固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定海水中14种喹诺酮类抗生素.pdf

第 卷 第 期化 学 研 究 年 月 固相萃取超高效液相色谱三重四极杆质谱法测定海水中 种喹诺酮类抗生素宋晓娟，李婷婷，赵颖，杨维英（江苏省连云港环境监测中心，江苏 连云港）收稿日期：基金项目：江苏省 年环境监测科研基金项目计划（）作者简介：宋晓娟（），女，高级工程师，主要从事环境监测及有机分析方法研究。通信作者，：摘 要：本研究采用固相萃取超高效液相色谱三重四极杆质谱联用技术，建立了海水中 种喹诺酮类抗生素的分析方法。将海水样品调至，加入 ，经 固相萃取柱富集后，用甲醇洗脱，采用多反应监测模式进行检测。结果表明，种喹诺酮类抗生素标准溶液线性关系良好，相关系数在 之间，以清洁海水为基质进行高、低浓度加标实验，回收率在 之间，精密度在 之间，符合质控要求。该方法检出限在 之间，能够满足痕量分析要求。实样分析表明，该方法能够成功应用于海水中痕量喹诺酮类抗生素的分析，方法稳定可靠。关键词：喹诺酮类抗生素；固相萃取；超高效液相色谱串联质谱；海水中图分类号：文献标志码：文章编号：（）（）（），（），：；（）；（）；近年来，医药和个人护理化学品（，）作为一类新型污染物受到广泛关注，抗生素是一种常见的，广泛用于疾病治疗、畜牧业及水产养殖等行业，残留的抗生素可通过污水处理厂出水、医药废水、养殖废水等多种途径进入环境，环境中的抗生素可诱导细菌出现抗药性，影响生态平衡，引起 人 体 过 敏 反 应，增 加 人 类 癌 症 发 病 风 险等。海洋是人类活动排放污染物的一个重要的“汇”，人类产生的大部分抗生素最终会通过污水排：化学研究，（）：化 学 研 究 年放、地表径流等途径汇入海洋，或者通过海水养殖等产业，直接排放入海。近年来，我国近岸海域中抗生素被频繁检出，浓度大多在痕量级别（）。总体而言，海洋抗生素的研究程度远不及淡水，主要原因是分析方法不如淡水研究广泛。已有报道中，固相萃取液质联用技术因灵敏度高、抗干扰能力强，是目前最常用的分析手段。杜鹃等建立了养殖海水中 种抗生素的分析方法，检出限范围为 ，回收率在 之间；姜明宏等建立了海水中 种抗生素的分析方法，定量限范围为 ，回收率在 之间；孙晓杰等建立了海水中 种抗生素残留的分析方法，方法检出限范围为 ，回收率在 之间。这些方法的研究对象大致包括了磺胺、喹诺酮（，）、四环素等多种类型的抗生素，种类虽然较全，但每一类别涵盖的化合物数量相对较少，不能全面反映海洋抗生素的污染状况。本研究选择 种 抗生素为研究对象，以固相萃取超高效液相色谱三重四极杆质谱联用技术为基础，建立了海水样品中 的分析方法。是一类化学合成的广谱抗菌药物，价格低廉、应用广泛，目前对其研究主要关注氧氟沙星、诺氟沙星等少数化合物，对萘啶酸、恶喹酸等研究较少。本研究建立的分析方法涵盖了 种 化合物，并采集连云港典型入海河口样品进行分析，为全面了解连云港河口海域 抗生素的污染水平提供依据。实验部分 仪器、材料与试剂 仪器与材料 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪（，美国 公司）；全自动固相萃取仪（，中国睿科公司）；计（，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）；超声波清洗器（，上海科导超声仪器有限公司）；涡旋混合器（，美国 公司）；固相萃取小柱（，技迩（大连）科技有限公司）；固相萃取小柱（，技迩（大连）科技有限公司）；玻璃纤维滤膜（直径：、孔径：，英国 公司）；针式过滤器（直径：、孔径：，美国颇尔公司）。