增加骨密度评价方法(征求意见稿).doc

附件6：
增加骨密度功能评价方法（征求意见稿）
保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定
Items, Principles and Result Assessment
1试验项目：
动物试验：分为方案一（补钙为主的受试物）和方案二（骨代谢有关的其它功效成份，如以内分泌调节等作用为主的不含钙或不以补钙为主的受试物）两种。方案二仅适用于每日钙摄入量在100mg以下的受试物，其它受试物均采用方案一。
1.1 体重
1.2 骨干重
1.3 骨钙含量
1.4 骨密度
1.5 骨组织病理形态
2 试验原则：
2.3 根据受试样品作用原理的不同，方案一和方案二任选其一进行动物试验。
2.2 所列指标均为必做项目。
2.3 样品使用未批准用于食品的含钙化合物，必须进行钙吸收代谢试验；样品使用属营养强化剂范围内的钙源及来自普通食品的钙源（如可食动物的骨、奶等），可以不进行钙吸收代谢试验。
3 结果判定
3.1 方案一：
a) 生长发育指标（体重、身长、股骨干重）中至少一项显著高于低钙对照组；
b) 股骨骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组，且病理学上（骨组织学结构或钙沉积）两方面结果中的任一方面优于低钙对照组；
c) 进行钙吸收试验时，钙吸收率显著高于低钙对照组，且高剂量组不低于相应钙含量的碳酸钙对照组。
符合以上三项要求，可判定受试物具有“有助于增加骨密度功能”的作用。
3.2 方案二：
受试物试验组的股骨骨钙含量或骨密度显著高于模型对照组，且骨组织形态学指标较去势模型对照组有显著性改善，方可判定受试物具有“有助于增加骨密度功能”的作用。

