCK-8 检测试剂盒说明书向每孔加入10 l CCK-8 溶液，继续在37 环境中孵育1 h。用酶联免疫检测仪(购自美国 Bio-ad公司)于 450 nm 波长处测量各孔光密度值(A)。每组设 3 个复孔，取平均 A 值绘制细胞增殖曲线。1.2.3克隆形成实验将对数生长期单细胞悬液以 1000 个细胞/孔接种到 6 孔板中，待细胞完全贴壁后，对照组更换为含 0.1%DMSO 的培养液，实验组 分 别 更 换 为 含 不 同 浓 度 NVP-231(500、1000 nmol/L)的培养液。每孔加入 2 ml 培养液，每组设 3 个复孔，37培养箱培养 10 天，待长出可见的克隆即终止培养。吸弃培养液，用无菌 PBS 洗涤细胞 3 次，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，风干后扫描成像。计数超过 50 个细胞的集落。1.2.4凋亡细胞检测采用 Hoechst33342 染色法检测凋亡。将对数生长期的单细胞悬液按 1104个细胞/孔接种于 24 孔板的 500 l/孔完全培养液中，每组设 3 个复孔，待细胞培养 24 h 贴壁后，对照组用 0.1%DMSO 处理，实验组分别用不同浓度(500、1000 nmol/L)NVP-231 处理;继续培养细胞 48 h，每孔板加入 500l Hoechst33342 染色液，使染液充分覆盖细胞;摇床孵育 5 min;轻轻吸去各孔中 Ho-echst33342 染色液;用无菌 PBS 清洗 3 次，每次5 min;荧光显微镜下观察结果，使用 Image J 软件进行定量处理。1.2.5划痕愈合实验将对数生长期的单细胞悬液按 1106个细胞/孔接种于 6 孔板的 2 ml/孔完全培养液中，每组设 3 个复孔，经 24 h 培养，细胞量增殖至占每孔底面积约 80%90%后，使用 200 l 标准移液器尖端在每孔中间划线条以形成划痕创伤，记录此时划痕面积为 S0h，并用无菌 PBS 溶液洗涤去除细胞碎片，更换为含 DMSO 或 NVP-231 的培养液，对照组用 0.1%DMSO 处理，实验组分别用不同浓度(500、1000 nmol/L)NVP-231 处理。继续培养48 h，在光镜下随机选取 3 个视野观察并拍下划痕愈合照片，记录此时划痕面积为 S48h。使用 LG-3491临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3Scientific Frame Grabber 计算机图像采集软件采集图像，并用计算机图像分析软件 Image J 进行图像分析，测算细胞迁移边缘之间的面积。采用愈合率为量化细胞迁移能力的评估标准，愈合率=(S0hS48h)/S48h 100%。实验重复 3 次。1.2.6Transwell 小室实验Transwell 小室的上、下室之间以聚碳酸酯微孔膜分隔，滤膜上包被人工基底膜胶(ECMatrix)。小室孔径为 8.0 m。上室加入 300 l 含 0.1%DMSO 或不同浓度(500、1000 nmol/L)NVP-231 无血清的 PMI 1640 培养基及 1104个细胞，下室加入 500 l 完全培养液，使癌细胞朝向含有细胞因子和趋化因子的下室移行。小室置于 37、5%CO2培养箱中培养 48 h，取出下室并吸掉培养液，用 4%多聚甲醛固定 15 min，浸入苏木素中染色 20 min，冲洗后风干。在光镜下随机选取 5 个视野计数进入下室的细胞量。1.2.7Western blotting 检测收集 6 孔培养板中各组细胞并提取其蛋白质，在 12%SDS 聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，将凝胶置于 pH=7.5 的 Tris 缓冲液(100 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris 和 0.1%Tween-20)中电转移至聚偏二氟乙烯膜上，用 5%脱脂奶粉封闭 1 h。将膜分别用以下一抗进行免疫印迹:CerK(1 1000)，GAPDH(1 5000)，用二抗(1 20 000)在室温下孵育。