重组DNA技术.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,目录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,目录,DNA,重组和重组,DNA,技术,DNA Recombination and,Recombinant DNA technology,第二十一章,DNA,重组,（,DNA recombination,）是指不同,DNA,分子断裂和连接而产生,DNA,片段的交换并重新组合形成新,DNA,分子的过程。,重组,DNA,技术,（,recombinant DNA technology,）是指在体外将两个或两个以上,DNA,分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新,DNA,分子的过程。,第一节,自然界,DNA,重组和基因转移,DNA Recombination,and Gene Transfer in Nature,DNA,重组,同源重组,(homologous recombination),位点特异的重组,(site-specific recombination),转座重组,(transposition recombination),接合作用,(conjugation),转化作用,(transformation),转导作用,(transduction),发生在同源序列间的重组称为,同源重组,(homologous recombination),，,又称,基本重组（,general recombination,）,。是最基本的,DNA,重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个,DNA,分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,以,E.coli,的同源重组为例，了解同源重组机制的,Holliday,模型,一、同源重组是最基本的,DNA,重组方式,二、位点特异重组是发生在特异位点间的,DNA,整合,位点特异重组,(site-specific recombination),是由整合酶催化，在两个,DNA,序列的特异位点间发生的整合。,三、转座重组,可使基因移位,由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为,转座,(transposition),。,大多数基因在基因组内的位置是固定的，但,有些基因可以从一个位置移动到另一位置,。这些可移动的,DNA,序列包括插入序列和转座子。,四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组,（一）接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒,DNA,从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的,DNA,转移称为,接合作用,(conjugation),。,可接合质粒如,F,因子,(F factor),细菌染色体外的小型环状双链,DNA,分子。,质粒,（二）转化作用,通过自动获取或人为地供给外源,DNA,，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为,转化作用,(transformation),。,例：,溶菌时，裂解的,DNA,片段被另一细菌摄取。,（三）转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的,DNA,转移及基因重组即为,转导作用,(transduction),。,噬菌体的生活史,溶菌生长途径,(,l,ysis pathway),溶源菌生长途径,(lysogenic pathway),第二节 重组,DNA,技术,Recombinant DNA Technology,重组,DNA,技术相关概念,克隆,(clone):,来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化,(cloning),，即无性繁殖。,技术水平：,分子克隆,(molecular,cloning),（即,DNA,克隆）,细胞克隆,个体克隆（动物或植物）,其主要过程包括：在体外将目的,DNA,片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组,DNA,分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一,DNA,分子的大量拷贝。,重组,DNA,技术，又称分子克隆（,molecular cloning,）或,DNA,克隆（,DNA cloning,）或基因工程（,genetic engineering,）技术,一、重组,DNA,技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,聚合酶,逆转录酶,T,4,DNA,连接酶,碱性磷酸酶,末端转移酶,Taq,DNA,聚合酶,重组,DNA,技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接；,缺口平移制作高比活探针；,DNA,序列分析；,填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,；,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,限制性核酸内切酶,(,restriction endonuclease),限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是一类核酸内切酶，能识别双链,DNA,分子内部的特异序列,并裂解磷酸二酯键。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,定义：,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA,，保护自身,DNA,。,、,、,（基因工程技术中常用,型）,分类：,作用：,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,黏端切口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,同尾酶,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称,同裂酶或同功异源酶,。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,同裂酶：,二、重组,DNA,技术中常用的载体,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,载体按功能分为,克隆载体,(cloning vector),表达载体,(expression vector),克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为,克隆载体,。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为,表达载体,。