1
增加骨密度功能检验方法
Method for the Assessment of Increasing
Bone Density Function

有助于增加骨密度功能作用的检验方法根据受试样品作用原理的不同，分为方案一（补钙为主的受试物）和方案二（骨代谢有关的其它功效成份，如以内分泌调节等作用为主的不含钙或不以补钙为主的受试物）两种。方案二仅适用于每日钙摄入量在100mg以下的受试物，其它受试物均采用方案一。
1. 方案一
1.1 实验原理
机体中的钙绝大部分储存于骨骼及牙齿中，若摄入钙量不足会影响机体和骨骼的生长发育。生长期大鼠在摄食低钙饲料的基础上补充受试含钙产品，与低钙对照组比较在促进机体及骨骼的生长发育，增加骨矿物质含量和增加骨密度功能上的作用，从而对受试物“有助于增加骨密度的功能”进行评价。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 仪器：
原子吸收分光光度计、骨密度仪（双能X线骨密度仪或固体密度仪）、精准卡尺、动物解剖器械、105℃烘箱
1.2.2 试剂：
钙含量测定所需试剂（硝酸、高氯酸、氧化镧等）
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物：
出生4周左右的断乳SD大鼠，体重约60-80克，同一性别，每组至少10只。
1.3.2基础饲料配方：
同2003版《规范》（钙含量150mg/100g饲料）即低钙饲料。
1.3.3 动物分组及剂量设置：
实验设三个剂量组，以人体推荐剂量的10倍为其中的一个剂量组，另设计两个剂量组；同时，设低钙对照组。
1.3.4 受试物给予途径及时间：
经口灌胃给予受试物，低钙对照组灌胃给予配样溶剂（去离子水），灌胃量为1ml/100g体重，每天1次。
1.3.5.实验步骤及周期：
出生4周的断乳大鼠经适应3-5天后，禁食16 小时，称体重，按体重随机分组，分笼饲养。动物以基础低钙饲料喂养，并自由饮水（去离子水，以避免从饮水中获得钙）。喂养时间为4周。
试验结束，取双侧股骨，右侧进行骨钙测定，左侧进行骨密度测定，取股骨或肱骨进行骨病理试验。
1.4 观察测量指标
1.4.1生长发育指标：
试验初，禁食16小时后，测定体重，量身长。以后，每周测量体重、身长一次，记录一周摄食量，计算食物利用率；实验末，（处死动物，剥离出双侧股骨）取其中双侧股骨，于105℃烤箱中烤至恒重，称量骨干重。
1.4.2 骨密度测定：（双能X线骨密度仪法/固体密度仪测定法）
第一法：双能X线骨密度测定法
取左侧股骨，双能X线骨密度仪扫描，测定整根股骨的BMD值（g/cm2）。
第二法：固体密度仪测定法
①实验原理：根据阿基米德定律（Archimedean principle）,骨骼在空气和水中的重量之差即为固体在水中受到的浮力,也是骨骼排出水的重量，根据水的密度可求出所排出水的体积，该体积即为骨骼的体积，再由体积和骨骼在空气中的重量即可求出骨骼的密度。
②仪器：固体密度测量仪（SARTORIUS AG LA 120S，Germany产或其它型号固体密度测量仪）。
③测量方法：将烘至恒重的左侧股骨样品放入仪器上部的测量杯里进行测定，得出股骨在空气中的重量，用1ml注射器将蒸馏水注满骨髓腔，然后用吸水纸将股骨表面水吸干，再将股骨样品放入盛蒸馏水的测量杯中进行称量（读数时间均控制在从股骨浸水开始计20秒左右），得到股骨在蒸馏水中的重量。
据下式求出股骨密度：
ρ（g/cm3）=
式中: ρ为股骨的密度；W(a)为股骨在空气中的重量；W(fl)为股骨在蒸馏水中的重量；ρ(fl)为蒸馏水的比重。
1.4.3骨钙含量测定：
用原子吸收法或化学法对恒重的左侧股骨进行消化测定。
1.4.3.1 样品采集与制备
1.4.3.1.1 饲料样品经均匀混合并过20目筛，在烘箱中烘干，置干燥器中冷却后称重，磨细。注意防止在样品制备过程中的污染。
1.4.3.1.2 取大鼠一侧股骨在105℃烘箱中烘干至恒重后，置于三角瓶中进行消化。
1.4.3.2 样品消化
根据样品中钙的含量，准确称取0.300~1.00克，置于150mL三角瓶 中，上盖小漏斗，加入混合酸（硝酸：高氯酸=4：1）15~20mL，在电热板上加热消化直至冒白烟并透明无色。酸液不够时可以再加入少量混合酸。消化液透明无色后加数毫升去离子水，煮沸以赶除剩余的酸，重复两次，最后消化液的体积不超过1mL。
消化样品时应同时作空白试验，加入与样品消化时相同体积的混合酸，在相同条件下消化。
1.4.3.3 测定
按照原子吸收分光光度计仪器说明书的步骤进行。测定液、标准溶液和空白均用0.5%氧化镧溶液稀释，定容。
1.4.4 骨组织病理形态学检查：（详见附录1）
取股骨或肱骨，经脱钙切片制片、染色后，镜下观察。
1.4.4.1 HE常规染色——观察骨结构完整性：
观察指标：骨板及骨小梁（数量减少/变薄变细/间隙增宽/疏松断裂），破骨细胞（增多/减少），成骨细胞（增多/减少），及其他改变。
评分计算：按评分标准，对各项观察指标打分，每只动物计算各项指标的总分。
1.4.4.2 茜素红染色——观察钙沉积情况：
钙质沉积呈橘红色，其它呈复染色（淡绿色）。按评分标准打分。
1.5 钙吸收代谢实验：（详见附录2）
样品使用未批准用于食品的含钙化合物，必须进行钙吸收代谢试验；样品使用属营养强化剂范围内的钙源及来自普通食品的钙源（如可食动物的骨、奶等），可以不进行钙吸收代谢试验。
