高考生物起点一轮复习-第十单元-DNA重组技术的基本工具和基因工程的基本操作程序学案.doc

第十单元 现代生物科技专题
学案49 DNA重组技术的基本工具和基因工程的基本操作程序
考纲要求　
1.基因工程的诞生 Ⅰ
2.基因工程的原理及技术 Ⅱ
复习要求
1．理解基因工程的实质
2．理解基因工程操作的四步曲及其操作实例
基础自查
一．基因工程的概念
基因工程是指 ，通过 技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出 。基因工程是在 水平上进行设计和施工的，又叫做 。
二．基因工程的基本工具
1.限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源： 。
（2）功能：
。
（3）结果：产生的DNA片段末端通常有两种形式： 。
2. DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）比较：
①相同点： 。
②区别：

（2）与DNA聚合酶作用的异同:

3.载体
（1）载体具备的条件：

（2）最常用的是 其它载体：
三．基因工程的基本操作程序
第一步：
原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有
。
２.PCR技术扩增目的基因
（1）原理：
（2）过程：： 。
第二步：
1.目的： 。
2.组成：
（1）启动子： 。
（2）终止子： 。
（3）标记基因的作用：
。
第三步：
2.常用的方法：
a、将目的基因导入植物细胞方法： 。
b、将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 。此方法的受体细胞多是 。
C、将目的基因导入微生物细胞：最常用的原核细胞是 ，其转化方法是：

。
第四步：
1.首先要检测 ，方法是采用 。
2.其次还要检测 ，方法是采用
。
3.最后检测 ，方法是 ，用 。
4.有时还需进行 的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
课堂深化探究
一．对基因工程概念的理解
别名
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境

操作对象

操作水平

基本过程

结果

与杂交育种相比

与诱变育种相比

原理

二．基因工程的基本操作工具
1．与DNA分子相关的酶
(1)几种酶的比较
种类
项目　　
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用底物

作用部位

作用特点

作用结果

(2)限制酶与DNA连接酶的关系

2．载体
(1)作用

(2)具备的条件

(3)种类

特别提醒　①一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
②限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
三．基因工程操作程序
基因工程技术生产凝乳酶的过程

1．基因工程的操作程序分析
(1)目的基因的获取途径

(2)基因表达载体的构建

特别提醒　①插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。
②两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。
(3)将目的基因导入受体细胞(转化)
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法

受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程

(4)目的基因的检测与鉴定
类　型
检测内容
方　法
结果显示

分子
检测
导入检测

转录检测

翻译检测

个体水平检测

特别提醒：1．在整个工程中，只有第三步将目的基因导入受体细胞过程中不发生碱基互补配对，其他步骤均发生配对。
2．切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得相同的黏性末端，利于基因表达载体的构建。
3．插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。
4．PCR技术与DNA复制的比较

PCR技术
DNA复制
相
同
点
原理
DNA双链复制(碱基互补配对)
原料
四种游离的脱氧核苷酸
条件
模板、ATP、酶等
不
同
点
解旋
方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
场所
体外复制
主要在细胞核内
酶
热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)
细胞内含有的DNA聚合酶
结果
在短时间内形成大量的DNA片段
形成整个DNA分子
对应训练
1.下列关于基因工程的叙述，错误的是( )
A．目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
2.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是(　　)。　　　　　
A．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列
B．限制性核酸内切酶的活性受温度影响
C．限制性核酸内切酶能识别和切割RNA
D．限制性核酸内切酶可从原核生物中提取
3.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是(　　)。

A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶 SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
4.下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是(　　)

A．过程①获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序
B．将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白
C．过程②构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选
D．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达
限时训练
题组一　基因工程及基本操作
1.科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内表达成功。请根据图回答问题:

(1)此图表示的是采取 　 合成基因的方法获取 　　　　　　　 基因的过程。
(2)图中①DNA是以 　　　　　　　　 为模板， 　　　　　　 形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的基因。
(3)图中③代表 　　　 DNA，含 　　　　　　　 基因。
(4)图中④表示 　 。
2．下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(　　)

A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
3．下列关于基因工程的叙述，不正确的是(多选)(　　)
A．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因
B．细菌质粒是基因工程常用的运载体
C．通常用一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理运载体DNA
D．为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体
题组二　基因工程的操作程序
4.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题。

