螺旋体及检验.doc

怀化医专《微生物学检验》教案 编号：

2010年上学期
授课教师
桂 芳
教研室主任审核签名
李争鸣
教学课题
螺旋体及检验
课时
授课时间
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2
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授课对象
检验专业
班级

目的要求
【掌握】钩端螺旋体，梅毒螺旋体的生物学特性和微生物学检验。
【熟悉】1、回归热螺旋体和伯氏疏螺旋体的特性。
2、各类螺旋体的致病与免疫性。
【了解】 防治原则和其他螺施体。
教学重点及难点
重点：1、螺旋体的概念与特征
2、钩端螺旋体的主要生物学性状及微生物学检验
3、梅毒螺旋体的主要生物学性状及微生物学检验
难点： 钩端螺旋体、梅毒螺旋体的微生物学检验。
教法与
学法
讲授法
课型
理论课
教学手段
多媒体
教学
内容
与
时间
分配
1、概述：主要特点及分类。（10min）
2、钩端螺旋体：形态染色、培养、抗原构造与分类。致病性与免疫性，微生物学检查及防治原则。（35min）
3、梅毒螺旋体：形态染色、培养特性、抗原构造。致病性与免疫性，微生物学检查及防治原则。（35min）
4、其他螺旋体。(10min)
小 结 （10min）
复习
思考题

1、什么叫螺旋体？有哪些特征？
2、梅毒螺旋体的血清学检测包括哪些试验？其原理如何？

参考资料
1、张卓然主编 《临床微生物学与微生物检验》人卫出版社 第3版 2006.11
2、倪语星主编 《临床微生物学与检验》 人卫出版社 第4版， 2007年
3、李凡主编 《医学微生物学》 人卫出版社 第7版 2008.1
自评
本次课首先应重点讲授螺旋体的概念与基本特征，尤其是与其他微生物的区别。其次是钩端螺旋体、梅毒螺旋体的微生物学检查及致病性，螺旋体常用的染色法是镀银染色法，该法的操作方法及结果观察可以放在实验课介绍。

第二十七章 螺旋体及检验
(spirochete)

螺旋体是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物。生物学地位介于细菌与原虫之间。
有细胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖，对抗生素敏感等。
其中致病性螺旋体主要有钩端螺旋体属、疏螺旋体属、密螺旋体属等3个属。

第一节 钩端螺旋体
（Leptospira）

有2种：问号钩端螺旋体——人畜共患病；双曲钩端螺旋体——不致病。
一、生物学性状

1. 形态染色
螺旋细密、规则，形似细小珍珠排列的细链。一端或两端呈钩状，故名钩端螺旋体。运动活泼，常使菌体呈C、S或8字型。
G-，但不易着色。常用Fontana镀银染色法，被染成棕褐色。暗视野显微镜下可见活泼运动、折光性强而成白色的钩端螺旋体。
2.培养特性

需氧或微需氧，营养要求高，常用Korthof培养基，其中含10%新鲜灭活兔血清或牛血清，蛋白胨和磷酸盐缓冲液（血清除促进钩体生长外，还可中和其产生的毒性）。
适宜生长温度为28-30℃，若11-13℃能生长的为非致病的双曲钩端螺旋体。最适pH7.2-7.6，pH < 6.5死亡，最高能耐pH8.4。
在人工培养基中生长缓慢：
液体培养基：28℃培养1-2周，液体培养基呈半透明云雾状生长。
1%琼脂固体：28℃1-3周，可形成透明、不规则，d< 2mm的扁平小菌落 。
生化反应不活泼，不分解糖类和蛋白质，有过氧化氢酶，有的菌株可溶血。

3.抵抗力
对热和酸抵抗力弱，60℃1min即死亡。0.2%来苏、1:2000升汞、1%石炭酸经10~30 min被杀灭。对青霉素敏感。
在夏秋季酸硷度中性的湿土或水中可存活20天以上，甚至数月之久，这在本菌的传播上有重要意义。

4. 抗原构造与分类
1）属特异性抗原（菌体抗原）：脂多糖复合物，用于分群。
2）型特异性抗原（表面抗原）：多糖蛋白复合物，用于分型。
问号状钩端螺旋体至少可分为25个血清群、273个血清型。
我国已发现的致病性钩端螺旋体至少有19个血清群、74个血清型，是发现血清型最多的国家。