1.6 数据处理及结果判定：
1.6.1 数据处理：
实验数据采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值>F0.05，P≤0.05，再用各个实验组与低钙对照组的均数进行两两比较方法统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验。
1.6.2 结果判断原则为：
a) 生长发育指标（体重、身长、股骨干重）中至少一项显著高于低钙对照组；
b) 股骨骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组，且病理学上（骨组织学结构或钙沉积）两方面结果中的任一方面优于低钙对照组；
c) 进行钙吸收试验时，钙吸收率显著高于低钙对照组，且高剂量组不低于相应钙含量的碳酸钙对照组。
符合以上三项要求，可判定受试物具有“有助于增加骨密度功能”的作用。
2 方案二
2.1 实验原理
雌性成年大鼠切除卵巢后，骨代谢增强，并发生骨重吸收（破骨）作用大于骨生成（成骨）作用的变化。这种变化表现为骨量丢失，经过一定时间的积累，可以造成骨密度降低模型。在建立模型的同时或模型建立之后给模型实验组大鼠补充受试样品，通过受试物抑制破骨或促进成骨等骨代谢调节作用，观察其在增加骨密度及骨钙含量的效果，从而对受试样品增加骨密度的功能进行评价。
2.2 实验动物
3月龄SD成年雌性大鼠，去势手术前适应3-5天。
2.3 仪器和试剂
2.3.1 仪器：同方案一
2.3.2 试剂：同方案一
2.4 实验设计和实验剂量
2.4.1 去卵巢骨密度降低模型
大鼠经腹腔注射30mg/kg•bw的戊巴比妥钠溶液麻醉，行去势手术，摘除双侧卵巢；另取部分大鼠行类似手术但不切除双侧卵巢，仅摘除部分脂肪。
2.4.2 动物分组及剂量设置
实验设三个剂量组，以人体推荐剂量的10倍为其中的一个剂量组，另设计两个剂量组；同时，设溶剂对照组和假手术组，必要时可设阳性对照组（建议：雌二醇1.0mg/kg）。手术后大鼠经适应性饲养3-5天后分组，实验动物按体重随机分组，每组至少10只。
2.4.3 受试物给予和实验周期
三个剂量组灌胃给予受试物，溶剂对照组和假手术组灌胃给予溶剂（去离子水）。灌胃剂量为1ml/100g体重，每天1次。动物自由饮水和基础饲料（同原规范中的方案二）。喂养时间为12周。试验末取大鼠双侧股骨测定。
2.5 观察指标
2.5.1 体重：每周测量一次。
2.5.2 股骨干重、骨钙测定：同方案一，取右侧股骨进行原子分光光度仪分析。
2.5.3 骨密度测定：同方案一，取左侧股骨进行双能X线方法或是固体密度仪方法测定。
2.5.4 骨组织病理学检查：同方案一，取股骨或肱骨进行。
2.6 数据处理和结果判定
实验数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
结果判断原则为：
受试物试验组的股骨骨钙含量或骨密度显著高于模型对照组，且骨组织形态学指标较去势模型对照组有显著性改善，方可判定受试物具有增加骨密度功能的作用。
15
附录1：
骨组织病理检测方法
1. 原理
动物骨组织通过化学固定剂（甲醛）的作用，较好地保存原有的形态结构，根据试验要求合理切取厚度0.5cm左右骨片，经脱脂、脱钙、脱水剂处理，以二甲苯透明及融熔石蜡浸渗，将组织包埋成蜡块。用切片机切成4～5μm左右的薄片，在温水中展平用载玻片贴上。经60℃烘烤后进行常规苏木素－伊红染色，使细胞核和细胞浆染上不同的颜色。或者切片脱蜡后，进行茜素红S特殊染色。因茜素红S与钙质形成的螯合物双折射为橘红色。最后用树胶封固后，以光学显微镜观察评价。
2. 仪器
全自动脱水机、包埋机、切片机、全自动染色机、双筒电光源显微镜
3. 试剂与材料
10％中性甲醛水溶液、无水乙醇、二甲苯、石蜡、苏木精、伊红Y 、载玻片、盖玻片、三氯甲烷、甲酸－鳌合剂脱钙液、茜素红S液、醋酸液、淡绿液
4. 组织制片操作步骤
4.1 标本固定
动物解剖后，取出股骨，去除表面软组织。在中性甲醛固定液固定两天，液体量一般为组织总体积的10～20倍。
4.2 脱脂
流水冲洗30分钟后，放入三氯甲醛脱脂7小时，液体量一般为组织总体积的10～20倍，如果中间液体混浊，需更换。
4.3 脱钙
甲酸－鳌合剂脱钙2天，液体量一般为组织总体积的20～30倍。
4.4 取材
通过针戳、手掐、扭曲等方法来测定骨组织硬度，判断脱钙情况。股骨中间一分为二，分别做矢状（纵剖）切开，修切厚度约为5mm左右。
4.5 脱水及浸蜡
流水冲洗约6小时后，乙醇脱水：经过50%→75%→85%→95%→100%，逐步将组织块中的水分置换出来。
4.6 包埋
使用熔点56℃的石蜡，用模具包埋后放在冷冻台或者4℃冰箱冷冻成型。
4.7 石蜡切片
切片机将组织块切成4～5μm厚切片。
4.8 H.E染色（常规染色）
脱蜡→染色→脱水透明→中性树胶封固。
4.9 特殊染色（Dahl-McGec-Russell 茜素红S法）
具体步骤详见附件1“骨组织特殊染色（Dahl-McGec-Russell 茜素红S法）程序”。
5． 结果判定
H.E观察指标：骨皮质（增厚、变薄、疏松）， 骨小梁（减少、变细、疏松、断裂）， 破骨细胞（增多、减少），成骨细胞（增多、减少），炎症反应，软骨退变及其他改变。茜素红S法染色观察指标：钙质沉积呈橘红色，其它呈复染色（淡绿）。