ECL 显色后，通过增强的化学发光图像分析系统发光后，用 Image J 分析灰度，进行半定量比较。1.3统计学分析采用 SPSS20.0 版软件进行统计学分析。数据以“均数标准差”表示，两组间比较用 t 检验。以P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1CPC 细胞内 CerK 的表达水平Westernblotting 检测结果显示，与 VCaP、LNCaP 两株雄激素依赖性前列腺癌细胞比较，CPC 细胞 C4-2B 与PC3 中 CerK 水平均明显升高(P0.05)。见图 1。A:Western blotting 检测记录图;B:相对表达量;与雄激素依赖性前列腺癌细胞比较，*P0.05，P0.01图 1CPC 细胞中 CerK 蛋白的表达水平2.2NVP-231 对 CPC 细胞增殖和克隆形成的影响CCK-8 实验结果显示，与 DMSO 处理组相比，不同浓度 NVP-231 处理 C4-2B 与 PC3 两株细胞后各时间点 A 值均明显降低，呈现对细胞增殖的时间依赖性抑制效应(P0.01);与 500 nmol/L NVP-231处理组比较，1000 nmol/L NVP-231 处理两株细胞后各时间点 A 值降低更明显(P0.01)，呈现 NVP-231对细胞增殖的浓度依赖性抑制效应。见图 2。采用不同浓度(500、1000 nmol/L)NVP-231 分别处理 C4-2B、PC3 细胞 48 h，观察平板克隆形成情况。C4-2B 细胞经 DMSO 及 500、1000 nmol/L NVP-231 处理，平板克隆形成数分别为(25231)、(15324)、(36 28)个;PC3 细 胞 经 DMSO 及 500、1000 nmol/L NVP-231 处理，平板克隆形成数分别为(25531)、(15215)、(3011)个。与 DMSO 处理组比较，NVP-231 处理后细胞克隆数目均明显减少(P0.05);与 500 nmol/L NVP-231 处理组比较，1000 nmol/L NVP-231 处理两株细胞后细胞克隆数目减少更显著(P0.01)，呈现出 NVP-231 对 CPC细胞生长的浓度依赖性抑制效应。见图 3。2.3NVP-231 对 CPC 细胞凋亡的影响不同浓度 NVP-231 分别处理 C4-2B、PC3 细胞 48 h，观察凋亡情况。与 DMSO 处理组 C4-2B:(0.380.15)%;PC3:(5.361.01)%相比，500 nmol/L NVP-231处理C4-2B:(7.49 0.86)%;PC3:(11.16 1.37)%和 1000 nmol/L NVP-231 处理C4-2B:591临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3(31.141.10)%;PC3:(19.154.03)%后，细胞凋亡率均明显升高(P0.001);与500 nmol/L NVP-231 处理组比较，1000 nmol/L NVP-231 处理两株细胞后凋亡率更高(P0.05)，表明 NVP-231 能浓度依赖性地增加细胞凋亡率。见图 4。A:C4-2B 细胞株;B:PC3 细胞株;与 DMSO 处理组比较，*P0.01;与 500 nmol/L NVP-231 处理组比较，#P0.01图 2NVP-231 对 CPC 细胞增殖的影响A:结晶紫染色扫描图;B:平板克隆形成数;与 DMSO 处理组比较，*P0.05;与 500 nmol/L NVP-231 处理组比较，#P0.01图 3NVP-231 对 CPC 细胞克隆形成的影响A:荧光显微镜下视野(400)，箭头所指为凋亡细胞;B:细胞凋亡率;与 DMSO 处理组比较，*P0.01;与 500 nmol/L NVP-231 处理组比较，#P0.05图 4NVP-231 对 CPC 细胞凋亡的影响2.4NVP-231 对 CPC 细胞迁移和侵袭的影响采用划痕愈合实验和 Transwell 小室实验观察细胞迁移和侵袭能力的变化情况。