淋巴细胞抗原受体.pptx

抗抗 体体第四节第四节淋巴细胞抗原识别受体的淋巴细胞抗原识别受体的 编码基因及多样性的产生编码基因及多样性的产生n(抗原表位抗原表位)n(T/B细胞克隆细胞克隆)n(TCR/BCR)n(V基因基因)机体存在着特异性识别各种抗原的机体存在着特异性识别各种抗原的T、B细胞细胞克隆，称克隆，称T、B细胞库细胞库,即即TCR、BCR的多样性的多样性 一个机体每一个淋巴细胞是不是具有一个机体每一个淋巴细胞是不是具有这么巨大数量的这么巨大数量的V基因库呢？基因库呢？没有。没有。研究证明：研究证明：不同的不同的V基因实际上是由少数原先分基因实际上是由少数原先分隔的隔的胚系基因胚系基因片段，在淋巴细胞发生片段，在淋巴细胞发生分化分化过程中，通过过程中，通过重排重排(组合、拼接及高频突变组合、拼接及高频突变等等)的过程，从而获得了特异性的的过程，从而获得了特异性的V基因，基因，产生巨大数量特异的抗原受体以识别不同产生巨大数量特异的抗原受体以识别不同的抗原，的抗原，BCR的多样性可达的多样性可达1014，TCR的的多样性可达多样性可达1016。一、一、BCR、TCR基因结构及其重排基因结构及其重排（一）胚系基因结构：（一）胚系基因结构：n n肽链编码基因：肽链编码基因：编码编码V区的基因区的基因，V V区基因的下游是：区基因的下游是：区基因的下游是：区基因的下游是：编码编码C区的基因区的基因n n重链重链V区基因由基因片段：区基因由基因片段：V、D、J拼接拼接n n轻链轻链V区基因由区基因由V、J基因片段拼接基因片段拼接n n互补决定区互补决定区CDR1+CDR2V基因片段，基因片段，大部大部CDR3D，其余其余CDR3J。14号染色体号染色体2号染色体号染色体22号染色体号染色体BACKBCR/IgBCR/Ig的重链的重链V V区基因区基因 是由三是由三种胚系基因片段：种胚系基因片段：V V、D D、J J拼接拼接而成，轻链而成，轻链V V区基因区基因 是由是由V V、J J两个基因片段拼接成的。两个基因片段拼接成的。互补决互补决定区定区CDR1+CDR2CDR1+CDR2V V基因片段，基因片段，大部大部CDR3CDR3D D，其余其余CDR3CDR3J J。C C区的基因在区的基因在V V区基因的下游，区基因的下游，1919个，个，如如H H的的C C基因有基因有9 9个功能性基因个功能性基因。n nC区的基因在区的基因在V区基因的下游，区基因的下游，19个，个，如如H的的C基因有基因有9个功能性基因个功能性基因。n nTCR的的、链是由三种胚系基因片段：链是由三种胚系基因片段：V、D、J 拼接而成，拼接而成，、链基因是由链基因是由V、J 两个基因片段拼接成的。两个基因片段拼接成的。n nV、D、J片段各有多个片段各有多个 一个淋巴细胞中只有一个片段参与组成一个淋巴细胞中只有一个片段参与组成抗原受体抗原受体V区的编码基因区的编码基因14号染色体中号染色体中7号染色体号染色体q7号染色体号染色体pBACKTCRTCR的的、链链是由三种胚系是由三种胚系基因片段：基因片段：V V、D D、J J 拼接而拼接而成，成，、链基链基因是由因是由V V、J J 两两个基因片段拼个基因片段拼接成的。接成的。二、基因重排：二、基因重排：1、重组酶：重组激活酶、末端脱氧核酸、重组酶：重组激活酶、末端脱氧核酸转移酶、转移酶、DNA外切酶、外切酶、DNA合成酶等。合成酶等。2、等位排斥和同种型排斥、等位排斥和同种型排斥 (1)等位排斥：等位排斥：在在一一对对同同源源染染色色体体的的某某一一基基因因座座位位上上，二二条条染染色色体体的的等等位位基基因因中中只只有有一一个个基基因因能能表表达达。保保证证了了一一个个B细细胞胞或或T细细胞胞只能表达一种特异性的抗原受体。只能表达一种特异性的抗原受体。(2)同种型排斥：同种型排斥：表达同一类型肽链的不同基因座位之间表达同一类型肽链的不同基因座位之间的排斥。如表达的排斥。如表达L链的链的链基因在第链基因在第2号染号染色体上，而色体上，而链基因在第链基因在第22号染色体上，号染色体上，在一个细胞内它们不能同时表达，只能在一个细胞内它们不能同时表达，只能表达其中之一，表达其中之一，/，：=65：35。