二、致病性与免疫性

1、致病物质
•（1） 内毒素样物质(ELS)或称脂多糖样物质(LLS)
•（2） 溶血素：溶解红细胞，引起贫血、出血、肝肿大、黄疸、血尿。
•（3） 细胞毒性因子(CTF)：引起小鼠肌肉痉挛、呼吸困难而死亡。
•（4）细胞致病作用(CPE)物质：56℃经30分钟被破坏。注射入家兔，可形成红斑和水肿。
2、所致疾病
钩端螺旋体病（一种人畜共患传染病）。
储存宿主：鼠和猪，其他：50多种动物（蛇、鸡、鸭、鹅等）
传播途径：人与污染水或土壤接触,经粘膜或破损皮肤进入;经胎盘垂直传播.
临床表现：大多隐性感染，随尿排出。轻重程度与感染钩体型别、毒力、免疫性有关。轻者似感冒，重者引起内脏器官和神经系统的损害。先形成钩体血症,进入损伤全身毛细血管内皮细胞及肝、肾、肺心及中枢神经。
疾病特点：起病急、高热、乏力、全身酸痛、眼结膜充血、腓肠肌压痛、表浅淋巴结肿大。
免疫性：疾病后可获得抗同型钩体的持久免疫力。细胞免疫为主。

三、微生物学检查法

（一）标本采集
钩端螺旋体可从临床标本、携带者和自然界的水中分离获得。
标本包括血液、尿和脑脊液，发病早期(10天内)血液的阳性率高，2周后尿和脑脊液等的阳性率高。感染6～10天取血可检出抗体，在病程第3或4周达最高水平，此后抗体水平逐渐下降，血清学诊断则需在病程早期及恢复期分别采集血清，作双份血清试验。

（二）检验方法
1、标本直接检查
（1）镜检：取急性期病人血先以1000rpm离心5~10min，再取血浆以4000rpm离心45~60min，取1滴沉淀物置玻片上，加盖玻片后作暗视野检查。也可用Fontana镀银染色法染色后观察。
（2）核酸检测：采用同位素或生物素、地高辛标记的特异DNA探针法，检出标本中钩端螺旋体的核酸，较培养法快速、敏感。若先用PCR技术先行扩增，再用探针确定，则敏感度更加提高。
2、分离培养
取钩端螺旋体血症期的病人血液2ml 或发病后第2周的无菌弱碱性尿沉渣接种于Korthof 培养基中，28℃孵育，因系需氧生长，故靠近培养液面呈半透明雾状混浊。
取培养物作暗视野检查，观察有无螺旋体生长，一般7~14天生长。连续观察30d，如无生长方判为阴性。

3、血清学检测
（1）显微镜凝集试验（MAT） 是常用的方法。
1)抗原制备：取标准菌株4—7天的培养物，每视野50～60条活钩端螺旋体。
2)方法与结果：取病人血清以56℃，30min灭活后稀释，每个稀释度0.1ml 血清中加入等量活菌抗原，30℃2h后，取1滴覆盖玻片，暗视野显微镜下若有抗体存在，则钩体凝集成团，数减少，当抗体效价高时，凝集的菌体溶解。
结果判定：50％以上菌体凝集或溶解为“2+” 为血清效价。≥1：300才有诊断意义，或效价增高4倍以上，则可确诊本病。

（2）酶联免疫吸附试验
用ELISA法和IgM斑点-ELISA法等间接检测钩体病人血清中特异性抗体，用于该病的快速诊断。
包被抗原用钩端螺旋体培养物经超声波破碎，15000r／min离心20min，用于包被的抗原浓度以20μg／ml为好。被检血清OD值为阴性对照的2倍，即为阳性。

4、动物试验
动物是分离钩端螺旋体的敏感方法，尤其适用于有杂菌污染的标本。
方法是将标本接种于幼龄豚鼠或金地鼠腹腔。接种3～5d后，可用暗视野显微镜检查腹腔液；亦可在接种后3～6d取心血检查并作分离培养。动物死后解剖，可见皮下、肺部等有大小不等的出血斑，肝、脾脏器中有大量钩端螺旋体存在。

