基于Sirt1_p53信号通路探究NK4基因对非霍奇金淋巴瘤细胞增殖和凋亡的机制研究.pdf

【文章编号】1006-6233(2023)08-1263-05基于 Sirt1/p53 信号通路探究 NK4 基因对非霍奇金淋巴瘤细胞增殖和凋亡的机制研究贲海祥,徐娟(江苏省如皋市人民医院血液科,江苏如皋 226500)【摘要】目的:本研究旨在探究 NK4 基因对非霍奇金淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响机制。方法:通过 qRT-PCR 检测 NHL 细胞系(Jurkat 和 Raji)及正常 B 细胞(normal)中 NK4 mRNA 表达水平,采取pcDNA3.1-NK4 转染至 Raji 细胞中由此提高 NK4 表达水平。通过 CCK-8 检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,transwell 迁移实验检测细胞迁移、侵袭能力以此评估细胞生长进展。采取 western blot 检测 Sirt1/p53 信号通路相关蛋白。结果:NK4 基因在 NHL 细胞低表达,在 NHL 细胞株 Raji 细胞中上调NK4 表达水平后,Raji 细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降,而细胞凋亡率上升。此外,上调 NK4 表达水平使得 Sirt1 蛋白表达水平显著下降,p53 水平显著上升。额外添加 Sirt1 激活剂 SRT1720 后细胞生长进展受到部分抑制。结论:NK4 基因介导 Sirt1/p53 信号通路抑制非霍奇金淋巴瘤细胞增殖,促进其凋亡。【关键词】非霍奇金淋巴瘤;细胞增殖;细胞凋亡【文献标识码】A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2023.08.06The Mechanism of NK4 Gene on Proliferation and Apoptosis in Non-Hodgkin Lymphoma Cells Based on Sirt1/p53 Signaling PathwayBEN Haixiang,XU Juan(Rugao Peoples Hospital,Jiangsu Nantong 226500,China)【Abstract】Objective:To investigate the effect of NK4 gene on the proliferation and apoptosis of non-Hodgkins lymphoma cells.Methods:The expression levels of NK4 mRNA in NHL cell lines(Jurkat and Ra-ji cells)and normal B cells(normal)were detected by qRT-PCR.pcDNA3.1-NK4 was transfected into Raji cells to increase the expression level of NK4.Cell proliferation was detected by CCK-8,apoptosis was detec-ted by flow cytometry,and cell migration and invasion were detected by transwell assay to evaluate cell growth progress.Western blot was used to detect Sirt1/p53 signaling pathway-related proteins.Results:NK4 gene was lowly expressed in NHL cells.After up-regulating NK4 expression in NHL cell line Raji cells,the prolif-eration,migration and invasion ability of Raji cells decreased significantly,while the apoptosis rate increased.In addition,up-regulation of NK4 expression significantly decreased Sirt1 protein expression and increased p53 level.Addition of Sirt1 activator SRT1720 partially inhibited cell growth.Conclusion:NK4 gene media-ted Sirt1/p53 signaling pathway inhibited proliferation and promoted apoptosis of non-Hodgkin lymphoma cells.