EMSA试验成功的关键因素.doc

EMSA试验成功的关键因素:1. 1.试验设计,主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间剃度的问题,这个很关键,很多同学不注意这一点,最后试验确实是拿不到阳性结果,比如我一前一个朋友用药物处理SGC7901细胞,就是因为时间点设计的不好EMSA试验结果是阴性的,后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度,最终得到阳性结果! 所以这个设计很关键!给一个个人的实验总结希望能帮助大家:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度！二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些,因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程.时间可以长一些,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点.2.核蛋白样品的制备;制备蛋白样品的关键是:1.注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像.2.掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度. 能入核的蛋白本来就不是很多,所以核蛋白的浓度往往不会很高,但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的! 一般要求在1ug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以,但是不能太低,否则影响结合反应拿不到结果. 这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失.同时,一般制备核蛋白的材料为细胞和组织, 细胞要比组织好做的多,最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多. 而组织抽提后杂蛋白相对较多!杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果!3.探针的制备: 又很多站友都在问我生物素标记到3端还是5端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸-标记生物素-纯化-退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.4.EMSA实验技术. 这一点主要是操作的细节问题! 下面会更细的谈到.技术要点: 关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了!1. 制胶 必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml50% Glycerol（50%甘油） 1.0mldH2O（蒸馏水） 14.8mlTEMED（四甲基乙二氨） 20l脱气10min 10% AP（过硫酸氨） 120l总量 20.0ml2. 一般试剂盒包括的试剂l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 oC) l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 oC) l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 oC) l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 oC) l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 oC) l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4oC) l 2Blocking Buffer（2 封闭液）(4 oC) l 5Washing Buffer（5 洗涤液）(4 oC) l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC) l Binding-membrane（结合反应膜）(RT) 3. 结合反应每次结合反应需1-5l核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15l（1） 结合反应体系：10X 结合反应液 1.5lPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0l细胞核提取物* ? l双蒸水* ? l混匀室温静置20 分钟 生物素标记的探针 0.5l总量 15l混匀室温静置20分钟或以上。（2）特异性反应确认竞争反应体系：10X 结合反应液 1.5lPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0l细胞核提取物 ? l未标记的竞争性寡核 2.0l 双蒸水* ? l混匀室温静置20 分钟 生物素标记的探针 0.5l总量 15l混匀室温静置20分钟或以上。其中:探针用量: 这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是最少50fmol.蛋白样品用量: 一般用量在2-20ug(控制在1-5l)蛋白, 总体系15ul. 细胞核抽屉物浓度都比较低,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.poly(dI:dC)(dI:dC): 它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液:每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。未标记的竞争性寡核: 做为竞争的探真来说,其实就是没有标记的转炉银子的寡核苷酸,用量一般是正常探真的50-100倍. 再这里我引申的解释一下其他的对照的含义:. 常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白标记探针)； 阴性对照反应(核蛋白标记探针); 阳性对照(核蛋白标记探针) 探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白标记探针标记探针100倍量的未标记探针)； 突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的 核蛋白标记探针标记探针100倍量的未标记突变探针)； Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白标记探针目的转录因子的特异抗体).4. 预电泳和电泳：0.25X TBE在冰上120V 预电泳1小时; 务必换掉预电泳的缓冲液, 用新的0.25X TB低温下150V，电泳约60分钟。 注意横压电泳的时候注意电流的数字变化,记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化!5. 电转运在0.5X TBE中390mA电转移40分钟, 注意转运膜的选择, 有一种离子加强型的转运效果比较好! 我当初选择过一般的和离子加强型的,还是离子加强型结合效果好!6.紫外交联: 正规的应该是紫外交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那就用无菌操作台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以了!这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的!条件比较成熟!可以借鉴!7. 化学发光反应包括Blocking Buffer 30分钟封闭, Streptavidin-HRP标记, Washing Buffer洗涤; Equilibration Solution平衡, 这些按照规定操作即可! 没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上,而是加在液体中混韵后在将膜放在液体中孵浴.8. 化学发光图像显示两种方法:化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像 操作基本和Western 试验操作相当, 只是这个膜是一次性的,不能重复使用, 一定保存好图片! 由于跑得是非变性凝胶,蛋白保持天然构想和活性,所以代条很可能是一块一块的而不像WB那样很规整的一条细线,这个很正常!希望大家交流讨论!