附件1
骨组织特殊染色（Dahl-McGec-Russell 茜素红S法）程序
1. 切片脱蜡（具体步骤如下）
① 烘片 59分
② 二甲苯I 5分
③ 二甲苯II 5分
④ 100%乙醇 3分
⑤ 95%乙醇 3分
⑥ 85%乙醇 2分
⑦ 自来水 2分
2. 染色：
① 入茜素红S液中10分
② 蒸馏水速洗
③ 淡绿液复染20～30 秒
④ 醋酸液速洗
3. 脱水：无水酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ快速脱水（脱色）
4. 透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ透明
5. 中性树胶封固

附件2
表 骨病理镜检记录
病变

组别
HE染色
总积分
钙沉积特染——茜素红S法
骨皮质变薄
骨小梁
成骨细胞减少
破骨细胞增多
炎症反应
软骨退变
减少
变细
疏松
断裂
低钙对照组

低剂量组

中剂量组

高剂量组

碳酸钙对照组

评分标准：
① “0”分表示H.E染色结果基本正常，或是茜素红S染色阴性；
② “1”分表示H.E染色结果偶见轻微病变，或是茜素红S染色疑似阳性；
③ “2”分表示H.E染色结果轻度病变，或是茜素红S染色弱阳性，范围≦1/4视野；
④ “3”分表示H.E染色结果中度病变，或是茜素红S染色中等阳性，范围≦1/2视野；
⑤ “4”分表示H.E染色结果重度病变，或是茜素红S染色强阳性，病变范围≧3/4视野；
⑥ 如观察结果在“0~1”之间，则可记为“0.5”分，依次类推。

附录2
钙吸收代谢实验
1. 动物及分组：
出生4周左右的断乳SD大鼠，体重约60-80克，同一性别，每组至少6只。
2. 剂量设计：
实验设三个剂量组，以人体推荐剂量的10倍为其中的一个剂量组，另设计两个剂量组；同时，设低钙对照组和与相应剂量受试物钙水平相同的碳酸钙对照组（如仅设一个碳酸钙对照组，推荐设立与高剂量钙水平相当的碳酸钙对照组）。
3. 喂养：
大鼠经适应3-5天后，分笼饲养4周。每周测量身长、体重一次。用低钙对照组的基础低钙饲料（150mg/100g饲料）配制受试物各剂量组和碳酸钙对照组饲料。动物自由饮食，每周称量动物食物消耗量，计算食物利用率。动物自由饮用去离子水。
4. 代谢实验：
实验进行到第四周前三天进行钙代谢实验，记录3天摄食量（g/3d），收集3天的粪便，测定饲料及粪便中钙含量。测定方法用原子吸收分光光度法进行测定。
5. 计算：
摄入钙（mg/d）= 饲料中钙含量（mg/g）× 饲料消费量（g/d）
粪钙（mg/d）= 粪便中钙含量（mg/g）× 粪便排出量（g/d）
钙表观吸收率=（摄入钙 — 粪钙）/摄入钙*100%。
6. 数据处理及结果判定：
6.1 数据处理：
实验数据采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值>F0.05，P≤0.05，再用各个实验组与低钙对照组的均数进行两两比较方法统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验。
6.2 结果判断原则：
6.2.1 动物喂养4周时，受试物剂量组的动物身长、体重如显著低于相同钙摄入水平的对照组的，或受试物剂量组的钙吸收率显著低于相同钙摄入水平碳酸钙组的，则判定为不能作为补钙产品。
6.2.2 受试物剂量组钙吸收率如不低于相同钙摄入水平的碳酸钙，可认为受试物的吸收率较好。