试剂抗生素标准溶液：甲醇中 种 化合物（，上海安谱实验科技股份有限公司），具体成分：萘啶酸（，）、恶喹酸（，）、氟甲喹（，）、西诺沙星（，）、吡 哌 酸（，）、诺 氟 沙 星（，）、依 诺 沙 星（，）、环丙沙星（，）、培氟沙星（，）、洛美沙星（，）、达氟沙星（，）、恩诺沙星（，）、氧 氟 沙 星（，）、沙拉沙星（，）。内标溶液：甲醇中诺氟沙星（），上海安谱实验科技股份有限公司）。其他试剂：甲醇（色谱纯，美国 公司）；乙腈（色谱纯，美国 公司）；甲酸（，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；纯水（纯水机制备）。标准溶液的配制：抗生素标准溶液用甲醇稀释成 中间使用液，与 内标溶液合并稀释至所需浓度，稀释溶剂：（体积比）的 乙酸铵溶液与 的乙腈溶液以 体积比混合。样品采集与处理 年 月，选择连云港 个典型入海河口，分别采集涨潮与落潮表层海水样品（），每次采集 海水置于棕色玻璃瓶中，以下冷藏避光运输，实验室 内完成处理。水样用 玻璃纤维滤膜过滤，准确量取 待处理，滤膜用 甲醇超声萃取 ，萃取液合并至过滤后的水样中。水样用盐酸溶液（）调 为 左右，加入 ，静置反应 。固相萃取条件：依次用 甲醇、超纯水活化 小柱，以 的流速上样，用 超纯水淋洗，氮气吹扫小柱 。然后用 甲醇进行洗脱，收集洗脱液，用微弱氮气吹至近干，用 所述的稀释溶剂定容至 ，加入 内标。处理好的样品密封避光储存于，内进行分析。仪器条件 色谱条件 色谱柱类型：型色谱：化学研究，（）：第 期宋晓娟等：固相萃取超高效液相色谱三重四极杆质谱法测定海水中 种喹诺酮类抗生素 柱（，）；流动相：的 乙酸铵溶液；流动相：的乙腈溶液；流速：；进样量：；梯度洗脱：，；，；，；，；，；，。质谱条件离子源：电喷雾离子源，正离子模式（）扫描；毛细管电压：；脱溶剂气温度：；脱溶剂气流速：；锥孔气（氮气）流速：；扫描方式：多反应监测（）扫描模式。通过优化得到各目标物的质谱参数如表 所示。表 种 抗生素的质谱参数 ，质量保证与质量控制）实验室空白：每次至少分析一个实验室空白，目标物浓度应低于方法检出限。）校准曲线：相关系数应，每 个样品或每批（个 批）分析校准曲线中间点的浓度，测定结果相对误差应在以内，否则应重新建立校准曲线。）每 个样品或每批（个 批）分析一个基体加标，加标回收率在 之间，同时分析基体加标平行，测定结果相对偏差在以内。）每 个样品或每批（个 批）分析一个平行样，测定结果相对偏差在以内。）定性要点：样品中目标物的保留时间与标准溶液中对应物质保留时间的相对偏差在以内；将样品中目标物定性离子的相对丰度与浓度相近标准溶液中对应定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表 规定的范围，则可判断样品中存在对应的目标物。表 样品与标液对应定性离子相对丰度的最大允许偏差 定性离子相对丰度允许的最大偏差，结果与讨论 方法优化 色谱条件的优化 本研究比较了三种流动相对 抗生素分析的影响：水溶液甲醇（流动相）、水溶液 乙腈溶液（流动相）、的 乙酸铵溶液 乙腈溶液（流动相），分别对 的标准溶液进行分析，各物质的峰面积如图 所示。流动相对 抗生素的分析效果并不好，、和：化学研究，（）：化 学 研 究 年等物质峰形较差，拖尾严重。