(1)若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—，限制酶Ⅱ识别序列和切点是—G↓GATCC—，那么在①过程中，应用限制酶________切割质粒，用限制酶________切割抗虫基因。
(2)将通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有________的培养基上，若能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。
(3)要确定抗虫基因导入后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为：________。经筛选分析，该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，该转基因植株自交产生的F1代中，仍具有抗虫特性的植株占总数的________。
(4)⑤过程所用的现代生物技术称为________，从遗传学角度来看，据细胞通过⑤过程，能形成棉植株的根本原因是细胞具有____________________。
5．干扰素是病毒侵入人体后由淋巴细胞产生的一种免疫活性物质，它具有广谱抗病毒的作用。利用现代生物技术生产干扰素的流程如下：

(1)过程①产生的物质A是______，cDNA文库______(大于/小于)人的基因组文库。
(2)过程④用到的工具酶是______________，过程⑤需先用____________________处理受体细胞，过程⑥通常采用________技术。
(3)过程⑧和⑨的关键技术分别是________、________。
(4)基因工程的核心步骤是图中的________________(填标号)。
题组三综合题
6.(2011·安徽理综31)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。
(1)进行转基因操作前，需用________酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。
(2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的________和________之间。
(3)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、________和________。
(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以________，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。
7．(2010·天津理综，7Ⅰ)下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。

据图回答问题。
(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用________________限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含________的培养基上进行。
(2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是________(填字母代号)。
A．启动子 B．tetR C．复制原点 D．ampR
(3)过程①可采用的操作方法是________(填字母代号)。
A．农杆菌转化 B．大肠杆菌转化
C．显微注射 D．细胞融合
(4)过程②采用的生物技术是________________。
(5)对早期胚胎进行切割，经过程②可获得多个新个体。这利用了细胞的________性。
(6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用________(填字母代号)技术。
A．核酸分子杂交 B．基因序列分析
C．抗原—抗体杂交 D．PCR
8．(2009·上海卷)人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。

(1)目的基因的获取方法通常包括________和________。
(2)上图表示从正常人和患者体内获取的P53基因的部分区域。与正常人相比，患者在该区域的碱基会发生改变，在上图中用方框圈出发生改变的碱基对，这种变异被称为________。
(3)已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域(见上图)，那么正常人的会被切成________个片段，而患者的则被切割成长度为________对碱基和________对碱基的两种片段。
(4)如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460个碱基对的四种片段，那么该人的基因型是________(以P＋表示正常基因，P－表示异常基因)。
9．(2009·福建卷)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点。请回答下列问题。

(1)构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶________，对________进行切割。
(2)培养板中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有________，作为标记基因。
(3)香蕉组织细胞具有________，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中①、②依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的________。
高考真题体验
1．(2012浙江高考６)天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（ ）
A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因B
B.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞
2. (2012高考全国新课标卷40)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）限制性内切酶切割ＤＮＡ分子后产生的片段，其末端类型有　　　和　　　。
（2）质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：

为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是　　　。（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即　　　　　DNA连接酶和　　　　　　　DNA连接酶。
（4）反转录作用的模板是　　　，产物是　　　。若要在体外获得大量反转录产物，常采用　　　技术。
（5）基因工程中除质粒外，　　　　　和　　　　　　也可作为运载体。
（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是　　　　　　　。
3.(2012福建高考３２)现代生物科技专题。肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实验表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图１。

请回答：
（１）进行过程①时，需用 酶切开载体以插入let-7基因。载体应用RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let-7基因转录，该部位称为 。
（２）进行过程②时，需用 酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。
（３）研究发现，let-7基因能影响RAS的表达，其影响机理如图２。据图分析，可从细胞提取 进行分子杂交，以直接检测let-7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中 （RASmRNA/RAS蛋白）含量减少引起的。
４. (2012天津高考7)生物分子间的特异性结合的性质广泛用于生命科学研究。以下实例为体外处理“蛋白质-DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。

