细胞杀伤力曲线测定.doc

2012-10-10
DMEM/F12培养基配制
gibco D-MEM/F-12
CAT.NO.12500-062
LOT.NO.1206536
干粉培养基，每包装配1L。
直接溶于1L纯净水中，加2.438g碳酸氢钠，搅拌2小时，pH试纸检测中性。
0.22μm滤器过滤180ml培养基入250ml血清瓶。
5瓶180ml，1瓶不到180ml。
其中1瓶180ml培养基加入FBS 20ml。

2012-10-11
CHO-S细胞复苏：
41℃迅速溶解1min；
2ml细胞液+6ml DMEM/F12 10%FBS加入离心管，轻柔吹散。
离心1000rpm 5min；
弃上清；
加入3ml DMEM/F12 10%FBS，轻柔吹散,加入75ml细胞方瓶，补3ml DMEM/F12 10%FBS；
轻柔混匀，镜下观察，细胞密度85%-90%，细胞呈圆形悬浮；
37℃ CO2培养；

2012-10-12
细胞观察：
贴壁，90%密度；
95%呈圆形，少量有梭型倾向，密度过高，决定传代；
细胞传代：13:00
弃上清；
加入胰酶，2滴管（37℃回温）；
室温显微镜下观察，有微量脱落，1min；
倒出胰酶，加入5ml DMEM/F12 10%FBS，9区吹扫程序3次；
1传2，补2.5ml DMEM/F12 10%FBS；
原瓶中还有未脱落细胞，又加入5ml DMEM/F12 10%FBS继续培养，胶布标记。

2012-10-13
观察细胞状态：
贴壁，有少量呈梭型，大部分为原型，但并不圆润。

2012-10-15
观察细胞：
大部分为梭型，少量为原型，约80%，培养基开始变浅。
细胞传代：
两瓶量多的1传2；

2012-10-16
观察细胞：
传代时分散不好的细胞过夜培养后镜下观察，成团状生长，有展开细胞。
换培养液：13:00
未脱落细胞换液，生长良好。
配PBS:
NaCL 1.6g, KCL 0.04g, KH2PO4 0.04g, Na2HPO4.12H2O 0.726g, H2O 200ml, 高压灭菌。

2012-10-17
胰酶消化分散传代：
PBS清洗2遍；
胰酶侵润，立即倾倒或保持；
显微镜下观察1min；
加入5ml培养基；
吹扫分散，1传2；

2012-10-18
细胞观察：
尹骏传代的4瓶有2瓶没贴壁，我怀疑是第一次做的时候胰酶消化的时间过长，损伤了细胞壁；（需要严格控制消化时间，尤其注意，胰酶在倒出后，应立即加入终止培养基。）
我传代的6瓶贴壁生长正常，但还是有团块生长；（这种团块生长可能是第一次传代为吹匀所致，并不是第二次传代可以吹散的，计划降低接种比例，延长生长时间，逐步减少团块数量。）

2012-10-19
配制胰酶：
life science进口分装胰酶；
0.25%，100mlPBS溶解；
0.22μm过滤；
冻存液配制：
5%DMSO，250μLDMSO，4750μL含血清培养基。
细胞冻存：
选密度较高，展开细胞较多，团块较少的4瓶细胞消化冻存；
倒掉培养基；
2ml胰酶，室温60秒静置；
倒掉胰酶；
加入5ml培养基，9区吹扫，液面下吹打80次；
1000rpm离心5min；
倒掉上清；
加入冻存液；
立即放入4℃，1h；
-20℃，3h；
液氮口过夜；
装入液氮存储核；
6B41\6B42\6B34\6B22
其中有一只冻存管细胞较少，已标明。
细胞传代：
一瓶1传2；
一瓶1:4传代。
（新配的胰酶很好用，细胞容易打散）

2012-10-20
尹骏传代的两瓶贴壁不好的细胞今日换液，去除死细胞

2012-10-21
细胞观察：
1:4传代的一瓶（原瓶）培养基变黄，细胞贴壁展开非常好，比其他几瓶都好，未见染菌。推测细胞展开良好，没有接触抑制，代谢旺盛，生长迅速。建议立即换液。
细胞换液：
1:4传代的一瓶（原瓶）

2012-10-22
细胞观察：
前日培养基颜色变化很大的一瓶细胞，换液过夜后颜色变化依然很大，并且细胞形态由展开向收缩发展，决定放弃。
细胞传代：
取三瓶细胞形态较好的1:4传代；共传6瓶，计划4瓶冻存，2瓶用于DNA提取；
使用吸管吹散，细胞分离不完全，见2-8个聚集。
培养基配制：
从马格非分装血清中分出80ml，其中20ml加入180ml培养基中待用，60ml储存。
细胞复苏：
尹骏复苏了2012-10-19冻存的细胞一只。