第二节 梅毒螺旋体
（Treponema pallidum, TP）
（苍白密螺旋体苍白亚种），STD中危害最大的一种。
一、生物学性状
1.形态与染色
8-14个致密而规则的小螺旋，两端尖直，运动活泼。革兰染色阴性，不易着染Fontana镀银染色法→染成棕褐色。
电镜下观察，有细胞壁和细胞膜。细胞壁外有包膜，细胞膜内为含细胞质和核质的螺旋形原生质圆柱体。绕着3—4根周浆鞭毛或内鞭毛 ，与运动有关。作移行、曲伸、滚动式运动。

2、培养特性
不能在无活细胞的人工培养基中生长繁殖。
Nichols株能在家兔睾丸和眼前房内繁殖并保持毒力，在细胞中能有限生长，繁殖慢，约30h才分裂一次 。含3%-4%氧时生长最宜 。
Nichols株：有毒力
Reiter株：毒力弱
3.抵抗力
极弱。对温度和干燥特别敏感。41.5℃经1h死亡，在50℃时5min死亡；在血液中，4℃置3d后可死亡。离体后1-2h将死亡。
对常用化学消毒剂亦敏感，1%~2%石炭酸内数分钟就死亡。
对青霉素、四环素、红霉素或砷剂均敏感。

二、致病性与免疫性

1、致病物质
外膜蛋白---与宿主细胞粘附。
透明质酸酶---利于扩散。
宿主细胞纤维粘连蛋白覆于表面-免受宿主免疫细胞攻击。
2、所致疾病---梅毒
人是梅毒的唯一传染源，有先天性和获得性两种 。
获得性——性接触传播
先天性——母体→胎盘→胎儿

获得性梅毒

Ⅰ期（初期）梅毒：感染性极强，破坏性小。感染后3周左右局部出现无痛性硬下疳，多见于外生殖器，一般4~8周后，常自愈。渗出液中有大量苍白亚种螺旋体。
Ⅱ期梅毒：感染性强，破坏性小。发生于硬下疳出现后2~8周。苍白亚种螺旋体血症，全身皮肤、粘膜常有梅毒疹（扁平湿疣），全身淋巴结肿大，有时亦累及骨、关节、眼及其他脏器。在梅毒疹和淋巴结中，存在有大量苍白亚种螺旋体。
Ⅲ期(晚期)梅毒：感染性小，破坏性大。发生于感染2年以后，亦可长达10~15年。病变可波及全身组织和器官。基本损害为慢性肉芽肿，局部因动脉内膜炎所引起的缺血而使组织坏死。皮肤、肝、脾和骨骼常被累及。若侵害中枢神经系统和心血管，可危及生命。

先天性梅毒（胎传梅毒）
多发生于妊娠4个月之后。
苍白亚种螺旋体经胎盘进入胎儿血流，并扩散至肝、脾、肾上腺等大量繁殖，引起胎儿的全身性感染，导致流产、早产或死胎；
出生梅毒儿，呈现马鞍鼻、锯齿形牙、间质性角膜炎、先天性耳聋等特殊体征。

免疫性：抗体——梅毒特异性抗体（IgG和IgM），有制动作用，对机体再感染有保护作用；抗脂质抗体——反应素（IgM和IgG混合物），对机体无保护作用，用于血清学诊断。

三、微生物学检查法

标本 ：Ⅰ期梅毒----硬下疳渗出液；
Ⅱ期梅毒----梅毒疹渗出液或局部淋巴结抽出液
1.直接显微镜检查
将上述检材置于玻片上用暗视野显微镜检查，如见有呈现运动活泼，沿其长轴滚动、屈伸、旋转、前后移行等的螺旋体即有诊断意义。
也可做镀银染色、荧光抗体染色或Giemsa染色。
2.核酸检测
用PCR技术直接检测临床标本中梅毒螺旋体的特异性DNA片段，用于检测的引物和探针是编码外膜蛋白4．7kD的基因，其扩增产物经斑点印迹，或电泳Southern 印迹法鉴定。