3 3、类别转换、类别转换(同种型转换同种型转换)在在抗抗体体应应答答过过程程中中，B B细细胞胞激激活活后后分分泌泌IgIg的类别发生转换。的类别发生转换。类类别别转转换换主主要要与与同同一一V V区区基基因因与与不不同同重重链链C C区基因重排有关。区基因重排有关。表表表表 达达达达 CHCH的的的的基基基基因因因因片片片片段段段段有有有有9 9个个个个，除除除除 了了了了C C以以以以 外外外外，它它它它们们们们之之之之前前前前都都都都有有有有 一一一一 个个个个DNADNA序序序序 列列列列重重重重复复复复排排排排列列列列的的的的转转转转换换换换区区区区，如如如如要要要要转转转转换换换换某某某某一一一一类类类类别别别别，其其其其上上上上游游游游的的的的C C基基基基因因因因片片片片段段段段即即即即被被被被环环环环出。出。出。出。4 4、BCR(膜型膜型Ig)Ig)和分泌型和分泌型IgIg 在在转转录录时时如如只只转转录录到到SC(分分泌泌性性外外显显子子)，不不能能表表达达疏疏水水性性氨氨基基酸酸残残基基，只只能能分分泌出去。泌出去。如如继继续续转转录录至至MC(膜膜性性外外显显子子)，则则可可表表达达疏疏水水性性的的跨跨膜膜区区和和膜膜内内区区，插插入入细细胞胞膜，作为膜受体。膜，作为膜受体。在转录时如只在转录时如只在转录时如只在转录时如只转录到转录到转录到转录到SCSC(分泌分泌分泌分泌性外显子性外显子性外显子性外显子)，不，不，不，不能表达疏水性能表达疏水性能表达疏水性能表达疏水性氨基酸残基，氨基酸残基，氨基酸残基，氨基酸残基，只能分泌出去。只能分泌出去。只能分泌出去。只能分泌出去。如继续转录至如继续转录至如继续转录至如继续转录至MCMC(膜性外显膜性外显膜性外显膜性外显子子子子)，则可表达，则可表达，则可表达，则可表达疏水性的跨膜疏水性的跨膜疏水性的跨膜疏水性的跨膜区和膜内区，区和膜内区，区和膜内区，区和膜内区，插入细胞膜，插入细胞膜，插入细胞膜，插入细胞膜，作为膜受体。作为膜受体。作为膜受体。作为膜受体。1、组合组合造成的多样性造成的多样性二、多样性产生的机制二、多样性产生的机制2、连接连接造成的多样性造成的多样性CDR3区位于区位于V、J和和V、D、J片段连片段连接处，可丢失或加入数个核苷酸接处，可丢失或加入数个核苷酸(N插入插入)，在末端脱氧核苷酸转移酶作用下，不，在末端脱氧核苷酸转移酶作用下，不需模板，直接加入核苷酸至需模板，直接加入核苷酸至DNA断端，断端，在在V-D-J之间，形成之间，形成VNDNJ，而显著增而显著增加了加了CDR3的多样性的多样性3、体细胞、体细胞高频突变高频突变造成的多样性造成的多样性 外周淋巴组织生发中心内的外周淋巴组织生发中心内的成熟成熟B细胞细胞，在受到在受到抗原剌激后抗原剌激后，已重排好的，已重排好的V区基因区基因(尤尤CDR3)突变频率增高，称体细胞高频突变频率增高，称体细胞高频突变，主要为点突变，非随机性。抗原对突变，主要为点突变，非随机性。抗原对多株高频突变细胞的选择结果，使其表达多株高频突变细胞的选择结果，使其表达的的的的IgV区区CDR(互补决定区互补决定区)与抗原表位与抗原表位的互补性更优于原先分子，即为抗体的的互补性更优于原先分子，即为抗体的亲亲和力成熟和力成熟。克隆选择学说克隆选择学说：Burnet(澳澳)1957年年免疫细胞随机形成免疫细胞随机形成多样性多样性的细胞系的细胞系(克克隆隆,Clone),每一克隆细胞表达同一种每一克隆细胞表达同一种特异特异的识别抗的识别抗原受体，识别相同抗原。原受体，识别相同抗原。胚胎期胚胎期的免疫细胞系接触抗原后，该细的免疫细胞系接触抗原后，该细胞系被排除或失去活性，处于抑制状态，成为胞系被排除或失去活性，处于抑制状态，成为禁禁忌克隆，产生耐受。忌克隆，产生耐受。成熟淋巴细胞可识别外来抗原，成熟淋巴细胞可识别外来抗原，被选择被选择而活化、产生效应。而活化、产生效应。三、淋巴细胞的克隆选择三、淋巴细胞的克隆选择第五节第五节 抗体的功能抗体的功能一、一、一、一、V V区的功能区的功能区的功能区的功能 识别并特异性结合抗原识别并特异性结合抗原识别并特异性结合抗原识别并特异性结合抗原 单体单体单体单体(IgG,IgE)(IgG,IgE)2 2 2 2价价价价 二聚体二聚体二聚体二聚体(分泌型分泌型分泌型分泌型IgAIgA)4 4 4 4价价价价 五聚体五聚体五聚体五聚体(IgM)(IgM)10 10 10 10价（价（价（价（5 5 5 5价）价）价）价）中和效应中和效应中和效应中和效应 中和毒素和病毒中和毒素和病毒中和毒素和病毒中和毒素和病毒 与与与与AgAg结合结合结合结合 促吞噬细胞吞噬促吞噬细胞吞噬促吞噬细胞吞噬促吞噬细胞吞噬1.1.1.1.