2012-10-24
细胞观察：
22日1:4传代细胞有聚集有展开，不是最佳状态，可能不适于冻存，原因可能是上次用吸管吹的力度比较小，为完全吹散；
按照罗成的建议可以适当这延长消化时间，尽量减少吹打的损伤；
胰酶消化和枪吹散哪种更损伤细胞？

2012-10-25
细胞冻存：
冻存4只细胞（有一只打破了还剩3只）
冻存液配制：
10%DMSO，400μLDMSO，3600μL含血清（10%）培养基。
细胞冻存：
倒掉培养基；
PBS漂洗2遍；
2ml胰酶，室温70秒静置；
倒掉胰酶；
加入5ml培养基，9区吹扫，液面下吹打80次；
1000rpm离心5min，弃上清；
加入1ml冻存液，迅速混匀；
4℃1h，-20℃2h，液氮口过夜（绳子太长了接触到液氮了），放入液氮存储盒里，6B34/6B22/6C23。
胰酶消化一瓶细胞，离心收集，用于全DNA提取。
2012-10-25
CHO-S全DNA提取：

2012-10-26
细胞传代：
3ml吹扫，0.3:4.7接种；
1ml枪弹簧很松，吹打了110下，细胞基本分散；
传代4瓶。

2012-10-27
细胞复苏：19:00
2012-10-25冻存细胞（10%DMSO）；
离心管加入4ml培养基；
细胞瓶加入2ml培养基：
取出冻存细胞，42℃水浴，快速震荡，至融化。
加入到含4ml培养基离心管；
离心1000rpm，1min；
弃上清；
加入5ml培养基，短暂吹打，重悬；
加入含2ml培养基细胞瓶，7ml过夜培养（加大对DMSO的稀释比例）。

2012-10-28
细胞观察：9:00
27日复苏细胞有30%贴壁，呈圆形，未展开，分布均匀；
26日传代细胞贴壁，50%展开，有少量悬浮，计划29日换液。
细胞换液：
对27日复苏细胞进行换液，为进一步降低DMSO影响。
2012-10-28
引物稀释：
8Lout加H2O 521μl稀释为10μM，分装3管10μl；
8Rout加H2O 636μl稀释为10μM，分装3管10μl。

2012-10-29
26日传代细胞观察：
26日传代细胞状态良好，展开率高。
27日复苏细胞观察：
27日复苏细胞基本没有分裂，形态介于展开间，形态异常
2012-10-29
Prime STAR PCR：
buffer 10μl
dNTP Mix 4μl
CHO-S DNA(10/25) 1μl
8Lout 1μl
8Rout 1μl
Prime STAR 1μl
H2O 32μl
1：95℃ 5min
2-30：94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s
31：72℃ 5min

2012-10-30
26日传代细胞冻存：3只
5B52/6B22/6C23
传代4瓶：0.5:4.5
2012-10-30

2012-10-31
30日传代细胞观察：
有一瓶明显展开率偏低，还观察到一个异常的大细胞，内部有几个膨胀囊泡，
用白胶布做标记。
27日复苏细胞观察：
随生长缓慢，但以开始展开，未见悬浮死亡。
2012-10-31
电泳：

在500左右位置可见一相对高亮条带，但比较模糊，无法提取。见弥散性杂带，提高退火温度可以缓解。可条带貌似比500小，理论应该比500大。

2012-11-1
30日冻存细胞复苏：
30日传代细胞观察：
异常的那瓶细胞出现死亡现象，漂浮细胞明显增多；
计划下午三点对其余三瓶细胞换液。
27日复苏细胞观察：
细胞形态趋于正常。
2012-11-1

2012-11-2
2012-11-2

2012-11-3
30日传代细胞再传代：
8瓶，1传4比例，用于冻存，建立野生型细胞库。
2012-11-3
CHO-DNA提取：
1瓶细胞提2管，双倍的GB，70℃共40分钟，少量不溶胶状物用枪挑出，电泳可见条带。
Prime STAR PCR：
buffer 10μl
dNTP Mix 4μl
CHO-S DNA(11/3) 1μl
8Lout 1μl
8Rout 1μl
Prime STAR 1μl
H2O 32μl
1：95℃ 5min
2-30：94℃ 30s 58℃ 30s 72℃ 30s
31：72℃ 5min

10/31的PCR显示特异性和效率不高，退火温度为52℃，本次11/4提高了退火温度到58℃，为见PCR条带，怀疑退火温度提高太大，引物Tm值为61到63℃，理论退火温度56℃。为了兼顾效率和特异性计划使用touchdown PCR。