,（一）克隆载体,至少有一个,复制起点,使载体在宿主细胞中进行自主复制；,至少有一个,选择标志,（,selection marker,）：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，如抗生素抗性基因。,有适宜的,RE,的单一切点,：载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个,RE,的单一切点，可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（,multiple cloning sites,，,MCS,）。,1.,克隆载体应具备的基本特点,（,1,）质粒,(plasmid),特点,:,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,2.,常用的克隆载体,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型，适用,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型，适用基因组克隆）,（,2,）噬菌体,(phage),M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,M13mp,系列,pUC,系列,柯斯质粒,（,cosmid,）,载体（又称黏粒载体）,酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome,YAC),细菌人工染色体,(bacterial artificial chromosome,BAC),动物病毒,DNA,改造的载体,（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,（,3,）其他克隆载体,（二）表达载体,表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。,根据宿主细胞分为：,原核表达载体,真核表达载体,1.,原核表达载体,原核表达载体的基本组成,R,：调节序列；,P,：启动子；,SD,：,SD,序列；,TT,：转录终止序列,2.,真核表达载体,真核表达载体的基本组成,Ori,Pro,：,原核复制起始序列；,P,：,启动子；,MCS,：,多克隆位点；,TT,：,转录终止序列；,ori,euk,：,真核复制起始序列。,第三节,重组,DNA,技术基本原理,和操作步骤,基本原理,目的基因的获取,DNA,导入受体细胞,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,（一）目的基因的分离获取,分,化学合成法,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,从基因组,DNA,文库和,cDNA,文库中获取目的,DNA(,见第,20,章,),PCR,法,(,见第,20,章,),其他方法,(,见第,20,章,),组织或细胞染色体,DNA,基因片断,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组,DNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合,从基因组,DNA,文库获取目的基因,mRNA,cDNA,双链,cDNA,重组,DNA,分子,cDNA,文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,从,cDNA,文库获取目的基因,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,（二）载体的选择与构建,选,目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。,目的：,获得某一目的基因或,DNA,片段,获得目的,DNA,片段所编码的蛋白质,载体,插入,DNA,片段,宿主细胞,质粒,510kb,细菌，酵母,噬菌体载体,20kb,细菌,黏粒,50 kb,细菌,BAC,400kb,细菌,YAC,3 Mb,酵母,不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞,（三）目的,DNA,与载体连接,接,方式：（,1,）,单一相同黏端连接,（,2,）,不同黏端连接,（,3,）,通过其他措施产生黏端进行连接,黏端连接,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,单一相同黏端连接,不同黏端连接（定向克隆）,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,平端连接,限制性内切酶切割产生的平端,粘端补齐或切平形成的平端,适用于：,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,受体菌条件：,安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),导入方式：,转化,(transformation),转染,(transfection),感染,(infection),（四）重组,DNA,转入受体细胞,转,1.,借助载体上的遗传标志进行筛选,(1),利用抗生素抗性标志筛选,(2),利用基因的插入失活,/,插入表达,特性筛选,(3),利用标志补救筛选,(4),利用噬菌体的包装特性进行筛选,（五）重组体的筛选与鉴定,筛,2.,序列特异性筛选,(1),RE,酶切法,(2),PCR,法,(3),核酸杂交法,(4)DNA,测序法,3.,亲和筛选法,插入失活筛选带有重组载体的克隆,互补筛选（蓝,-,白筛选）,菌落或噬斑原位杂交筛选重组体,重组,DNA,技术操作过程可形象归纳为：,小结,分,分离获取目的基因,选,载体的选择与构建,接,目的,DNA,与载体连接,转,重组,DNA,转入受体细胞,筛,重组体的筛选与鉴定,重组,DNA,技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,表达体系的建立：,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,标准：,选择标志 强启动子,翻译调控序列多接头克隆位点,E.coli,表达体系的不足,：,不宜表达真核基因组,DNA,；,不能加工表达的真核蛋白质；,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,(inclusion body),；,很难表达大量可溶性蛋白。,1.,原核表达体系,(E.coli,表达体系最为常用,),优点：,可表达克隆的,cDNA,及真核基因组,DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、经济,转染,将表达载体导入真核细胞的过程,方法：,磷酸钙转染,DEAE,葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染,显微注射,2.,真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）,