抗体的结合价抗体的结合价抗体的结合价抗体的结合价2.2.2.2.实际意义实际意义实际意义实际意义二二二二、C C区的功能区的功能区的功能区的功能 1.1.1.1.激活补体系统激活补体系统激活补体系统激活补体系统 Ab(Ab(IgMIgM、IgG)+AgIgG)+AgC1qC1q 补体经典途径补体经典途径补体经典途径补体经典途径 IgG4IgG4、IgAIgA的凝聚物的凝聚物的凝聚物的凝聚物 补体旁路途径补体旁路途径补体旁路途径补体旁路途径 2.2.2.2.介导免疫细胞活性介导免疫细胞活性介导免疫细胞活性介导免疫细胞活性 (1)(1)(1)(1)调理作用调理作用调理作用调理作用(opsonizationopsonization)：IgGIgG+抗原抗原抗原抗原(颗粒性颗粒性颗粒性颗粒性)FcFc R R（单核、巨噬细胞及中性粒细胞）（单核、巨噬细胞及中性粒细胞）（单核、巨噬细胞及中性粒细胞）（单核、巨噬细胞及中性粒细胞）促吞噬细胞吞噬；促吞噬细胞吞噬；促吞噬细胞吞噬；促吞噬细胞吞噬；(2)(2)(2)(2)ADCCADCC：IgGIgG+抗原抗原抗原抗原(靶细胞靶细胞靶细胞靶细胞)FcFc R R（NKNK 细细细细胞）胞）胞）胞）杀伤杀伤杀伤杀伤靶细胞；靶细胞；靶细胞；靶细胞；(3)(3)(3)(3)介导超敏反应介导超敏反应介导超敏反应介导超敏反应：型型型型、型型型型和和和和型超敏反应。型超敏反应。型超敏反应。型超敏反应。3.3.3.3.穿越胎盘和粘膜穿越胎盘和粘膜穿越胎盘和粘膜穿越胎盘和粘膜第六节第六节 各类免疫球蛋白的特性和功能各类免疫球蛋白的特性和功能一一一一、IgGIgG 1.1.1.1.一般特性一般特性一般特性一般特性 (1)(1)(1)(1)单体分子；单体分子；单体分子；单体分子；(2)(2)(2)(2)四个亚类；四个亚类；四个亚类；四个亚类；(3)(3)(3)(3)血清中含量最高血清中含量最高血清中含量最高血清中含量最高(75%(75%(75%(75%IgIg)；(4)(4)(4)(4)半衰期最长半衰期最长半衰期最长半衰期最长(21(21(21(2123232323天天天天)；(5)3(5)3(5)3(5)35 5 5 5岁达成人水平岁达成人水平岁达成人水平岁达成人水平(8.0(8.0(8.0(8.017 17 17 17 mg/mlmg/ml)；(6)(6)(6)(6)可与可与可与可与SPASPA结合。结合。结合。结合。2.2.2.2.生物学活性生物学活性生物学活性生物学活性(1)(1)(1)(1)通过胎盘（新生儿抗感染）；通过胎盘（新生儿抗感染）；通过胎盘（新生儿抗感染）；通过胎盘（新生儿抗感染）；(2)(2)(2)(2)激活补体（裂解细胞）；激活补体（裂解细胞）；激活补体（裂解细胞）；激活补体（裂解细胞）；(3)(3)(3)(3)调理作用调理作用调理作用调理作用（促进吞噬促进吞噬促进吞噬促进吞噬）；）；）；）；(4)(4)(4)(4)介导介导介导介导ADCCADCC（细胞毒作用）。（细胞毒作用）。（细胞毒作用）。（细胞毒作用）。3.3.3.3.实际意义实际意义实际意义实际意义(1)(1)(1)(1)抗感染；抗感染；抗感染；抗感染；(2)(2)(2)(2)自身抗体自身抗体自身抗体自身抗体 自身免疫病；自身免疫病；自身免疫病；自身免疫病；(3)(3)(3)(3)介导变态反应介导变态反应介导变态反应介导变态反应(、型型型型)；(4)(4)(4)(4)封闭抗体封闭抗体封闭抗体封闭抗体 肿瘤细胞逃逸；肿瘤细胞逃逸；肿瘤细胞逃逸；肿瘤细胞逃逸；(5)(5)(5)(5)亲合层析法亲合层析法亲合层析法亲合层析法 IgGIgG纯化；纯化；纯化；纯化；(6)(6)(6)(6)免疫学检测。免疫学检测。免疫学检测。免疫学检测。二二二二、IgMIgM 1.1.1.1.五聚体，分子量最大五聚体，分子量最大五聚体，分子量最大五聚体，分子量最大(900(900(900(900 kdkd)，又称巨球蛋白；，又称巨球蛋白；，又称巨球蛋白；，又称巨球蛋白；2.2.2.2.