细胞组织裂解(提蛋白)方法.doc

第一种方法

蛋白匀浆缓冲液：
50 mM Tris-HCl (pH7.5)
150 mM NaCl
5 mM EDTA
1 % NP-40
1 mM PMSF

操作步骤
直接用这个进行组织匀浆
然后于10000 rpm 离心20分钟
收集上清

作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。
将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v浓缩，150v分离

第二种方法
裂解液配方：
尿素：8M
CHAPS:4%
DTT:65mM(现加）
PMSF:1mM(现加）
MiliQ 水

操作步骤：
取300mg样品在液氮环境下研磨，
加入1ml裂解液混匀，
室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），
15000g离心1小时，
取上清测定蛋白质浓度。

在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？
（可以的，最后上胶条的时候可以再加）
不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）

第三种方法
建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热
做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为 30~50 ug/ul

测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。

培养细胞
细胞培养于100 mL/L FCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，40 g/LCHAPS，65 mmol/L DTT)，同时加入1 mmol/L苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsufosyl，PMSF)，旋涡振荡，反复液氮快速冻融4次，加DnaseⅠ50 mg/L和Rnase A 25 mg/L室温作用15 min，4°C 15 000 g离心1 h，收集上清液-80°C冻存备用，Bradford法测定蛋白浓度[17]．

第四种方法
哺乳动物组织一般采用机械分散法：
1 取脑组织称重，研钵预冷，边加液氮边研磨，至非常细小的干粉。
2 0℃PBS洗剂组织碎片，4℃3000g离心5分钟，估算离心管底部沉淀物的体积。
3 在5倍组织体积预冷的悬浮缓冲液中迅速用镊子分开或用剪刀剪碎组织碎片（最好加用蛋白酶抑制剂），大多数哺乳动物组织可以在悬浮缓冲液液面之下迅速用剪子分开或用用剪刀剪碎.
悬浮缓冲液：
0.1mol/L NaCl
0.01mol/L Tris Cl (PH 7.6)
0.001mol/L EDTA (PH8.0)
1ηg/ml Aprotinin
100ηg/ml 苯甲基磺酰氟（PMSF）
4 尽快加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液。
5 样品置于沸水浴中加热10分钟。
6 采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切。以最大功率处理0.5—2分钟一般能有效将裂解液粘度降至可控水平。
7 室温10,000g将样品离心10分钟，取上清。
8 计算使用Western法检测靶蛋白所需样品量。在细胞总提取液中加入已知量的靶蛋白同时进行Western blotting检测，可为分析未知样品提供阳性对照，并可精确估计采用所选抗体时该法的灵敏度。

可否换成DNase 1 和RNase A? 可省去超声操作

我也是一名初学者，我将要做的是大鼠脑膜蛋白的抽提。我拿到的裂解液的配方如下:
1% SDS
40 mM Tris
65 mM DTT(现加）
ddH2O
而且在匀浆后，似乎还需要加入50ug/ml RNase和200ug/ml DNase,在4℃ 放置15min;15000离心1h.取上清。
我想请诸位高手指点一下，上面的配方和步骤中有无欠妥之处。谢谢！

你的配方较适合水溶性蛋白的提取。8M尿素的加入能使膜蛋白更多地溶解，现在很多文献提倡用7M尿素，2M硫脲提取膜蛋白。另外CHAPS、TritonX100、NP40等去垢剂的使用是否也要考虑？
还有提取蛋白以后的下一步将做什么也很重要，如果是做IEF则最好不要用SDS，这会影响等电点，如果还要做DIGE的话，在标记荧光以前不能加DTT，标好后可以加