【Key words】Non-Hodgkins lymphoma;Cell proliferation;Apoptosis 恶性淋巴瘤(Malignant lymphoma,ML)是一种血液恶性肿瘤,发生在淋巴结或淋巴结外的淋巴组织1。非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma,NHL)是一类起源于淋巴系统的癌症,由恶性 B 细胞的过度增殖引起,是美国第七大常见恶性肿瘤,通常被认为是预后良好的恶性肿瘤,5 年生存率约为 70%2。但淋巴瘤的发病率在全球范围内持续增加,对人类健康造成严重危害3。NHL 最常见的类型为弥漫大 B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和套细胞淋3621 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 【基金项目】江苏省优势学科建设工程项目,(编号:YSHL0814-812)【通讯作者】徐 娟巴瘤(MCL)4。NK4 是一种特异性肝细胞生长因子(HGF)拮抗剂,由 HGF 的 N 端发夹结构和 链的四个 Kringle 结构域组成。NK4 蛋白给药或 NK4 基因治疗抑制了各种肿瘤类型中的肿瘤生长、侵袭、转移和血管生成,所述肿瘤类型包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、间皮瘤、前列腺癌、胃癌和脑癌57。另外,去乙酰化酶 sirtuin-1(Sirt1)是一种 NAD+依赖性类组蛋白去乙酰化酶,其功能上与细胞代谢相关,并被视为代谢传感器8,可调节干细胞、细胞增殖、凋亡、DNA 修复、自噬和肿瘤发生,Sirt1 在许多癌症中上调,包括前列腺癌、白血病和皮肤 T 细胞淋巴瘤肿瘤细胞9。沉默或抑制 Sirt1 的表达水平会激活下游 p53 蛋白,并随后加速或推动细胞衰老10。目前,NK4 对 NHL 疾病的调控机制尚鲜有研究,尤其是 NK4 是否通过介导Sirt1/p53 信号通路调控肿瘤细胞的生物学行为仍未可知。因此,在这项研究中,我们旨在探究 NK4 基因对 NHL 细胞增殖、凋亡的调节机制。1 材料与方法1.1 细胞培养:人类非霍奇金淋巴瘤细胞株(Jurkat和 Raji)及正常 B 细胞系均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,MD,USA)。Jurkat 和 Raji 细胞在补充有 10%FBS 的 RPMI 1640 培养基中生长,B 细胞维持在添加 10%人血清、100U/mL 青霉素、100g/mL 链霉素、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的 Iscove s 改良培养基中(NABI Biopharma-ceuticals,Boca Raton,FL,USA)。所有细胞系都在37,5%CO2条件下培养。1.2 细胞转染:pcDNA3.1-NK4、pcDNA3.1-NC 均购自 Invitrogen(Carlsbad,CA,USA),Sirt1 激 动 剂SRT1720 购自碧云天生物科技有限公司(上海,中国)。oe-NK4/NC 组细胞处理步骤如下:将细胞以 1106细胞/mL 的密度置于 6 孔板上,按照操作说明书,使用 LiPofectamine 2000(11668-019,Invitrogen,Carls-bad,CA,USA)将 50 nM pcDNA3.1-NK4/NC 转染到Raji 细胞(培养至融合度 80%以上)中,转染 48h。oe-Sirt1+SA/DMSO 组处理步骤如下:在培养基中加入给定浓度的 SIRT1 激动剂 SRT1720(1moL/L)或者等量的 DMSO,再转染 pcDNA3.1-NK4 48h 后进行后续实验。1.3 qRT-PCR(实时荧光定量聚合酶链反应):从人淋巴瘤细胞系或正常外周淋巴细胞中提取总 RNA TRIzol 试剂(Invitrogen),并使用反转录第一链 cDNA合成试剂盒(K1622;Thermo Fisher Scientific)进行反转录。