据图回答：
（1）过程①酶作用的部位是 键，此过程只发生在非结合区DNA，过程②酶作用的部位是 键。
（2）①、②两过程利用了酶的 特性。
（3）若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要过程③的测序结果与 酶的识别序列进行对比，以确定选用何种酶。
（4）如果复合体中的蛋白质为RNA酶聚合，则其识别、结合DNA序列位基因的
。
（5）以下研究利用了生物分子间的特异性结合的有 （多选）
A.分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNA
B.用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素
C．通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体定位
D．将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟。
５. (2012江苏高考32)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题

（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 连接。
（2）若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma I完全切割，产物中共有 种不同长度的DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 。
6．(2011·四川理综，5)北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是(　　)。

A．过程①获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序
B．将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白
C．过程②构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选
D．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达
7.（2011 •浙江）将ada（腺苷酸脫氨酶基因）通过质粒pET28b导人大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是（　）
A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒
B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点
C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada
D．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子
8．(2010·全国Ⅱ，5)下列叙述符合基因工程概念的是(　　)。
A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因
B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
9．(2010·浙江理综，2)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是(　　)。
A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸
B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
C．将重组DNA分子导入烟草原生质体
D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
10．(2010·江苏卷)下列关于转基因植物的叙述，正确的是(　　)。
A．转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中
B．转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加
C．动物的生长激素基因转入植物后不能表达
D．如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题
11．(2009·浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是(　　)。
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达

学案49 DNA重组技术的基本工具
和基因工程的基本操作程序
答案与解析
基础自查
一．基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
二．基因工程的基本工具
1.限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有专一性。
（3）结果：产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2. DNA连接酶
（1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
（2）与DNA聚合酶作用的异同:
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.载体
（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的是质粒, 其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒
三．基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的获取
１. 反转录法和化学合成法
２.PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）过程：： DNA解链；引物结合到互补DNA链，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步：基因表达载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。
（3） 鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.常用的方法：
a、 农杆菌转化法 基因枪法和 花粉管通道法等。
b、 显微注射技术 受精卵。
C、 大肠杆菌 先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞 ，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
第四步：目的基因的检测和表达
1.转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 DNA分子杂交技术。
2.目的基因是否转录出了mRNA 用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。
3.目的基因是否翻译成蛋白质 转基因生物中提取蛋白质 抗体进行抗原－抗体杂交。
4.个体生物学水平的鉴定。
课堂深化探究
一．对基因工程概念的理解
别名
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程
剪切→拼接→导入→表达
结果
人类需要的基因产物
与杂交育种相比
克服远缘杂交不亲和的障碍
与诱变育种相比
定向改造生物性状
原理
基因重组
二．基因工程的基本操作工具
1．与DNA分子相关的酶
(1)几种酶的比较
种类
项目
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
作用特点
切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上
将DNA
两条链之
间的氢键
打开　　
作用结果
形成黏性末端或平末端
形成重组DNA分子
形成新的DNA分子
形成单链
DNA分子
(2)

① 原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
②DNA连接酶起作用时不需要模板。
2．载体
(1)①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
(2) ①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。
②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。
③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。
(3)①质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。
②λ噬菌体的衍生物。
③动植物病毒。
三．基因工程操作程序
1．(1)目的基因的获取途径
①从自然界中已有的物种中分离出来，如从基因组文库或cDNA文库中获取。
②人工合成目的基因
常用的方法有反转录法和化学合成法。
③利用PCR技术扩增目的基因
通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。
(2)基因表达载体的构建

(3)将目的基因导入受体细胞(转化)
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定
类　型
检测内容
方　法
结果显示