C4-2B 和 PC3 细胞经DMSO 处理 48h 的划痕愈合率分别为(22.96 1.48)%、(39.56 4.91)%，明显高于 500 nmol/LNVP-231 组的(15.392.94)%和(23.343.58)%，以及 1000 nmol/L NVP-231 组的(7.671.29)%和(10.710.76)%，且 1000 nmol/L NVP-231 组低于691临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3500 nmol/L NVP-231 组。上述差异均有统计学意义(P0.05)。表明 NVP-231 能浓度依赖性地抑制细胞的迁移能力。见图 5。将不同处理后的细胞接种于 Transwell 小室中，48 h 后染色、固定，倒置显微镜下观察，结果显示，C4-2B 与 PC3 细胞经 DMSO 处理后穿膜细胞数分别为(251.6722.12)个和(510.0027.51)个，显著高于 500 nmol/L NVP-231 组的(138.6714.98)个和(310.0018.36)个，1000 nmol/L NVP-231 组的(33.67 6.66)个 和(104.67 15.63)个，且1000 nmol/L NVP-231 组低于 500 nmol/L NVP-231 组。上述差异均有统计学意义(P0.01)。表明 NVP-231 能浓度依赖性地抑制细胞的侵袭能力。见图 6。A、C:光镜下视野(200);B、D:划痕愈合率;与 DMSO 处理组比较，*P0.01;与 500 nmol/L NVP-231 处理组比较，#P0.05图 5NVP-231 对 CPC 细胞迁移能力的影响A:倒置显微镜下视野(200);B:侵袭细胞数;与 DMSO 处理组比较，*P0.01;与 500 nmol/L NVP-231 处理组比较，#P0.001图 6NVP-231 对 CPC 细胞侵袭能力的影响791临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No33讨论CerK 编码基因位于 22q13 染色体上，含有 13个外显子。CerK 蛋白由 537 个氨基酸序列构成，分子量为 60 kDa5-6。CerK 能催化神经酰胺(Cer)磷酸化为 1-磷酸神经酰胺(C1P)。Cer 作为该酶促反应底物不仅参与质膜结构组成，还是细胞内和细胞间的信使分子，调控细胞增殖、凋亡等过程;而 C1P作为该酶促反应产物也与细胞功能和存活密切相关5-6。本研究中，C4-2B 与 PC3 两株 CPC 细胞内 CerK 含量均高于 VCaP、LNCaP 两株雄激素依赖性前列腺癌细胞。Zhu 等8 报道 CerK 上调可促进三阴性乳腺癌细胞的生长和迁移，使细胞对化疗药物不敏感，而CerK 下调时结果相反。Schwalm 等9 分别采用MDA-MB-231 亲代人乳腺癌细胞、将亲代细胞接种到免疫缺陷小鼠体内后肺与骨转移灶的子代乳腺癌细胞进行研究，发现子代癌细胞中 CerK 酶活性较亲代癌细胞明显增加，且迁移与侵袭力增强。但也有不同结论的研究报道，Tomizawa 等10 发现抑制A549 人肺癌细胞中 CerK 的表达(shCerK 细胞)，与细胞迁移相关的伪足形成增加，而 CerK 上调则抑制细胞伪足形成;由静脉注入到裸鼠体内的 A549-shCerK 细胞肺转移效应明显增强，提示 CerK 能抑制 A549 肺癌细胞的迁移和转移能力。这些结果表明，CerK 对肿瘤细胞的生物学调控具有双重性，在不同组织类型肿瘤细胞中呈现不同效应。那么，CPC 细胞中 CerK 上调会引起怎样的细胞生物效应呢?我们观察了 CerK 抑制剂 NVP-231 对 CPC细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。NVP 231 是一种强效、特异、可逆的 CerK 抑制剂，能竞争性地抑制 Cer 与 CerK 的结合，使 Cer 转化为 C1P 受阻11-12。在采用 C4-2B 与 PC3 两种细胞预实验取得 IC50值基础上，本实验选择500 nmol/LNVP-231 与 1000 nmol/L NVP-231 作为实验组细胞的处理浓度11。