3.抗体检测
(1)非密螺旋体抗原试验
多用牛心肌的心脂质作为抗原，测定病人血清中的反应素。将抗原包被到载体颗粒上，如：胆固醇（VDRL、USR）、活性炭（RPR）、甲苯胺红（TRUST）。均为初筛试验。
初期梅毒病灶出现后1-2周时，阳性率为53％～83％，二期梅毒的阳性率可达100％，晚期梅毒的阳性率58％-85％，胎传梅毒的阳性率为80％- 100％。

1)性病研究所实验室(VDRL)玻片试验
所用抗原(0.03％心拟脂、0.21％卵磷脂、0.9％胆固醇，用无水乙醇配制)0．3ml加入装有0.3ml缓冲盐水的小瓶内(10—15ml容积)，加塞混匀。再加2.4ml缓冲盐水即为抗原悬液。
待检血清经56℃30min灭活，滴加于玻片的漆圈内加等量抗原液，摇转玻片5min充分混匀反应后观察结果。有大片絮状凝聚物为(3+)，中等凝聚物为(2+)，细小凝聚物为(+)，液体混浊为(—)。

2)快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)
用活性炭颗粒吸附VDRL抗原。与反应素结合形成黑色凝集块，可肉眼观察结果。
取待检血清加于环状卡圆圈内，加VDRL抗原致敏活性炭1滴，旋转摇匀8min，观察结果。在白色底板出现明显黑色凝集颗粒为阳性，试验结果用肉眼很容易判断，不需显微镜，也易于推广。

3）不加热血清反应素试验（USR）
注意：以上试验常有假阳性反应：结核、麻风、疟疾、类风湿性关节炎、老年人、妊娠、吸毒者等。

(2)密螺旋体抗原试验 （确证试验）
用密螺旋体抗原检测病人血清中特异性抗体，由于梅毒螺旋体、雅司螺旋体等抗原性相似，故血清学试验不能区别这些密螺旋体及其所致疾病。
1)荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)
先用吸收剂去除病人血清非特异性抗原，提高特异性，稀释成不同稀释度，加于预先涂有梅毒螺旋体抗原的玻片上，置湿盒内，37℃孵育30min，洗片后再用荧光素标记的羊抗人丙球蛋白抗体，在荧光显微镜下观察。阳性者可见发荧光的梅毒螺旋体。FTA-ABS试验具高度特异性和敏感性，在第一期梅毒的头几天就可测出特异性抗体。
2)梅毒螺旋体血凝试验 (treponemal pallidum hemaggulation assay, TPHA)
用抗原致敏红细胞作间接血凝试验是检测抗体最简易的方法，所用抗原是用梅毒螺旋体(Nichols株)提取物去致敏经醛化处理的绵羊红细胞，病人的血清先与非致病性Reiter细胞。血清若含有抗体则与这些细胞反应形成平铺孔底的凝集；用非致敏红细胞作对照，以除外非特异性凝集。
梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）

第三节 疏螺旋体属
第四节
有3～10个稀疏而不规则的螺旋，运动活泼。
对人致病的主要有伯氏疏螺旋体、回归热螺旋体、奋森螺旋体等。

一、伯氏疏螺旋体
是莱姆病的主要病原体，1977年在美国莱姆镇发现，从硬蜱及患者体内分离出伯氏疏螺旋休。
1985年我国在黑龙江省林区首次发现莱姆病，1988年从病人血液中分离出病原体，迄今已有十多个省和自治区证实有莱姆病存在。
传播媒介是硬蜱，伯氏疏螺旋体可在蜱的中肠生繁殖，叮咬时使宿主感染。经3～30d潜伏期，早期有乏力、头痛、发热、肌痛，在叮咬部位可出现慢性移行性红斑。经2-3周，皮损消退，留有斑痕与色素沉着。80％未经治疗的可发展至慢性关节炎、慢性神经系统异常，严重者可同时出现皮肤、神经、关节、心等多脏器损害。

二、回归热疏螺旋体
是引起人类回归热的病原体。
根据回归热传播媒介不同，分为两类：一为虱传回归热，或称流行性回归热，其病原体为回归热疏螺旋体。另一为蜱传回归热热，又称地方性回归热。
我国流行的回归热主要是虱传型。

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