人类发育过程中最早合成的人类发育过程中最早合成的人类发育过程中最早合成的人类发育过程中最早合成的IgIg；3.3.3.3.体液免疫应答最先产生的体液免疫应答最先产生的体液免疫应答最先产生的体液免疫应答最先产生的 IgIg 感染早期免疫；感染早期免疫；感染早期免疫；感染早期免疫；4.4.4.4.占血清占血清占血清占血清IgIg含量的含量的含量的含量的5 5 5 510%10%10%10%；5.5.5.5.半衰期半衰期半衰期半衰期 5 5 5 5天天天天 血清中特异性血清中特异性血清中特异性血清中特异性IgMIgM 水平增高提示水平增高提示水平增高提示水平增高提示 有近期感染；有近期感染；有近期感染；有近期感染；6.6.6.6.激活补体；激活补体；激活补体；激活补体；7.7.7.7.IgMIgM 不能通过胎盘不能通过胎盘不能通过胎盘不能通过胎盘 脐带血或新生儿血清中脐带血或新生儿血清中脐带血或新生儿血清中脐带血或新生儿血清中IgMIgM 水平升高表明胎儿有宫内感染；水平升高表明胎儿有宫内感染；水平升高表明胎儿有宫内感染；水平升高表明胎儿有宫内感染；8.8.8.8.B B细胞膜细胞膜细胞膜细胞膜IgM(mIgM)IgM(mIgM)体液免疫应答；体液免疫应答；体液免疫应答；体液免疫应答；9.9.9.9.自身抗体自身抗体自身抗体自身抗体 自身免疫病自身免疫病自身免疫病自身免疫病三、三、IgA 1.1.1.1.两种类型两种类型两种类型两种类型 2.2.2.2.半衰期半衰期半衰期半衰期 6 6 6 6天；天；天；天；3.3.3.3.占血清占血清占血清占血清IgIg含量的含量的含量的含量的5 5 5 515%15%15%15%；4.4.4.4.粘膜局部抗感染免疫；粘膜局部抗感染免疫；粘膜局部抗感染免疫；粘膜局部抗感染免疫；5.5.5.5.聚合聚合聚合聚合IgAIgA激活补体替代途径。激活补体替代途径。激活补体替代途径。激活补体替代途径。血清型：血清型：血清型：血清型：IgA1IgA1，单体；，单体；，单体；，单体；分泌型：分泌型：分泌型：分泌型：IgA2IgA2，二聚体，二聚体，二聚体，二聚体,粘膜局部浆细胞合成；粘膜局部浆细胞合成；粘膜局部浆细胞合成；粘膜局部浆细胞合成；分泌片由粘膜上皮细胞合成；分泌片由粘膜上皮细胞合成；分泌片由粘膜上皮细胞合成；分泌片由粘膜上皮细胞合成；Origin of Secretory Component of sIgA 四、四、四、四、IgDIgD 1.1.1.1.单体分子单体分子单体分子单体分子 2.2.2.2.存在形式存在形式存在形式存在形式 分泌型分泌型分泌型分泌型 血清中，功能不清；血清中，功能不清；血清中，功能不清；血清中，功能不清；膜结合型膜结合型膜结合型膜结合型 B B细胞表面细胞表面细胞表面细胞表面,3.3.3.3.意义意义意义意义 （1 1 1 1）是）是）是）是B B细胞成熟的重要标志；细胞成熟的重要标志；细胞成熟的重要标志；细胞成熟的重要标志；（2 2 2 2）抗原受体；）抗原受体；）抗原受体；）抗原受体；4.4.4.4.占血清占血清占血清占血清IgIg含量的含量的含量的含量的1%1%1%1%；5.5.5.5.半衰期半衰期半衰期半衰期 3 3 3 3天。天。天。天。五五五五、IgEIgE 1.1.1.1.单体分子；单体分子；单体分子；单体分子；2.2.2.2.血清中含量最低血清中含量最低血清中含量最低血清中含量最低(占占占占IgIg的的的的0.002%)0.002%)0.002%)0.002%)；3.3.3.3.半衰期半衰期半衰期半衰期 3 3 3 3天；天；天；天；4.4.4.4.呼吸道和胃肠道浆细胞产生；呼吸道和胃肠道浆细胞产生；呼吸道和胃肠道浆细胞产生；呼吸道和胃肠道浆细胞产生；5.5.5.5.介导介导介导介导型超敏反应；型超敏反应；型超敏反应；型超敏反应；6.6.6.6.过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异 性性性性IgEIgE水平增高。水平增高。水平增高。水平增高。第七节第七节 单克隆抗体和基因工程抗体单克隆抗体和基因工程抗体一、多克隆抗体一、多克隆抗体(polyclonalantibody)1.1.