根据制造商的说明,使用 Maxima SYBR Green/ROX qPCR master mix(K0223;Thermo Fisher Scientif-ic)进行 qRT-PCR 检测 NK4 mRNA 水平,-actin 用于归一化。用于 qRT-PCR 的引物如下,NK4 F:5-GTGAATACTGCAGACCAATGTGCTA-3和 NK4 R:5-GGTCAAATTCATGGCCAAATTC-3;-actin F:5-TG-GCACCCAGCACAATGAA-3,R:5-CTAAGTCAT-AGTCCGCCTAGAAGCA-3。使用 2-Ct比较 Ct 方法计算。1.4 CCK-8 检测细胞增殖:细胞增殖通过细胞计数试剂盒-8(CCK8)分析(C0039,碧云天生物科技有限公司,北京,中国)。将不同组的细胞以 2105细胞/孔的密度接种到 96 孔板中,并在 37含 5%CO2的湿润培养箱中孵育隔夜。在第 0 小时、第 12 小时、第 24小时、第 48 小时和第 72 小时收集细胞。去除培养基并用无血清基本培养基替换后,向每个孔中加入 10L CCK 8 溶液并孵育 1h,之后将 100 L 样品上清液转移到 96 孔微孔板中,并根据光密度波长为 450nm。1.5 流式细胞术检测细胞凋亡:细胞被胰蛋白酶消化并在冷 PBS 中洗涤两次。在1000g 离心5min 后,收集细胞并浓缩至每孔 1106个细胞。将 0.1mL 细胞悬浮液与 5L FITC 缀合的膜联蛋白 V 混合,在室温下避光孵育 15min,然后与 5L PI 混合并孵育 5min。然后使用流式细胞仪(FACSCanto,BD Biosciences,US)分析样品。1.6Transwell 法检测细胞迁移、侵袭:根据生产商说明,使用 24 孔 Transwell 小室(BD,Biosciences)检测细胞迁移和侵袭能力。侵袭实验时,先按 1 8 的比例将50mg/L Matrigel 胶稀释后铺于小室底部;迁移实验时不铺胶。24 孔板下室加入完全培养基 600L,取各组细胞悬液 200L 加入 Transwell 小室的上室,在 37下孵育 24h 后,使用棉签去除上室中的细胞。迁移或侵袭细胞用甲醇在 4固定 30min,用 0.1%结晶紫溶液在 37 染色 20min,用倒置显微镜(Nikon Corpora-tion,Japan)进行观察。细胞实验独立重复 3 次。1.7 Western blot:用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液(基尔顿生物科技上海有限公司,上海,中国)获取细胞裂解液,使用 BCA 蛋白质测定试剂盒(PICPI23223;Thermo Fisher Scientific)对样品蛋白浓度进行检测。进行加热和变性后,使用 10%(对于高分子量蛋白质)或 15%(对于低分子量蛋白质)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品(25g/泳道),并转移到硝酸纤维膜(Millipore,Billeri-ca,MA,USA)上。在室温下用 5%脱脂牛奶封闭 1h后,将膜与一抗在 4 下单独孵育过夜。一抗信息如4621 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 下:Sirt1(ab189494,1 1000,80kDa)、p53(ab32389,1 10000,44kDa),GAPDH(ab9485,1 2500,37kDa)所有抗体均购自 Abcam(Cambridge,MA,USA)。用含Tween-20 的 Tris 缓冲盐水洗涤后,将膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶 联 的 山 羊 抗 兔 二 抗(1 1000;ab150077)一起在室温下孵育 1h。在 Tanon 5200 化学发光成像系统(上海天能科技有限公司,上海,中国)上观察到蛋白质条带。使用 ImageJ 软件(National In-stitutes of Health,Bethesda,MD,USA)分析条带密度,GAPDH 条带用作内参。1.8 数据分析:采用 SPSS21.0 统计学软件进行数据分析和 GraphPad Prism8.0 软件作图,所有数据均采用平均值 标准差(xs)的形式表示。两组之间的比较采用 t 检验;多组之间的比较采用 One-Way ANOVA 单因素方差分析,事后检验采用 Tukeys multiple com-parisons test。P 为双侧检验,P0.05 视为差异具有统计学显著性。