2012-11-4
touchdown PCR
1: 95℃ 30s
2-14: 94℃ 30s
58℃-52℃ 30s
72℃ 30s
14-32: 94℃ 30s
52℃ 30s
72℃ 30s
33: 72℃ 5min
Prime STAR PCR：
buffer 10μl
dNTP Mix 4μl
CHO-S DNA 1μl
8Lout 1μl
8Rout 1μl
Prime STAR 1μl
H2O 32μl
电泳未显示条带，发现有人将第二次基因组提取时用的乙醇换成了TIRS，正是第二次提取的DNA两次PCR都没有条带。

2012-11-5
10/30冻存11/1复苏转瓶：
消化，分散，全转新瓶。
2012-11-5
用第一次提取的DNA进行PCR，Prime STAR和Taq两组，touchdown PCR条件。

Prime STAR PCR：
buffer 10μl
dNTP Mix 4μl
CHO-S DNA 1μl
8Lout 1μl
8Rout 1μl
Prime STAR 1μl
H2O 32μl

Taq PCR：
Buffer 5μl
MgCl2 5μl
dNTP 8μl
8Lout 1μl
8Rout 1μl
CHO-S DNA 1μl
Taq 1μl
H2O 28μl

1: 95℃ 30s
2-14: 94℃ 30s
58℃-52℃ 30s
72℃ 30s
14-32: 94℃ 30s
52℃ 30s
72℃ 30s
33: 72℃ 5min

目的条带亮度很低，与普通PCR条件相比目的条带附近杂带较少，而大分子量杂带较多。按照位置推算正确。做基因提取应该可以。考虑染色体结构庞大复杂，建议延长变性时间。
条带回收：
第二轮Prime STAR PCR：
1：95℃ 5min
2-30：94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s
31：72℃ 5min

2012-11-6
11/3传代细胞冻存：
7只，有一瓶培养基变黄，与其他7瓶颜色明显不同，未见染菌，放弃；
使用HYCLONE南美血清配制培养基，用于分散离心，用原培养基配5%DMSO冻存；
由于处理量比较大，先消化分散，加入离心管，带都操作完统一离心，后发现在离心管中停留的时间太长，细胞重新贴壁，离心后堆积较少，仔细观察壁上细胞较多，加入DMSO培养基重悬，不敢过长时间吹打，冻存细胞密度可能偏低。
3C54 11/6, 5B52 11/6, 6B41 11/6, 6B42 11/6, 6B33 11/6, 6B34 11/6, 6C22 11/6
10/30冻存11/1复苏11/5全转新瓶细胞生长良好。
2012-11-6
回收：
Taq PCR：
Buffer 5μl
MgCl2 5μl
dNTP 8μl
8Lout 1μl
8Rout 1μl
FUT81μl
Taq 1μl
H2O 28μl

1：95℃ 5min
2-30：94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s
31：72℃ 5min

2012-11-7
电泳：未成功

2012-11-8

2012-11-9

2012-11-10

2012-11-11

2012-11-12

2012-11-13
Taq PCR：
Buffer 5μl
MgCl2 5μl
dNTP 8μl
8Lout 1μl
8Rout 1μl
FUT81μl
Taq 1μl
H2O 28μl

1：95℃ 5min
2-30：94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s
31：72℃ 5min
2012-11-13
DH5α甘油菌200μl接种Amp LB 20ml 过夜37℃；

2012-11-14
电泳：

切胶分离：
回收：
发现比预期小的位置还有一条带，看强度应该是扩增所得，prime STAR扩增未见，第一次Taq扩增也未见，也可能是第一次电泳条带太浅，怀疑是非特异性扩增。两条带都回收，计划都进行测序。
2012-11-14
DH5α保甘油菌；
制作平板AMP 4块（其中1块不含抗性，3块含AMP）；
每块20ml 4块80ml LB
Tryptone 0.8g
Yeast expract 0.4g
NaCl 0.8g
琼脂 1.6g
DH5α平板划线，过夜37℃。

2012-11-15
pMD18-T载体连接：
Solution I 5μl
pMD18-T 1μl
FUT8-A 4μl
16℃过夜连接
2012-11-15
从平板上挑DH5α单菌落接入20ml LB，37℃过夜培养。

2012-11-16（五）
2012-11-16（五）
取200μl接入20ml LB，37℃1.5-3h培养。
4℃离心 6000rpm 5min。
弃上清。
600μl预冷0.1M CaCl2重悬。
冰浴30min。
4℃离心 6000rpm 5min。
弃上清。
100μl预冷0.1M CaCl2重悬。