定义定义 指由不同指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。免疫血清（含多种特异性抗体）。2.2.实际意义实际意义 （1 1）预防、治疗感染性疾病）预防、治疗感染性疾病 （2 2）临床诊断）临床诊断 二、单克隆抗体二、单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)1.1.定义定义定义定义由单一克隆由单一克隆由单一克隆由单一克隆B B细胞杂交瘤产生的，只识别抗细胞杂交瘤产生的，只识别抗细胞杂交瘤产生的，只识别抗细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。2.2.2.2.特点特点特点特点 具有高度均一性。具有高度均一性。具有高度均一性。具有高度均一性。3.3.3.3.杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 无限增殖；无限增殖；无限增殖；无限增殖；免疫免疫免疫免疫B B B B细胞细胞细胞细胞 合成、分泌特异性抗体。合成、分泌特异性抗体。合成、分泌特异性抗体。合成、分泌特异性抗体。4.4.4.4.杂交瘤技术杂交瘤技术杂交瘤技术杂交瘤技术 HATHAT培养基：次黄嘌培养基：次黄嘌培养基：次黄嘌培养基：次黄嘌(HH),),),),氨基蝶呤氨基蝶呤氨基蝶呤氨基蝶呤(A A)和胸腺嘧和胸腺嘧和胸腺嘧和胸腺嘧 啶核苷啶核苷啶核苷啶核苷(T T)。杂交瘤技术的理论基础杂交瘤技术的理论基础n n淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体n n细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性n n利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAbn n当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。细胞细胞DNA合成途经合成途经1.1.替代途径：次黄嘌呤（替代途径：次黄嘌呤（H H）HGPRTHGPRT2.2.主要途径：主要途径：氨氨 基基 酸酸 鸟嘌呤核苷酸鸟嘌呤核苷酸谷谷 氨氨 酰酰 胺胺 （A-A-）尿核苷单磷酸尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸胸腺嘧啶核苷酸 TKTK3.3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（次要途径：胸腺嘧啶核苷（T T）HAT选择培养基的原理选择培养基的原理n nHAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)抗原免疫的脾细胞抗原免疫的脾细胞抗原免疫的脾细胞抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞 （B B细胞）细胞）细胞）细胞）（B B细胞恶性肿瘤）细胞恶性肿瘤）细胞恶性肿瘤）细胞恶性肿瘤）1.1.抗体分泌（抗体分泌（抗体分泌（抗体分泌（Ig+)1.Ig+)1.具永生性具永生性具永生性具永生性 2.HGPRT+2.HGPRT+在在在在HATHAT生长生长生长生长 2.8-AG2.8-AG筛选出筛选出筛选出筛选出 HGPRT-HGPRT-株株株株 PEG PEG 融合融合融合融合 HATHAT筛选筛选筛选筛选 脾脾脾脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（HGPRT+HGPRT+、Ig+Ig+）融合的结果及命运融合的结果及命运未融合的骨髓瘤细胞未融合的脾细胞杂交瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞 免疫动物免疫动物 培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞 收集致敏的收集致敏的B B淋巴细胞淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞收集骨髓瘤细胞 