增加骨密度功能评价方法修订说明
一、承担单位
本功能修订方案是受国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司委托，由上海市疾病预防控制中心作为主要负责单位起草，由四川大学公共卫生学院和东南大学共同参与验证完成。上海市疾病预防控制中心是中华人民共和国卫生部颁布的“保健食品功能评价程序和检验方法1996”和“保健食品检验与评价技术规范2003年版”的起草单位之一，因此在保健食品功能评价检验方法技术规范的制定中有很好的基础和经验。
二、主要工作过程
为了做好技术规范的制定工作，国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司（简称保化司）于2009年4月召开了“保健食品功能评方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院东直门医院和国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家近15人，会上对“保健食品功能评方法及有关程序修订”修订的原则和框架作了充分的讨论，在讨论稿的基础上，又分别征求了相关专家的意见，提出具体修订方案。在广泛征求各检验机构意见的基础上，上海市疾病预防控制中心迅速抽调人员查阅中外文献，开展现场调研，总结工作经验，针对发现的问题，内部经过多次讨论，针对《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中“增加骨密度功能”标准提出意见：两个试验方案的划分原则不明确；缺乏观察骨量变化和骨组织显微结构变化的指标。
2009年10月，上海市疾病预防控制中心邀请了浙江疾控中心和江苏疾控中心的同行和专家召开了专题的讨论会，形成初步修订意见。又将初步修订方案以电邮方式请四川大学和东南大学等多家单位的专家提意见和建议。经多方反复讨论后，由上海市疾病预防控制中心作为主要负责单位草拟修订方案，由上海市疾病预防控制中心、四川大学和东南大学三家单位共同参与验证工作。
2010年，上海市疾病预防控制中心先后三次，组织两家验证单位和多家兄弟单位专家和同行，针对验证过程中存在的技术问题及可操作性作了充分讨论，对“有助于增加骨密度检验方法”修订方案做了进一步完善。
保化司于2010年8月再次召开了“保健食品功能评方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院西苑医院的专家近10人，会上针对验证过程中存在的技术问题及可操作性作了充分讨论，上海市疾病预防控制中心对“增加骨密度功能评价程序与检验方法”修订方案做了进一步完善。
保化司于2011年7月第三次召开了“保健食品功能评价方法及有关程序修订”专家研讨会，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京大学、北京市疾病预防与控制中心、上海市疾病预防控制中心、中国中医研究院西苑医院、北京医院、中国中医科学院中药研究所、国家食品药品监督管理局保健食品评审中心的专家十余人，会上针对验证过程中存在的技术问题及可操作性作了充分讨论，根据我国保健食品管理政策、要求和检验机构水平、实际可操作性等国情，上海市疾病预防控制中心对“增加骨密度功能评价程序与检验方法”修订方案做了更进一步完善，最终形成了本征求意见稿。
三、编制原则
1．合法性原则：修订工作符合国家相关法律法规并遵循相关管理部门的政策要求。
2. 科学性原则：修订工作遵循科学性的原则，广泛征求相关领域专家的意见并进行文献调研，各项技术指标应具有科学依据并经科学验证。
3. 先进性原则：注意国内管理部门发布的新管理措施，兼顾了技术发展的前瞻性。
4. 实用性原则：从保护公众身体健康的角度出发，充分考虑国情，兼顾我国保健食品功能检测机构的水平，对内容进行客观量化和具体明确化，尽量提高可操作性。
5．协调性原则：尽可能与本规范的其他部分一致，注意合理性与有效性、通俗性和规范性之间的关系。
四、确定相关技术内容及新旧技术规范的对比
改动点
原方法
现方法
修订理由
项目名称
增加骨密度功能检验方法
“有助于增加骨密度功能”检验方法
这样的表述更清楚，功效目标更明确。
两种方案的选择原则
受试物每日钙含量400mg为分界线。大于400mg做方案一；小于400mg做方案二。
方案二仅适用于每日钙摄入量在100mg以下的受试物，其它受试物均采用方案一。
这样更便于受试物在两种方案中的选择，尽量减少“模棱两可”情况发生，对于功能效果的解释更直接明了。
方案一
实验周期
喂养时间为12周”
喂养时间为4周
4周即可表现出与低钙对照组比较，生长发育、骨密度、骨钙、骨病理等指标的变化。
试验周期缩短为4周，降低人力物力的成本和损耗、提高工作效率、增加社会效益。
生长发育指标
仅测“体重、股骨重量”
新增“身长”
结合体重指标，更全面反映动物生长发育情况。因为方案一是作用于刚断乳大鼠，若摄入钙量不足会影响机体和骨骼的生长发育。
骨密度
测定方案
骨密度仪测定
新增可选方案：固体密度仪测定法
新方法与老方案的可比性较好。该方法简单，易操作，不需要大型仪器。
各实验室可根据实际条件，选择不同仪器，进行骨密度测定；可以使更多的实验室能开展该项功能的评价。
骨密度
测量点
股骨“远心端”和“中点”两个测量点
整根股骨
的平均骨密度
避免了“测量点”选择的主观误差，更简便、直观。
骨病理形态学检测
无
有
国内外研究的骨质疏松的指标中骨量变化和骨组织显微结构变化是两项主要的指标。综合考虑各指标的稳定性、可行性和可操作性后，在原有的骨密度和骨钙含量等相对成熟的指标基础上，增加骨组织形态学指标。这样能更全面、更客观地反映保健食品增加骨密度的作用。
其中骨小梁的变化最明显。
方案二
骨密度
测定方案
骨密度仪测定
新增可选方案：固体密度仪测定法
同方案一
骨密度
测量点
股骨“远心端”和“中点”这两个测量点
整根股骨
的平均骨密度
同方案一
骨病理形态学检测
无
有
同方案一