由于乙腈对有机物的洗脱能力相对更强，因此用乙腈代替甲醇，并适当增加了甲酸含量，以进一步提高离子化效率，在流动相的条件下，部分物质峰形明显变好，响应值也有所升高，但仍有、等少数物质峰形较差。最后，在 水溶液中加入低浓度的乙酸铵，获得了最佳分析效果，种 抗生素均具有平滑对称的峰形，而且所有物质响应值均有不同程度的提高。由图 可知，、等物质的响应值较流动相提高了 ，、等物质的响应值甚至提高了 倍。因此，最终选择流动相作为分析 抗生素的最佳流动相，优化后的总离子流图如图 所示。注：、和 三种物质所示峰面积为实际值的 倍图 种 抗生素（）在三种流动相下的峰面积 （）注：；号物质的响应值对应左纵轴，号物质的响应值对应右纵轴图 种 抗生素（）的总离子流色谱图 （）固相萃取条件的优化固相萃取条件主要考虑两个重要参数：萃取小柱和洗脱溶剂。本研究考察了两种固相萃取小柱的富集效果：和，填料由亲脂性二乙烯苯和亲水性 乙烯基吡咯烷酮按一定比例聚合而成，通过亲水与疏水相互作用，实现不同极性化合物的萃取。是阴离子交换柱，主要通过强离子置换弱离子实现目标物的吸附和洗脱。取清洁海水样品（采集于连云港海州湾达山岛周边海域，下同）加标 ，分别用两种小柱开展回收率实验，其他条件同 节。由图 可知，小柱的富集效果明显较好，除 外，其余 种物质在 小柱上的回收率均有不同程度的提高，其中，、和 的回收率分别提高了 、和，种 抗生素的回收率均在 之间，因此，最终选择 小柱对 抗生素进行：化学研究，（）：第 期宋晓娟等：固相萃取超高效液相色谱三重四极杆质谱法测定海水中 种喹诺酮类抗生素 富集。图 不同固相萃取柱对 种 抗生素回收率的影响（）（）为实现目标物最大程度的洗脱，本研究比较了甲醇、乙腈、氨水甲醇三种溶剂的洗脱效果。取清洁海水样品加标 ，其他条件同 节。结果表明，乙腈的洗脱效果最差，种 的回收率在 之间，甲醇的洗脱效果明显好于乙腈，种 的回收率均有不同程度的提高，平均值在 之间。另外，许多研究表明，氨水甲醇也具有较好的洗脱效果，本研究结果表明，氨水甲醇的洗脱效果好于乙腈，但明显不如甲醇，大部分物质的回收率低于甲醇洗脱，而且标准偏差更高，不确定性更强，因此最终选择甲醇作为 抗生素的洗脱溶剂。图 洗脱溶剂对 种 抗生素回收率的影响（）（）水样预处理条件的优化吕敏等综述了海水中抗生素分析的样品前处理技术，指出重金属可与 抗生素发生络合作用，一般常用 络合重金属，以提高萃取效率。同时 也是影响回收率的关键因素，可以影响抗生素在样品中的存在形态、稳定性以及与萃取柱填料之间的相互作用，从而影响萃取效果，因此，水样预处理条件主要考虑两方面因素：加入量和水样的。分别向 的加标样中加入、和 ，进行回收率实验。结果表明，随着 量的加大，的回收率有所提高，但加入量过高，回收率反而下降，说明适量 的能够络合金属离子，降低干扰，但过量的反而会影响目标物在固相萃取柱上的吸附。由图 可知，加入为 时，大部分物质的回收率优于其他各组，因此，最终确定的加入量为 。：化学研究，（）：化 学 研 究 年图 水样中 加入量对 种 抗生素回收率的影响（）（）对于水样，分别试验了、和 四个 下的回收率。由图 可知，时回收率明显优于其他各组；时，大部分物质回收率有所降低，并且不确定度更大；时的回收率更低，说明酸性条件能够促进 在萃取柱上的富集，但 并非越低越好。实验结果表明，时，除诺氟沙星、沙拉沙星等个别物质外，大部分物质的回收率有所降低，因此最终确定水样的 调节至。图 水样 对 种 抗生素回收率的影响（）（）方法性能 线性范围与检出限 根据 节所述的标准溶液配制方法，将 类抗生素配制成浓度为、和 等标准系列，内标浓度均为 。