2012-11-17（六）
转化：
8T5/8T3 10μl
感受太细胞 100μl
冰浴 30min
42℃ 90s
冰浴 2min
LB 500μl
37℃ 1h
涂平板：
过夜培养。

2012-11-18
单克隆摇菌管：
过夜培养；

2012-11-19
甘油菌：8T5A/B/C，8T3A
测序：结果异常

2012-11-20

2012-11-21

2012-11-22

2012-11-23

2012-11-24

2012-11-25

2012-11-26

2012-11-27
新设计的引物：8LoutB，8RoutB；

引物稀释：
8LoutB：
nmoles 25.3 0.253ml H2O 100μM
10μl 90μl H2O 10μM
20μl 分装
8RoutB：
nmoles 18.6 0.186ml H2O 100μM
10μl 90μl H2O 10μM
20μl 分装

Prime STAR PCR：
buffer 10μl
dNTP Mix 4μl
CHO-S DNA 1μl
8Lout 1μl
8Rout 1μl
Prime STAR 1μl
H2O 32μ

1：95℃ 5min
2-30：94℃ 45s 53℃ 30s 72℃ 30s
31：72℃ 5min

电泳：

2012-11-28
处理细胞培养用品：

2012-11-29（四）
处理细胞培养用品：高压，烘干。
配PBS：
PBS配制：
200ml
NaCl 1.6g
KCl 0.04g
KH2PO4 0.04g
Na2HPO4.12H2O 0.726g
or
Na2HPO4 0.58g
高压灭菌。

2012-12-3（一）
过夜贴壁
换液：hyclonen南美FBS
观察（复苏后12h）：
感觉培养基变色较快,但未见染菌现象；
部分细胞贴壁，但倒出液体后，发现一些细胞又被倒出，可能贴壁不牢固；
有待后续观察。

2012-12-4（二）

2012-12-5（三）
换液：hyclonen南美FBS
观察（复苏后60h）：
培养基颜色未见更显著变化；
贴壁细胞已分裂，形成群落，约<10个细胞，细胞形态未全部展开。

2012-12-6（四）
100mg/ml G418配制：
1g G418加10ml PBS（直接溶在原瓶中），过滤分装1.5ml EP管，-20℃保存。
细胞观察：
消化换瓶：冷胰酶消化70秒，1 ml 移液器吹扫100下。

2012-12-8（六）
细胞换液：1700-1800
一多半细胞形态正常
一些圆形未展开的细胞上有小突触
还有散在的S行管状
那个S型的东西我前些天看看到过 但只找到一个 还以为是什么杂质 但今天明显增多了

2012-12-9（日）
细胞观察：
培养基变色较快，漂浮单细胞增多，为展开贴壁细胞比以前同期多，展开细胞形态正常贴补层状态良好，未见大面积脱落及成团漂浮初步排除大面积染菌的可能。乐观的解释是，在最近的24小时中，细胞进入对数增长期，培养基养分过快消耗，造成一些细胞脱落和培养基变色。如果传代后恢复正常状态，就能支持这种解释。下一步计划，传代1:4、铺板、保存原瓶细胞次日用于提取DNA。
消化细胞：1:4传代
铺板：
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.9
0.9
0.0
0.0
—

2012-12-10（一）
DNA提取：
FUT8 PCR：
Prime STAR PCR：
buffer 10μl
dNTP Mix 4μl
CHO-S DNA 1μl
8LoutA/B 1μl
8RoutA/B 1μl
Prime STAR 1μl
H2O 32μ

1：95℃ 5min
2-30：94℃ 45s 53℃ 30s 72℃ 30s
31：72℃ 5min

电泳：无任何条带。
2012-12-10（一）
换液：
铺23孔的24孔板换液；
12/9日1:4传代换液；
12/9日传代剩下的细胞消化，用于DNA提取。
细胞观察0800：
细胞液还是变色较快，昨晚铺板的细胞已经贴壁，但尚未展开分裂。

G418杀伤曲线：
消化：
计数：
稀释：1000cell/ml；
24孔板每孔100μl，约100cell；
补完全培养基200μl；
12-24h培养贴壁展开形态良好；

G418 100mg/ml配制：
10ml
G418 1g
PBS 10ml
0.22μm过滤。
抗生素培养基配制：
10个1.5ml EP管（高压灭菌）；
加入1ml 完全培养基；
分别吸出3、4、5,、6、7、8、9μl；
补入3、4、5,、6、7、8、9μl G418（100mg/ml）；
形成G418终浓度0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mg/ml。
PBS 300μl洗涤24孔板；
加入相应浓度G418完全培养基300μl；
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.9
0.9
0.0
0.0
—

观察换液（含G418）；
10-14天；