分子
检测

导入检测
目的基因是否进入受体细胞
DNA分子杂交(DNA和DNA之间)
杂交带
转录检测
目的基因是否转录出mRNA
分子杂交(DNA和mRNA之间)
杂交带
翻译检测
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原—抗体杂交
杂交带
个体水平检测
包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同
对应训练
1.【解析】①基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。②工具酶本质为蛋白质，载体本质为小型DNA分子，但不一定是环状。③标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因，表达产物为带颜色物质等。④受体细胞中常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物——大肠杆菌、酵母菌等。一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定能用哺乳动物成熟红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。
【答案】D
2.解析　考查基因工程中工具酶的有关知识。限制性核酸内切酶的化学成分是蛋白质，它的活性受到温度和pH的影响；限制性核酸内切酶的特点是能识别双链DNA中特定的核苷酸序列，可在特定的位点进行切割，但不能识别和切割RNA；限制性核酸内切酶主要是从原核生物体内分离出来的。
答案　C
解析　图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
答案　B
4.【解析】过程①中通过逆转录法获得的目的基因，可用于基因工程，但该目的基因中不存在内含子和非编码序列，因此不能用于比目鱼的基因组测序；将多个抗冻基因编码区相连形成的能表达的新基因可能不再是抗冻基因；利用农杆菌的目的是将重组质粒导入受体细胞，而不是筛选重组质粒；应用DNA探针技术，可以检测受体细胞中是否成功导入了目的基因，但不能检测目的基因是否完全表达。
【答案】B
限时训练
题组一　基因工程及基本操作
1．答案：(1)人工　胰岛素原目的 (2)胰岛素原信使RNA 　逆转录 (3)重组 胰岛素原 (4)将重组DNA分子导入受体细胞
解析:本题是对基因工程操作程序的考查。操作时，首先要获取目的基因，然后让目的基因与载体结合构建成重组DNA分子，再通过一定方法把重组DNA分子导入受体细胞使其扩增和表达
2．C　[限制酶可在特定位点对DNA分子进行切割；DNA聚合酶在DNA分子复制时将脱氧核苷酸连接成脱氧核苷酸链；DNA连接酶可将限制酶切开的磷酸二酯键连接在一起；解旋酶的作用是将DNA双链解开螺旋，为复制或转录提供模板。]
3．ACD　[基因工程经常以抗菌素抗性基因为标记基因；质粒是基因工程常用的运载体；通常用同一种限制酶切割目的基因和运载体，以获得相同的黏性末端；受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。D．为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体
题组二　基因工程的操作程序
4.解析　本题极易出错的部分有：在第(1)小题中没有看清目的基因插入的位置，从而不能确定用限制酶Ⅰ还是Ⅱ来切割质粒还是切割抗虫基因。第(3)小题检测抗虫性状在个体水平上是否表达，应该让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，这个地方也有出错的，主要没有看清是在哪个水平上进行检测的。
在切割质粒时应遵循一个原则：不能同时将两个标记基因切开，至少保留一个，所以只能用酶Ⅱ切割，而从目的基因两侧碱基序列可知，只能用酶Ⅰ才得到含目的基因的DNA片段。如果导入了重组质粒，此时重组质粒中四环素抗性基因能正常表达，而氨苄青霉素抗性基因已被破坏，所以涂布在含有四环素的培养基上，能够生长的话，说明导入了重组质粒(普通质粒)。如果把携带一个抗虫基因的DNA片段看作杂合子，可以认为是Aa，自交产生的F1中仍具有抗虫特性的植株占总数的比例为。把一个细胞培养成一个植株的技术称为植物组织培养。
答案　(1)Ⅱ　Ⅰ　(2)四环素　(3)让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，以确定其是否具有抗虫性状　　(4)植物组织培养　发育成完整个体的全部遗传物质
解析　(1)cDNA来自mRNA的逆转录或根据mRNA的碱基序列人工合成，cDNA文库小于基因组文库。(2)构建基因表达载体用到限制酶和DNA连接酶。将目的基因导入大肠杆菌须用Ca2＋处理受体细胞；导入动物细胞用显微注射法。(3)过程⑧的关键技术是胚胎移植，过程⑨的关键技术是细胞核移植。(4)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即④。
题组三综合题
6.解析　本题综合考查基因工程、细胞工程和PCR技术，意在考查考生对基础知识的理解。胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理可以将动物组织分解成单个细胞；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子、标记基因等，其中启动子和终止子有利于目的基因的表达，标记基因有利于目的基因的检测；PCR技术中需要原料(4种脱氧核苷酸)、缓冲液、模板DNA、引物和耐热DNA聚合酶等；在生物反应器中放入多孔的中空薄壁小玻璃珠的目的：一方面有利于细胞的贴壁生长，避免接触抑制；另一方面有利于气体交换。
答案　(1)胰蛋白(或胶原蛋白)　(2)启动子　终止子
(3)对干扰素基因特异的DNA引物对　TaqDNA聚合酶　(4)