以目标物浓度为横坐标、目标物定量离子峰面积与内标定量离子峰面积之比为纵坐标，采用线性拟合的方法得到 种 类抗生素的校准曲线（表）。由表 可知，、和 三个物质响应最高，线性范围最低浓度可达 ，、和 四个物质响应相对较低，线性范围最低浓度为 ，其余物质根据响应值的高低，线性范围最低浓度分别为 或 。总体而言，种 抗生素均有较好的线性关系，相关系数在 之间。表 种 抗生素的保留时间、线性方程、相关系数和检出限 ，浓度范围（）保留时间 线性方程相关系数 仪器检出限（）方法检出限（）：化学研究，（）：第 期宋晓娟等：固相萃取超高效液相色谱三重四极杆质谱法测定海水中 种喹诺酮类抗生素 续表浓度范围（）保留时间 线性方程相关系数 仪器检出限（）方法检出限（）根据环境监测分析方法标准制订技术导则，对 种 抗生素的检出限进行了测定。向 清洁海水中加入低浓度标准溶液，加入量分别对应线性范围的最低浓度，每个浓度重复测定 次，根据以下公式计算方法检出限，并以 倍检出限作为测定下限。（，）式中，表示：方法检出限；（，）表示：自由度为 ，置信度为 时的 分布，当 时，（，）；表示：次平行测定的标准偏差。由表 可知，种 抗生素的方法检出限在 之间，其中、等化合物的检出限水平均低于以往研究。回收率与精密度采集连云港典型入海河口样品，根据 节所述方法进行预处理，分别向 处理后的水样中加入 和 抗生素标准溶液，每个浓度重复测定 次，分别计算实际海水样品在低、高浓度下的回收率与精密度，结果如表 所示。由表 可知，加标量时，种 抗生素的回收率在 之间，相对标准偏差在 之间；加标 量 时，种 类 抗 生 素 的 回 收 率 在 之间，相对标准偏差在 之间。因此，该方法具有较好的准确度与精密度，方法定量可靠、稳定性好，说明在样品预处理、固相萃取、仪器分析等全过程中所优化的参数，能够满足 种 抗生素的检测要求。表 种 抗生素的精密度和回收率（）（）海水加标 海水加标 实际样品分析采集连云港市 个典型河口海域涨潮与落潮的海水样品，按照本研究确定的方法，对 种 抗生素进行分析，个样品中共检出 种抗生素，浓度：化学研究，（）：化 学 研 究 年范围为 ，其中，浓度最高，每个样品均有检出，浓度在 之间，和 浓度较低，仅个别点位有检出，而、和 等 种抗生素所有样品中均未检出。与已有研究比较在已有报道中，针对海水和养殖水中 抗生素的分析已有一些研究。孙晓杰和姜明宏分别利用固相萃取液质联用法建立了海水中多种抗生素的分析方法，但 抗生素仅包括 种物质，方法覆盖的物质种类不全面，聂湘平等对珠三角养殖水体中 抗生素的分析也只涵盖了诺氟沙星等 种物质，不能全面反映 抗生素的污染状况。董晓等专门针对 种 抗生素建立了分析方法，但检出限在 之间，高于本研究的方法检出限。综合来看，本研究所建方法覆盖了较全面的物质种类，同时方法灵敏度高，有利于发现潜在的低风险污染，为管理决策提供依据。结论本研究采用固相萃取超高效液相色谱三重四极杆质谱联用技术建立了海水中 种 类抗生素的分析方法。通过优化液相色谱流动相、固相萃取条件、水样预处理条件等各项参数，最终得到方法线性关系良好，检出限符合痕量分析要求，实际海水样品分析时，高、低浓度加标均得到较好回收率与精密度。分析连云港市典型入海河口的海水样品，类抗生素的浓度水平在 之间，该方法能够成功应用于海水中 抗生素的定性与定量检测。参考文献：，：，：，：邱盼子，郭欣妍，王娜，等 超高效液相色谱串联质谱法同时测定制药废水中 种抗生素 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