高效液相色谱法测定臻源胶囊中金丝桃苷和五味子醇甲含量.pdf

2023 年 8 月第 43 卷第 8 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Aug.2023 Vol.43 No.8 957DOI:10.13463/ki.jlzyy.2023.08.021高效液相色谱法测定臻源胶囊中金丝桃苷和五味子醇甲含量余淑惠1，费文婷1，梁唯灿1，李萃鲜1，王卫茜2，谷洪顺2，王林元1，张建军1*（1.北京中医药大学，北京 100105；2.北京采瑞医药科技研究院，北京 100094）摘要：目的 提升臻源胶囊质量标准，完善其质量控制水平。方法 利用高效液相色谱法（HPLC）测定臻源胶囊中金丝桃苷和五味子醇甲含量。结果 臻源胶囊中金丝桃苷和五味子醇甲平均含量分别为 0.27 mg/g 和0.34 mg/g，平均加样回收率标准偏差值（RSD）分别为 1.63%和 1.69%，方法学考察符合规定。结论 在臻源胶囊现有质量标准的基础上，增加了金丝桃苷和五味子醇甲作为含量测定指标，方法简便可行，结果准确，重现性好，为更好控制臻源胶囊产品质量以及探究功效物质基础提供科学依据。关键词：臻源胶囊；金丝桃苷；五味子醇甲；含量测定；高效液相色谱法 中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1003-5699(2023)08-0957-04Determination of the contents of hypericin and schisandrol methyl in Zhenyuan Capsules by HPLCYU Shuhui1,FEI Wenting1,LIANG Weican1,LI Cuixian1,WANG Weiqian2,GU Hongshun2,WANG Linyuan1,ZHANG Jianjun1*(1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100105,China;2.Beijing Cairui Institute of Pharmaceutical Science and Technology,Beijing 100094,China)Abstract:Objective To improve the quality standard of Zhenyuan Capsules and improve its quality control level.Methods The contents of hypericin and schisandrol methyl in Zhenyuan Capsules were determined by high performance liquid chromatography(HPLC).Results The average contents of hypericin and schisandrin methyl in Zhenyuan Capsules were 0.27 mg/g and 0.34 mg/g,respectively,and the relative standard deviation(RSD)of average recovery was 1.63%and 1.69%,respectively.The methodological investigation conformed to the regulations.Conclusion On the basis of the existing quality standards of Zhenyuan Capsules,hypericin and schisandrin methyl are added as the content determination indicators.The method is simple and feasible,whose results are accurate and whose reproducibility is good,providing a scientific basis for better controlling the quality of Zhenyuan Capsules and exploring the material basis of its TCM efficacy.Keywords:Zhenyuan Capsules;hypericin;schisandrin methyl;content determination;high performance liquid chromatography基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFC1706800）作者简介：余淑惠（1996），女，硕士研究生，主要从事中药药性与药效物质基础及作用机制研究*通信作者：张建军，电子信箱- 臻源胶囊由灵芝、五味子、菟丝子、茯苓、党参和白术配伍而成，具有增强免疫力健脾益肾之功。方中灵芝味甘性平，归心、肺、肝、肾经，补益正气，扶正固本；菟丝子甘平，主入肝、肾、脾经，具有补958 2023 年 8 月第 43 卷第 8 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Aug.2023 Vol.43 No.8 益肝肾，固精缩尿之功；五味子味酸收敛，助菟丝子补肾涩精。茯苓健脾补中，党参益气生津，白术健脾燥湿利水，诸药合用，共奏健脾补肾之功，但目前臻源胶囊仅以粗多糖和总黄酮作为其质量标准，难以切实控制产品质量，反映其功效物质基础。因此，在现有质量标准的基础上，采用 HPLC 法研究建立臻源胶囊中金丝桃苷和五味子醇甲含量测定方法，并进行方法学验证，以期更好地控制产品质量，并为阐明其增强免疫力健脾益肾功效机制内涵提供依据。1 材料1.1 仪器 高效液相色谱仪（沃特世，美国，型号：e2695）；电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：SQP；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-100E）。