高等教育微生物遗传.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,遗传：,具有一定遗传型的个体在一定的培养条件下生长时，子代培养物会表现出与亲代培养物相同的特征，这就是遗传现象。,变异：,当遗传型发生改变，也就是说当生物体内的遗传物质发生结构上的变化时，生物体就表现出变异现象。,第一节 遗传变异的物质基础,1.,证明遗传物质的三个经典实验,转化实验遗传物质是,DNA;,噬菌体感染实验证明,DNA,是遗传物质，且其中含有合成蛋白质的遗传信息,;,植物病毒重建实验遗传物质是,RNA;,2.DNA,的结构与复制,3.,遗传物质在细胞中的存在方式,细胞水平,细胞核水平,染色体水平,核酸水平,基因水平,密码子水平,核苷酸水平,第二节 微生物的基因突变,广义的突变 染色体畸变,基因突变（狭义突变）,基因突变：,由于,DNA,链中一对或少数几对碱基发生改变，而导致核苷酸序列突然发生稳定的、可遗传的变化。,1.,突变类型,野生型菌株：,具有天然的、非突变性状的微生物。,突变型菌株：,发生了突变的微生物。,1.1,按突变所带来的表型改变,形态突变型,（,如细菌的鞭毛、芽孢或荚膜的有无,）,致死突变型,（合成关键性酶的基因发生突变，表现出致死突变）,条件致死突变,（如温度敏感型）,生化突变,营养缺陷型,（缺乏合成必须营养物质的突变型）,抗性突变型,（对某种外界因素抗性提高）,1.2,按突变的条件和原因,自发诱变,诱发突变,2.,突变的特点,不对应性,自发性,稀有性,独立性,诱变性,稳定性,可逆性,变量实验（,fluctuation analysis,）,Salvador Luria and Max Delbruck,（,1943,）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,结果,:,来自甲管的,50,皿中，各皿间抗性菌落数相差悬殊，而来自乙管的则各皿数目基本相等。,这说明大肠杆菌抗噬菌体性状突变，不是由于环境因素,噬菌体诱导出来的，而是在它们接触噬菌体前，在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。,解释,:,噬菌体在这里仅起到淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。,Newcombe,的涂布实验（,1949,）固体平板培养法,2.,涂布试验,(,1949,年,Newcombe,),结果,:,在涂布过的一组中，共有抗性菌落,353,个，要比未经涂布过的（仅,28,个菌落）高得多。,这也意味着该抗性突变株发生在未接触噬菌体前。噬菌体的加入只起到甄别这类突变是否发生的作用，而不是诱导突变的因素。,解释,:,平板影印,(replica plating)(,1952,Lederberg,夫妇,),实验表明：从未接触链霉素（,str,）的菌株可发生抗性突变，分离可得到纯的,str,r,菌株。,一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法。,1,次接,8,个。,1952,年，莱德伯格,(Lederberg),夫妇设计了一种更巧妙的影印培养试验，直接证明了微生物抗药性是自发产生的，并与相应的环境因素毫不相干。,以上三个实验充分说明了抗性突变是菌体接触所抗物质以前就已经自发产生了，药物并不是诱变因素，含药物的环境只起筛选和鉴别抗性菌株的作用。即使不存在链霉素，抗链霉素的突变株仍然存在。,结论,3.,基因突变的机理与菌种的选育,碱基置换：,由于某种化学诱变剂的作用，使,DNA,分子中一对碱基被另一对碱基所取代。,移码突变：,指诱变剂使,DNA,分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。,碱基置换,a.,转换：,DNA,链中原有的一个,嘧啶,被另一个,嘧啶,所置换，或一个,嘌呤,被另一个,嘌呤,所置换；,b.,颠换：,DNA,链中原有的一个,嘧啶,被一个,嘌呤,所置换，或一个,嘌呤,被一个,嘧啶,所置换；,正常,DNA,链上的三联密码子,第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子,在第二个密码子上缺失一个碱基,A,后引起的变化,移码突变,3.1,诱发突变的机理,诱变剂：,能显著提高突变的几率的物理或化学因子称为诱变剂。,诱变剂的种类很多，作用的方式也多种多样，但其最终都通过改变遗传物质的结构而导致突变的发生。诱变剂作用于微生物细胞后可产生不同的诱变效应，有些诱变剂能产生多种诱变效应。,3.1.1,辐射类诱变,很多波长较短地射线，如紫外线、,x,射线、,射线以及快中子等都有强烈地诱变作用，其中最有效地是波长为,260nm,左右地紫外线。,紫外线作用于,DNA,引起结构的变化：,DNA,链的断链,DNA,分子内和分子间产生交联作用,核酸和蛋白质产生交联作用,形成嘧啶水合物和,嘧啶二聚体（链内或链间）,紫外线的主要作用是使,同链,DNA,的相邻嘧啶,间,形成共价结合的,胸腺嘧啶二聚体。,光复活作用,：经紫外线照射后的微生物暴露于可见光下时，可明显的降低其死亡率的现象。