2 结 果2.1 NK4 基因在 NHL 细胞低表达:为评估 NK4 基因在 NHL 细胞中的表达水平,我们使用 qRT-PCR 检测NHL 细胞系(Jurkat 和 Raji)及正常 B 细胞(normal)中NK4 mRNA 的表达。结果显示,与正常 B 细胞相比,NK4 mRNA 水平在 NHL 细胞系中显著下降(图1,均 P0.01),其中,NK4 表达水平在 Raji 细胞中最低。因此在后续的研究中,我们采取 Raji 细胞作为研究对象。图 1 NK4 基因在 NHL 细胞低表达qRT-PCR 检测 NK4 mRNA 在 NHL 细胞及正常 B 细胞中的表达水平。代表与正常 B 细胞进行比较 P0.0012.2 上调 NK4 基因表达水平抑制 NHL 细胞生长进展:为探索 NK4 细胞在 NHL 细胞中的作用,我们使用pcDNA3.1-NK4 及其阴性对照 pcDNA3.1-NC 转染至Raji 细胞中。qRT-PCR 结果显示,转染 pcDNA3.1-NK4 组(oe-NK4 组)NK4 mRNA 水平显著上升,转染成功(图 2A,P0.001)。随后,我们分别采取 CCK-8和流式细胞术探究细胞增殖和凋亡,结果显示,与转染pcDNA3.1-NC 组(oe-NC 组)相比,上调 NK4 表达水平显著抑制 NHL 细胞增殖、促进细胞凋亡(图 2B-C,均 P0.001)。此外,在 NHL 细胞中上调 NK4 表达水平后,NHL 细胞迁移和侵袭能力显著下降(图 2D,均 P0.01)。以上结果表明,上调 NK4 基因表达水平抑制NHL 细胞生长进展。图 2 上调 NK4 基因表达水平抑制 NHL 细胞生长进展NHL:未经任何处理,正常培养的 Raji 细胞;oe-NK4/NC组:pcDNA3.1-NK4(或其阴性对照 NC)转染至 Raji 细胞。A:qRT-PCR 检测 pcDNA3.1-NK4 的转染效率;B:CCK-8 检测细胞增殖;C:流式细胞术检测细胞凋亡;D:transwell 迁移实验检5621 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 测细胞迁移、侵袭能力。:P0.01,:P0.0012.3NK4 基因抑制 Sirt1/p53 信号通路:Western blot检测结果发现,与正常 B 细胞相比,Sirt1 蛋白表达水平在 Raji 细胞中显著上调(图 3,P0.001),而 p53 蛋白表达水平显著下降(图 3,P0.001)。而在 Raji 细胞中过表达 NK4 基因后,Sirt1 蛋白表达水平显著下降,p53 水平显著上升(图 3,均 P0.001)。以上结果表明,NK4 基因抑制 Sirt1/p53 信号通路。图 3 NK4 基因抑制 Sirt1/p53 信号通路Western blot 检测 Sirt1/p53 信号通路相关蛋白的表达。:P0.0012.4 激活 Sirt1/p53 信号通路部分逆转过表达 NK4对 NHL 细胞生长进展的抑制:为进一步确定 NK4/Sirt1/p53 在 NHL 细胞生长进展中发挥的作用,在上调NK4 表达的 Raji 细胞中,同时添加 Sirt1 激活剂SRT1720 上调 Sirt1 的表达。结果显示,SRT1720 显著上调 Raji 细胞中 Sirt1 蛋白表达水平,显著降低 p53 蛋白表达水平(图 4A,均 P 0.01)。本研究还观察到Sirt 激活剂显著促进 NHL 细胞增殖、抑制细胞凋亡(图 4B-C,均 P0.01)。此外,在 NHL 细胞中添加Sirt 激活剂后,NHL 细胞迁移和侵袭能力显著下降(图4D,均 P0.01)。以上结果表明,激活 Sirt1/p53 信号通路部分逆转过表达 NK4 对 NHL 细胞生长进展的抑制。图 4激活 Sirt1/p53 信号通路部分逆转过表达 NK4 对NHL 细胞生长进展的抑制A:Western blot 检测 Sirt1/p53 信号通路相关蛋白的表达;B:CCK-8 检测细胞增殖;C:流式细胞术检测细胞凋亡;D:tran-swell 迁移实验检测细胞迁移、侵袭能力。:P0.01,:P0.0013 讨 论NHL 覆盖了约 90%的影响淋巴结、脾、骨髓和免疫系统及其他器官的淋巴瘤。NK4 基因疗法可抑制多种肿瘤的生长、侵袭、转移和血管生成5。在不同癌症的实验模型中,NK4 基因治疗抑制了 Met 受体的激活,这与抑制肿瘤的侵袭和转移有关。类似地,NK4基因治疗抑制肿瘤血管生成,从而抑制血管生成依赖性肿瘤生长11。因此,在本研究中笔者大胆假设 NK4基因或许对 NHL 的发生发展发挥着关键作用。