1.2 试剂 金丝桃苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：J16GB143379），五味子醇甲对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：J10GB151241）；臻 源 胶 囊 无 限 极（中 国）有 限 公 司，批 号：21H07AAB01、21I27BAB01、23A05CBB01；灵芝（批号：KDL19B02），五味子（批号：JHWWZ20210121），菟 丝 子（批 号：TS02201202），茯 苓（批 号：Y21042305），党参（批号：SXH201208），白术（批号：WLBZ201101），D 甘露糖醇（批号：20200312F138M），-环 状 糊 精（批 号：20200524200501），硬脂酸镁（批号：20190809），以上中药饮片及药用辅料由无限极（中国）有限公司提供；阴性对照品（不含五味子、菟丝子的阴性对照品由实验室按产品配方工艺自制）。乙腈（上海星可高纯溶剂有限公司，批号：0114220309）；甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司，批号：0212221102）；磷酸（罗恩试剂，批号：RH297703）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件2.1.1 金丝桃苷色谱条件 色谱柱为 Waters XBridge C18柱（250 mm4.6 mm，5 m）；流动相乙腈-0.1%磷酸水（17:83），流速 1.0 mL/min，进样量为 10 L，检测波长 255 nm，柱温 30。2.1.2 五味子醇甲色谱条件 色谱柱为 Waters XBridge C18柱（250 mm4.6 mm，5 m）；流动相为甲醇-水（65:35），流速 1.0 mL/min，进样量为 10 L，检测波长为 215 nm，柱温 30。2.2 对照品溶液制备 分别精密称取金丝桃苷和五味子醇甲对照品置于容量瓶，加入甲醇制成每 1 mL 含金丝桃苷0.03 mg，含五味子醇甲0.03 mg的对照品溶液。2.3 供试品溶液制备 精密称取臻源胶囊内容物2.00 g，置于 25 mL 容量瓶中，加入 20 mL 甲醇，超声提取 30 min（功率 500 W，频率 40 KHz），放冷，加入甲醇定容至刻度线，离心，取上清，上清过0.22 m滤膜，得供试品溶液。2.4 阴性对照品溶液制备 严格按照工艺要求和配方比例，分别制备菟丝子和五味子阴性对照品，并按“2.3”项下制备阴性对照品溶液。2.5 专属性考察 分别吸取金丝桃苷对照品、供试品、菟丝子阴性对照品溶液各 10 L，按“2.1.1”项下色谱条件进行检测。分别精密吸取五味子醇甲对照品、供试品、五味子阴性对照品溶液各 10 L 按“2.1.2”项下色谱条件进行检测。结果可见，阴性对照品在与供试品中金丝桃苷和五味子醇甲相同保留时间下无干扰峰，表示方法专属性好，见图 1 图 6。图 1 金丝桃苷标准品 HPLC 图图 2 菟丝子阴性样品 HPLC 图图 3 供试品 HPLC 图图 4 五味子醇甲标准品 HPLC 图 2023 年 8 月第 43 卷第 8 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Aug.2023 Vol.43 No.8 959图 5 五味子阴性样品 HPLC 图图 6 供试品 HPLC 图2.6 线性关系考察 分别吸取浓度为 0.007 5 mg/mL、0.015 mg/mL、0.03 mg/mL、0.06 mg/mL、0.12 mg/mL、0.24 mg/mL 的金丝桃苷对照品溶液 10 L 分别注入HPLC 中，按照“2.1.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积。分别精密吸取浓度为0.007 5 mg/mL、0.015 mg/mL、0.03 mg/mL、0.06 mg/mL、0.12 mg/mL、0.24 mg/mL 的五味子醇甲对照品溶液 10 L 分别注入 HPLC 中，按照“2.1.2”项下色谱条件进样分析，测定峰面积。结果以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程和线性范围，结果见表1。各成分在相应浓度范围内与峰面积的线性关系良好。表 1 标志性成分线性关系成分回归方程r金丝桃苷Y=3107X-27 5210.999 8五味子醇甲Y=7107X-26 4460.999 72.7 精密度考察 精密吸取金丝桃苷 0.03 mg/mL 的对照品溶液10 L，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算金丝桃苷峰面积 RSD 值为 0.91%。精密吸取五味子醇甲0.03 mg/mL的对照品溶液10 L，按“2.1.2”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算五味子醇甲峰面积 RSD 值为 1.87%。2.8 稳定性考察 将供试品溶液于室温下放置，分别于 0、2、6、12、18、24 h，按“2.1.1”和“2.1.2”项下色谱条件进样，计算金丝桃苷和五味子醇甲峰面积RSD 值分别为 1.48%和 1.00%。2.9 重复性考察 取同一批臻源胶囊内容物约2.00 g，平行6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.1.1”和“2.1.2”项下色谱条件进样测定，计算得到金丝桃苷和五味子醇甲的峰面积 RSD 分别为1.51%、1.28%，表明该方法重复性良好。2.10 加样回收考察 取同一批臻源胶囊内容物约1.00 g，精密称定，分别按照 1:0.8、1:1 和 1:1.2 的比例加入对照品适量，每个比例平行 3 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.1.1”和“2.1.2”项下色谱条件进样测定，计算得到金丝桃苷和五味子醇甲的加样回收率，结果见表 2 和表 3。