,切割修复作用,：不需要可见光的作用，可以修复因形成嘧啶二聚体或因碱基错配等引起的多种,DNA,损伤。,对紫外线诱变的修复：,切割修复作用,3.1.2,碱基类似物诱变剂,诱变物质通过代谢渗入到,DNA,分子中去间接地引起碱基对的转换。诱发这类变异的化学物质主要是一些碱基的类似物，例如,5-BU,。,3.1.2,碱基类似物诱变剂,(,5-BU,),A:T,A:BUk,(,酮式,),G:BUe,(,烯醇式,),A:T,A:BUk,G:C,G:BUe,G:C,G:C,A:BU,G:C,A:T,A:BU,A:T,A:T,G:C,A:T,G:C,3.1.3,引起,DNA,碱基发生化学变化的诱变剂,直接与,DNA,分子中碱基发生化学反应,，改变这些碱基的性状，使,DNA,在下一轮的复制中出现错误配对现象。例如,:,亚硝酸（氧化脱氨作用）。,G:C,G:U,A:U,A:U,A:T,C:H,T:H,T:A,C:H,C:G,G:C,G:C,T:A,T:A,A:T,C:G,第三节 微生物的基因重组,基因重组：是指遗传物质的重排，也即,DNA,双螺旋直接发生遗传物质的交换。,原核微生物,转化,转导,接合,真核微生物,有性杂交,准性杂交,1.,原核微生物,1.1,转化,:,受体菌直接吸收了来自供体菌的,DNA,片段，通过交换，把该,DNA,片段组合到自己的基因组中，获得了供体菌的部分遗传性状的现象。,（,1,）作为转化过程中的受体菌,：,可以在其细胞壁上吸附外源,DNA,；,可以使吸附的外源,DAN,进入细胞；,细胞内不存在破坏外源,DNA,的酶；,具备将外来的,DNA,进行重组的酶系统,；,（,2,）用于转化的外源,DNA,必须具有较高的分子量，但又不能太大；,完整的双螺旋结构；,在受体菌周围环境中呈可溶的状态；,降解,吸附,切割成,45,10,6,单链入胞,同源部分配对、整合,复制分裂，只有一个子代,DNA,分子获得供体基因,非转化子,转化子,（,3,）转化作用的过程一般是：,1.2,转导,转导：,以噬菌体为载体，将供体菌的部分,DNA,传递给受体菌的过程。需要注意的是，由于噬菌体与其宿主细胞间具有特异性，供体菌和受体菌必须是同种细菌。,普遍性转导,局限性转导,（,1,）普遍性转导,此类转导噬菌体的蛋白质外壳误包供体菌的,DNA,片断具有随机性，传递的基因可以是供体菌染色体的任何一部分。,（,2,）局限性转导,（,2,）局限性转导,1.3,接 合,接合：,是指供体菌与受体菌的完整细胞之间直接接触，并通过特殊的附属物而传递大段,DNA,的过程。细菌的结合作用主要出现在革兰氏阴性细菌中，目前研究最清楚的是大肠杆菌。,F,因子,指细胞内,1,4,个非核的、独立的环状双链,DNA,单位，具有自主复制以及转移到其他细胞中能力。,F,+,菌株：,含有,F,因子的大肠杆菌，其细胞表面有性菌毛，是,F,因子指导合成的，可以用来传递,F,因子；,F,菌株,：,与,F+,菌株相对应的受体菌则不含,F,因子。,2.,真核微生物的基因重组,有性杂交,准性杂交,1.,自发突变与自然选育,在没有人为因素参与的自然条件下，微生物细胞群体能以一定的频率（通常在,10,4,10,11,之间）产生随机突变体。,微生物自身代谢产物的诱变效应,互变异构效应,第四节 微生物的菌种选育,2.,诱变育种,诱变育种：利用物理和化学诱变剂对微生物细胞群体进行适当的处理，使之发生基因突变，并用有效的方法从诱变后的群体中选出优良正突变体，这就是诱变育种。,诱变育种的一般步骤和方法,出发菌株,同步培养,使菌细胞处于相同或接近的生理状态,单细胞（或单孢子）菌悬液的制备,单细胞或单孢子的意义 酵母或霉菌孢子,10,6,/ml,、细菌,10,8,/ml,诱变剂的选择及其剂量的确定,以致死率为,90,99,为宜,诱变处理,物理诱变剂 化学诱变剂,确定出发菌株,菌种的纯化选优,出发菌株的性能鉴定,同步培养,制备单细胞（或单孢子）悬液,活菌浓度测定,诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验,诱变处理,平板分离,计形态变异的菌落数，计算突变率,挑取疑似突变菌落纯培养,突变体的 初步筛选,用简单快捷的方法,重复筛选,摇瓶发酵试验,选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,微生物的诱变育种,2.1,选择出发菌株,出发菌株指的是用于进行诱变育种的原始菌株。,从自然界中直接分离出的野生型菌株,生产中筛选出来的自然突变菌株,诱变处理过的突变菌株,2.2,选择诱变剂与诱变剂量,通常诱变剂的选择：根据经验以及使用的方便与否来选择所使用的诱变剂。在辐射类诱变剂中，紫外线是最常使用的；在化学诱变剂中，硫酸二乙酯、甲基磺酸二乙酯、亚硝基胍等通常效果较好。,2.2,选择诱变剂与诱变剂量,确定诱变剂量：需要考虑多种因素，如诱变剂的种类、处理方式、菌种对诱变剂的敏感程度、菌种的变异特性等。由于各种诱变剂的剂量单位不同，常采用杀菌率来表示各种诱变剂的的相对剂量。,2.3,诱变菌的准备和诱变处理,诱变菌的准备：进行诱变处理之前,一般要先用无菌水将待诱变的菌株制成菌悬液，并使菌悬液中的菌体尽量呈分散的单个细胞状。