细胞融合细胞融合 HATHAT选择培养基筛选杂交瘤细胞选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复克隆化培养（反复3-53-5次）次）获得稳定分泌获得稳定分泌McAbMcAb的杂交瘤细胞株的杂交瘤细胞株 McAbMcAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）McAb McAb 纯化及鉴定纯化及鉴定 制备单克隆抗体的基本技术制备单克隆抗体的基本技术1 抗原提纯与动物免疫2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合4 抗体检测5 杂交瘤的克隆化和冻存6 McAB的制备7 单克隆抗体的纯化n n免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。n n可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）冲击免疫（融合前3天进行）n n选用6-12周龄Balb/c小鼠n n颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果好的免疫效果 n n可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 n n目前，用于可溶性抗原目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原特别是一些弱抗原)的的免疫方案也不断有所更新，如免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。n nn n骨髓瘤细胞系选择要点：骨髓瘤细胞系选择要点：n n稳定易培养、自身不分泌稳定易培养、自身不分泌IgIg、融合率高、融合率高、HGPRTHGPRT缺陷株缺陷株n n常用骨髓瘤细胞系有：常用骨髓瘤细胞系有：NS1NS1、SP2SP20 0、X63 X63 等。等。n n保存：防止突变、定期筛选（保存：防止突变、定期筛选（8-8-氮鸟嘌呤）氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎牛血清）防止支原体污染（胎牛血清）n n融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于的形态，活细胞计数高于9595 n n融合比例融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞脾细胞：骨髓瘤细胞=3=3：1 1许多环节许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中隆化和扩大培养过程中 n n常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 n n饲养细胞一般在融合前一天制备饲养细胞一般在融合前一天制备n n免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。n n融合比例：n n骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10n n融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）n n融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液n n克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。n n克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次n n克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法n n阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染n n一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。