1．IPG buffer 是载体两性电解质
2．WB时loading buffer 里DTT和巯基乙醇的作用？
都是还原剂，防止二硫键形成
3．PAGE 上样buffer中为什么要加DTT？作用是什么？？
DTT能增加杂质的溶解，最主要的是DTT起还原剂的作用，用来打开肽内或肽间的二硫键，促进蛋白的完全溶解。还是加的好。
加入DTT可打开二硫键，基本成线性结构；非还原状态下，二硫键未被破坏，蛋白中由二硫键形成的双体（如抗体的轻重链）或二级结构不能打开，有时样品会出现沉淀现象。在进行WESTERN　BLOT实验时，有的抗体识别非还原状态的条带，但不识别还原态下的蛋白条带，就是由于非还原状态下还保持了一定的空间表位，这在有些抗体的WB鉴定中很重要。所以你的SDS－PAGE是否加DTT还是取决于你实验的目的。
4．做SDS-PAGE 电泳前,一定要把原核表达后的蛋白煮沸几分钟吗
煮蛋白的作用是让蛋白充分变性，这样才能使蛋白在SDS-PAGE中完全靠分子量分离，测定的分子量准确性才高。
5. 怎样去除蛋白里的核酸？
去除核酸可以用酶法（DNase，RNase）、超声，建议使用超声。做WB什么的，抽提出的蛋白很粘稠就是因为有核酸，超声把核酸降解了就可以了。
若只是做WB，我觉得用RIPA可能更好一些，因为RIPA使用的三去污剂，裂解更完全些
50mmTirs-Hcl 缓冲液（PH 7.5）,含：

1、  150mm Nacl
2、  1% NP-40
3、  1% 脱氧胆酸钠
4、  0.1%SDS
5、  10mmEDTA
6、  2.5mmEGTA
7、  1mm钒酸钠
8、  50mmNaF
9、  其它蛋白酶抑制剂 (无水乙醇溶解配成100X浓度，下述给出的为终浓度  
Aprotinin (20 ug/ml)
Benzamidine (1mm)
Pepstatin (20ug/ml)
PMSF (1mm)
Leupetin (20ug/ml)
TPCK (100Ug/ml)

2.RIPA buffer:

50 mM Tris-HCl pH 7.4
150 mM NaCl
1 mM PMSF
1 mM EDTA
5 礸/ml Aprotinin
5 礸/ml Leupeptin
1% Triton x-100
1% Sodium deoxycholate(脱氧胆酸钠)
0.1% SDS

Tris buffered saline (1x TBS): 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 mM NaCl

3.RIPA buffer:
1x PBS,
1% Nonidet P-40 or Igepal CA-630,
0.5% sodium deoxycholate,
0.1% SDS.

This may be made in large volumes. Add inhibitors at time of use from the following stock solutions:
a) 10 mg/ml PMSF (sc-3597)(in isopropanol (add at 10 μl/ml RIPA)
b) Aprotinin (sc-3595)
c) 100 mM sodium orthovanadate (cat # sc-3540) in frozen aliquots (add at 10 μl/ml RIPA)

Phosphate buffered saline (1x PBS): 9.1 mM dibasic sodium phosphate, 1.7 mM monobasic sodium phosphate, and 150 mM NaCl. Adjust pH to 7.4 with NaOH

TISSUE SAMPLES
1. Weigh tissue and dice（切） into very small pieces using a clean razor blade. Frozen tissue can be sliced very thinly and thawed in lysis buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors. Use 3 ml of ice cold RIPA buffer per gram of tissue.

2. Further disrupt and homogenize（使均匀） tissue with a dounce homogenizer（高速搅拌器） or a sonicator（超声仪）, maintaining temperature at 4° C throughout all procedures. (Optional: Add 30 μl of 10 mg/ml PMSF (cat # sc-3597 stock per gram of tissue.) Incubate on ice for 30 minutes.

3. Transfer to microcentrifuge tube (General Laboratory Support Products) and centrifuge at 10,000xg for 10 minutes at 4° C. Remove supernatant and centrifuge again. The supernatant（漂浮） fluid is the total cell lysate（溶解产物）. A longer centrifugation may be necessary to obtain a clear lysate.