,诱变处理：根据诱变剂的特性来调整。,2.4,筛选高产突变菌株,由于经过诱变处理的菌株中，发生突变的菌株所占的比例很小，只占存活细胞的百分之几或更少，而发生正突变的菌株所占的比例更小，因此，必须借助于一些简便而有效的手段进行筛选。,2.4,筛选高产突变菌株,初筛：,淘汰大量的负突变株，减轻复筛的工作量，对生产性能测定的准确性要求较低，方法也尽可能地简单易行。,复筛：,要求比较精确地测定方法对有关生产性能进行测定，所使用地培养方法也要尽可能符合实际生产工艺。,二、微生物的诱变育种,变异菌株的初步筛选,纸片培养显色法,透明圈法,琼脂块培养法,常见的微生物突变类型,（,1,）营养缺陷型（,auxotroph,）,一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素,、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些,营养或其前体物（,precursor,）才能生长。,营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和,育种的重要手段,表型判断的标准：,在基本培养基上能否生长,表型,基因型,在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,营养缺陷型（,auxotroph,）特点：,营养缺陷型的表示方法：,表现型：,所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：,his,C,（组氨酸缺陷型，其中的大写字母,C,同一表型中不同基因的突变,）,基因型：,同上，但第一个字母大写，且不用斜体：,HisC,在具体使用时多用,his,C,-,和,his,C,+,，分别表示缺陷型和野生型。,营养缺陷型（,auxotroph,）,影印平板（,Replica plating,）法是,Lederberg,夫妇在,1952,年建立,（,2,）抗药性突变型（,resistant mutant,）,基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,特点：,正选择标记,（突变株可直接从抗性平板上获得,-,在加有相应抗生素的,平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）,表示方法：,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上,“,r,”,表示,str,r,和,str,s,分别表示对链霉素的抗性和敏感性,（,3,）条件致死突变型（,conditional lethal mutant,）,在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死,效应的突变型。,常用的条件致死突变是温度敏感突变，用,ts,（,temperaturesensitive,）,表示，这类突变在高温下（如,42,）是致死的，但可以在低温（如,25-30,）下得到这种突变。,特点：,负选择标记,这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,（,4,）形态突变型（,morphological mutant,）,造成形态改变的突变型,特点：,非选择性突变,突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。,举例：,产蛋白酶缺陷突变株的筛选,菌落颜色变化,半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而,与兰色的非重组子分开。,形成芽孢缺陷菌株,细胞水平上的形态突变，突变株的检出更加困难。,（,5,）其它突变类型,毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用,中具有重要意义突变类型一般都不具有很明显或可直接检测,到的表型。其突变株的获得往往需要较大的工作量。,3.,原生质体融合,(1),(1),(2),(3),(4),3.,原生质体的融,细胞杂交,4.,体外重组,DNA,技术,1.,常用的菌种保藏方法,菌种保藏的一般原理,：根据不同的微生物的代谢特点，人工地创造某些条件，使微生物的代谢处于微弱状态，生长繁殖受到抑制，即让微生物处于休眠状态。,第五节 微生物菌种保藏及复壮,2.1,衰退,:,是指由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变和质变的现象。,2.,菌种的衰退与复壮,常见的菌种退化现象，表现在以下几个方面,:,菌落和细胞形态改变,生产性能的下降,对生长环境的适应能力减弱,防止退化的措施,:,合理的育种,选用合适,的培养基,创造良好的培养条件,限制传代次数,利用不同类型的细胞进行异种传代,采用有效的菌种保藏的方法,2.2,菌种的复壮,复壮,:,从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。,纯种分离,通过寄主进行复壮,联合复壮,