本研究结果显示，在所观察的时间(体外培养细胞至 120 h)与制剂浓度(5001000 nmol/L)范围内，与对照组采用 0.1%DMSO 处理细胞比较，NVP-231 处理后 C4-2B 与 PC3 细胞增殖曲线呈时间与浓度依赖性降低、细胞克隆数目呈浓度依赖性减少，同时细胞凋亡呈浓度依赖性增加。提示抑制 CPC细胞内 CerK 能抑制细胞的增殖与生长，促进细胞凋亡。这与 Pastukhov 等12 先前报道的 NVP-231 对乳腺癌细胞和肺癌细胞的影响是一致的，即 NVP-231能浓度依赖性地抑制乳腺癌 MCF-7 细胞和非小细胞肺癌 NCI-H358 细胞的生长、DNA 合成和集落形成，诱导凋亡。主要机制可能与 NVP-231 处理能减少 S 期细胞数量、诱导 G2/M 期阻滞而改变细胞周期有 关，以 及 与 引 起 DNA 断 裂、Caspase-3 和Caspase-9 活化而诱导的细胞凋亡相关12。本研究选用的 C4-2B 与 PC3 属于雄激素不敏感型转移性前列腺癌细胞株，我们也观察了 NVP-231 对两者侵袭和迁移能力的影响。划痕愈合实验和 Transwell 小室实验结果均显示，NVP-231 能浓度依赖性地抑制 C4-2B 与 PC3 细胞的侵袭和迁移能力。首次证实了 CerK 在控制 CPC 细胞迁移/转移恶性表型方面也有重要作用。那么，为什么在 CPC 细胞内 CerK 含量高于雄激素依赖性前列腺癌细胞?Camacho 等7 采用生物信息分析发现雄激素受体(A)活性高的前列腺癌细胞中 CerK 水平低，CerK 是前列腺癌细胞中与 A活性显著负相关的基因之一;并通过实验证实无A 活性或 A 活性低的前列腺癌细胞中 CerK 表达显著增加，A 活化能降低 CerK mNA 表达，野生型小鼠或前列腺癌小鼠去势治疗会导致前列腺(癌)组织中 CerK mNA 表达上调7。这与本研究观察到的 CPC 细胞内 CerK 含量增加的现象是一致的。我们认为 ADT 作为前列腺癌的主要治疗手段，应用时会诱使前列腺癌细胞 A 活性受抑，CerK含量增加，引起 CPC 细胞内 CerK 水平高于对雄激素敏感的前列腺癌细胞，导致 CPC 细胞恶性表型加剧。总之，前列腺癌是男性最常见的癌症之一，前列腺癌细胞需要雄激素才能存活和生长，靶向 A通路的 ADT 是该病主要治疗策略，但绝大多数前列腺癌患者抗雄激素治疗后都会转变为难治性CPC。然而，CPC 具体发病机制至今尚不明确。本研究观察到抑制 CPC 细胞内 CerK 酶活性不仅能使细胞增殖与存活受抑，而且能使细胞侵袭和迁移能力减弱，既证实了鞘磷脂代谢在前列腺癌细胞死亡和 A 治疗抵抗中扮演着重要角色，也首次证明该代谢在 CPC 发生、发展中起着重要作用，可能涉及磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)等非 A 相关通路。因此，对这些非 A 通路及其靶向药研究可为 CPC 治疗提供新方向。鉴于 CerK891临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3能通过 PI3K/Akt 调控肿瘤细胞生长与迁移8-10，而CPC 细胞恶性表型又受 Akt1 调控13-14，故我们推测 CerK 有可能通过 PI3K/Akt 通路调控 CPC 细胞的恶性表型。一旦该机制得到证实，CerK 有望成为CPC 新的诊断生物标志物与治疗药物的作用靶点。参考文献1Sung H，Ferlay J，Siegel L，et al Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for36 cancers in 185 countriesJ CA Cancer J Clin，2021，71(3):2092492Zhu Y，Mo M，Wei Y，et al Epidemiology and genomics 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