n n可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。n n克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。n n克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次n n克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法n n阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染n n单抗生产的方法：n n动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。单抗纯化方法：单抗纯化方法：n n盐析n n凝胶过滤n n离子交换层析n n亲和层析法n n辛酸沉淀法n n单抗生产的方法：n n动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。n n单克隆抗体特性n n理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备单克隆抗体在医学中的应用单克隆抗体在医学中的应用n n检验医学诊断试剂检验医学诊断试剂n n（1 1）病原微生物抗原抗体的检测）病原微生物抗原抗体的检测n n（2 2）肿瘤抗原的检测）肿瘤抗原的检测n n（3 3）免疫细胞及其亚群的检测）免疫细胞及其亚群的检测n n（4 4）激素测定）激素测定n n（5 5）细胞因子的测定）细胞因子的测定n n蛋白质的提纯蛋白质的提纯n n肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术基因工程抗体与抗体库技术基因工程抗体与抗体库技术n n单抗体内应用和疗效受限原因：n n1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性n n2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少n n3.生产成本高,难于普及应用n n人杂交瘤技术未获真正突破原因人杂交瘤技术未获真正突破原因:n n融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫随意免疫n n基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。n n抗体库技术：用细菌克隆取代抗体库技术：用细菌克隆取代B B细胞克隆表达抗体，细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。原的单克隆抗体。n n临床上欲开展急性心肌损伤特异性标志物人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的检测项目，现提供给你重组cTnI抗原，请你设计可行性实验方案。三三、基因工程抗体基因工程抗体(geneticengineeringantibody)1.1.1.1.定义定义定义定义 在在在在DNADNA水平对水平对水平对水平对IgIg基因进行切割、拼接或修基因进行切割、拼接或修基因进行切割、拼接或修基因进行切割、拼接或修 饰，导入受体细胞表达的抗体。饰，导入受体细胞表达的抗体。饰，导入受体细胞表达的抗体。饰，导入受体细胞表达的抗体。2.2.2.2.举例举例举例举例 人人人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体(chimericantibodychimericantibody)改型抗体改型抗体改型抗体改型抗体 (reshapedhumanizedantibodyreshapedhumanizedantibody)小分子抗体小分子抗体小分子抗体小分子抗体 双特异性抗体双特异性抗体双特异性抗体双特异性抗体(bispecificantibodybispecificantibody)