结果显示,与正常 B 细胞相比,NK4 基因在 NHL 细胞系(Jurkat 和 Raji)中低表达。这提示,差异表达的 NK4或许对 NHL 细胞的生物学功能扮演了重要角色。接下来,我们通过过表达 NK4 来探究其对 Raji 生物学行为的影响。结果显示,上调 NK4 基因表达水平能够明显抑制 NHL 细胞生长进展。这暗示 NK4 在 NHL 细胞中作为抑瘤基因发挥着重要功能。已有的研究证明,Sirtuin 家族具有延缓细胞衰老和延长寿命方面的功能10。Sirt1 有多种底物,如 NF-B、Ku70、p53、E2F1、TFR2、PPAR、p73、BcL-XL、MyoD、AR、cI AP2 和 FOXO 家族的转录因子。p53 作6621 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 为 Sirt1 底物的最具代表性的底物,被认为是一种肿瘤抑制因子。有研究报道,Sirt1 表达与弥漫大 B 细胞淋巴瘤的不良预后相关。Ismail 等的研究显示 p53 的表达水平反映了侵袭性淋巴瘤亚型中有关基因突变的积累。因此,Sirt1/P53 通路与抑瘤基因发挥功能密切相关。基于此,在本研究中,结果发现,与正常 B 细胞相比,Sirt1 蛋白表达水平在 NHL 细胞中显著上调,而p53 蛋白表达水平显著下降。这提示 Sirt1/P53 通路在 NHL 细胞中异常激活。然而,过表达 NK4 能够抑制 Sirt1/P53 通路活性。另外,通过利用 Sirt1/P53 通路激活剂 SRT1720 笔者观察到,激活 Sirt1/p53 信号通路能够部分逆转过表达 NK4 对 NHL 细胞生长进展的抑制作用。因此,NK4 可能通过抑制 Sirt1/p53 通路从而抑制 NHL 细胞增殖、诱导 NHL 细胞凋亡。总之,我们的结果提供了 NHL 中 NK4 过表达可能对削弱细胞生长进展具有十分重要的作用,这表明NK4 在 NHL 进展中作为一种抗癌基因发挥作用,并可能作为一种新的潜在治疗生物标志物影响下游 Sirt1/p53 信号通路。但本研究中不足之处在于仅在 Raji 细胞中对该机制进行验证,未充分考虑该机制是否存在于其它 NHL 细胞系中。【参考文献】1 Jiang M,Bennani N N,Feldman A L.Lymphoma classifica-tion update:T-cell lymphomas,Hodgkin lymphomas,and histiocytic/dendritic cell neoplasms J.Expert Rev Hema-tol,2017,10(3):239-249.2 林海燕,陈飞.初诊时单核细胞计数、中性粒细胞计数与淋巴细胞计数比值、平均红细胞分布宽度在 B 细胞来源的非霍奇金淋巴瘤患者预后评估中的临床意义 J.临床内科杂志,2021,38(7):469-472.3 Muto R,Miyoshi H,Sato K,et al.Epidemiology and secular trends of malignant lymphoma in 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D.南京医科大学,2017.【文章编号】1006-6233(2023)08-1267-08三七白及粉通过 Nrf2/Gpx4 介导的铁死亡改善脑出血型应激性溃疡大鼠的胃黏膜损伤安凯1,郭沛然2,孙玉凤3(1.河北省石家庄市人民医院康复医学二病区,河北石家庄 0500002.河 北 医 科 大 学 中 西 医 结 合 学 院,河北石家庄 0500003.河 北 医 科 大 学 第 二 医 院 消 化 内 科,河北石家庄 050000)【摘要】目的:探究三七白及粉通过 Nrf2/Gpx4 介导的铁死亡对脑出血型应激性溃疡大鼠胃黏膜损伤的保护作用。方法:按照随机数字表法将 60 只大鼠分为 NC 组、SGU 组、三七白及粉低剂量组(三七白及粉 L 组)、三七白及粉中剂量组(三七白及粉 M 组)、三七白及粉高剂量组(三七白及粉 H 组)、三七白及粉高剂量+Nrf2 特异性抑制剂 ML385 组(三七白及粉 H+ML385 组),每组 10 只。对大鼠进行神经功能评分;测定胃黏膜溃疡指数;HE 染色检测胃组织病理学变化;检测胃组织中 Fe2+、MDA 含量及SOD 活性;DHE 荧光染色法检测胃组织中 ROS 水平;蛋白质印迹检测胃黏膜组织中 Nrf2、Gpx4 和7621 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 【基金项目】河北省中医药管理局项目,(编号:2019454)