2.11 含量测定 按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”项下色谱条件分别测定 3 批样品中金丝桃苷和五味子醇甲的含量，每批样品平行测定 3 次，并计算 RSD 值，结果见表 4。3 讨论 臻源胶囊在中医药理论指导下配伍而成，方中各类成分相互协同，发挥增强免疫力、抗氧化健脾益肾功效。在现有质量标准的基础上，结合中药有效性-物质基础-质量控制标志性成分评价体系1，研究增加金丝桃苷和五味子醇甲为质控成分，并对其检测方法进行方法学考察，完善臻源胶囊的质量控制。金丝桃苷和五味子醇甲分别为菟丝子和五味子的标志性成分。白军等2发现金丝桃苷能够提高免疫抑制小鼠的 T 淋巴细胞亚群水平，调节免疫因子，从而提高机体免疫功能。同时，金丝桃苷可以通过增强过表 2 金丝桃苷加样回收率实验结果称样量/g样品含量/mg对照品加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1.0080.3270.262 0.572 93.5295.741.631.0100.3280.263 0.577 94.821.0050.3270.261 0.575 95.221.0060.3270.327 0.647 98.091.0080.3270.327 0.644 96.711.0070.3270.327 0.640 95.571.0090.3280.393 0.713 98.041.0070.3270.393 0.699 94.661.0080.3270.393 0.701 95.03960 2023 年 8 月第 43 卷第 8 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Aug.2023 Vol.43 No.8 表 4 金丝桃苷和五味子醇甲含量测定结果批号金丝桃苷含量/（mg/g）RSD/%五味子醇甲含量/（mg/g）RSD/%21H07AAB010.279 1.190.3241.090.276 0.3200.282 0.32721I27BAB010.311 0.800.3880.740.308 0.3880.306 0.39323A05CBB010.220 1.050.3111.110.225 0.3070.222 0.304平均值0.270 0.340氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，清除氧化产物 ROS，来抵抗由过氧化氢诱导的氧化应激3。五味子醇甲能够提高免疫力低下小鼠的廓清指数和吞噬指数，促进溶血素抗体的生成，提高机体的免疫力功能4。五味子醇甲还被证实能够提高细胞的抗氧化能力，调节抗氧化系统，提高超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的生物活性，保护由过氧化氢引起的细胞氧化损伤，具有较强的抗氧化作用5-6。本研究主要参考中华人民共和国药典（2020版）规定对臻源胶囊中金丝桃苷和五味子醇甲进行提取和含量测定。在前期实验研究中比较了 50%甲醇、80%甲醇和纯甲醇等不同提取溶剂对金丝桃苷提取分离效果的影响，结果发现纯甲醇的色谱峰性能与分离效果较好。在此基础上，还比较了不同比例（14:86、17:83、20:80）乙腈-0.1%磷酸水对金丝桃苷分离效果的影响。结果发现，比例为17:83时，色谱峰分离度较好，检测时间适中，因此流动相比例确定为乙腈-0.1%磷酸水（17:83）。药典规定金丝桃苷的检测波长是 360 nm，五味子醇甲检测波长是 250 nm，但依据 200 400 nm 波长扫描结果发现金丝桃苷和五味子醇甲分别在 255 nm 和215 nm 处有最大吸收，因此将金丝桃苷和五味子醇甲的检测波长分别确定为 255 nm 和 215 nm。在预实验过程中以乙腈-磷酸水或甲醇-水作为流动相始终无法使金丝桃苷和五味子醇甲在同一条件下时出峰；进一步通过改变流动相比例，进行梯度洗脱时，则发现基线不平稳，故本研究对金丝桃苷和五味子醇甲分开进行含量测定。综上所述，本研究基于药效物质基础，在臻源胶囊已有质量标准的基础上，增加金丝桃苷和五味子醇甲作为含量测定成分，建立复方成分-药效关联的多成分质量控制模式，对臻源胶囊的质量标准进行优化提升，切实控制产品质量，从源头确保其临床疗效的稳定性和有效性，也为阐明臻源胶囊功效物质基础提供依据。参考文献：1 朱映黎,刘磊,张建军,等.高效液相色谱法测定鹿胎丹参白芍颗粒中葛根素、芍药苷及丹酚酸 B 含量 J.世界中医药,2022,17(22):3139-3142.2 白军,李博文,刘淑红.金丝桃苷对小鼠 T 淋巴细胞亚群及血清细胞因子的影响 J.动物医学进展,2017,38(6):48-51.3PIAO M J,KANG K A,ZHANG R,et al.Hyperoside prevents oxidative damage induced by hydrogen peroxide in lung fibroblast cells via an antioxidant effectJ.Biochimica Et Biophysica Acta,2008,1780(12):1448-1457.4 吴伦,陈晓宇,于浩然,等.五味子醇甲的抗炎免疫作用研究 J.现在中医药研究与实践,2017,31(5):18-21.5 周俊杰.五味子醇甲对帕金森细胞模型的保护作用研究 D.大连:大连理工大学,2011.6 王蕾,唐勇,黄山.五味子乙素和五味子醇甲对 PC12 细胞氧化损伤的保护作用 J.中国临床康复,2006(47):64-67,229.（责任编辑：姜文君 收稿日期：2023-06-19）表 3 五味子醇甲加样回收率实验结果称样量/g样品含量/mg对照品加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1.0050.4070.3260.70992.7994.021.691.0080.4080.3270.71293.121.0050.4070.3260.71093.201.0070.4080.4080.79695.241.0080.4080.4080.80597.221.0070.4080.4080.79795.421.0060.4070.4890.86192.711.0050.4070.4880.86593.821.0080.4080.4900.86292.69