核酸杂交的基本原理.doc

核酸杂交的基本原理n 原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形成双链。基因组探针CDNA探针 RNA探针的特点n 基因组DNA探针：为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。n 制备：基因克隆；PCR扩增基因组特定片段n 优点：多克隆在载体中的DNA片段，可以无限繁殖，量大；PCR制备探针更加简便省时。n cDNA探针：指互补于mRNA的DNA分子。n 制备：以mRNA为模板，按照碱基互补的原则，经逆转录酶催化合成的。n 优点：不存在内含子和高度重复序列，是一种较为理想的核酸探针。n RNA探针：以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。n 优点：稳定性高，杂交效率高，n 缺点：易于降解和标记方法复杂。探针标记的方法理想的探针标记物应具备以下特性：n 敏感性高；n 标记物与探针结合后，不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值；n 检测方法要高灵敏性、高特异性、稳定、简便、假阳性率低；n 标记对环境污染小，对人体无损伤，价格低；n 标记物对检测方法无干扰。放射性同位素标记n 放射性同位素标记法 缺口平移法 随机引物法 DNA探针的末端标记5端标记法3端标记法 PCR标记DNA探针非放射性标记酶促反应标记法化学修饰标记法各种固相杂交方法的适用范围杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子菌落杂交检测固定在膜上、经裂解从细菌体释放的DNA分子斑点杂交检测固定在膜上的DNA或RNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子1、Southern印迹杂交n Southern印迹杂交：膜上检测DNA的杂交技术，1975年由Edwin Southern建立。n 广泛应用于基因克隆的筛选、特定DNA的定性定量检测、基因突变分析、疾病的临床诊断等方面Southern印迹杂交基本方法：n 酶切已纯化的待测DNAn 凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性n 将DNA片段转移到固体支持物n 预杂交封闭滤膜上非特异性位点n 探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针n 检测及结果分析A. DNA的变性：DNA变性解链是杂交成功的重要环节。n Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性，通常采用碱变性方法，即将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/L NaCl和0. 5mol/L NaOH中1小时左右。B. 中和：取出凝胶用去离子水漂洗一次，然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl(pH8.0)和1.5mol/L NaCl中和1小时。C. Southern印迹：目的是将电泳变性后的DNa片段转移至固体支持物上。固体支持物种类较多，有硝酸纤维素膜、尼龙膜、磁珠等。将DNA分子从凝胶中转移到固体支持物上的方法有3种：n 毛细管转移：单链DNA在高盐的作用下从琼脂糖凝胶转向固体支持膜。n 电转移法：利用电泳作用将凝胶中变性DNA转移至带电荷的固相支持物上。n 真空转移：将固相膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，通过低压真空泵在转移装置上形成负压，缓冲也从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的DNA，使其沉积在滤膜上。D. 预杂交：待测DNA与探针进行杂交前，需将上面得到的薄膜进行预杂交。n 预杂交的目的是用非特异性的DNA分子及其他高分子物质，将待测核酸分子中非特异性位点全部封闭。E. 杂交：单链核酸探针与待测核酸分子中特异序列在一定温度下复性，形成异质双链的过程。F. 洗膜：将游离的探针分子和非特异性杂交分子漂洗掉的过程。G. 杂交信号的检测2、 Northern印迹杂交n Northern印迹杂交：应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术，是有Alwine于1977年建立，后经Thomas等人改进，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。n 其方法类似于Southern印迹杂交。A.基本步骤B.与Southern印迹杂交比较：基本原理相似，操作程序略有差异：n RNA极易降解，提取过程中需注意RNA酶污染；n 杂交前实验过程中所用器材最好与Souther印迹实验的分开使用，防止RNA酶的污染；n RNA变性的方法与DNA不同；n 印迹前将含甲醛(变性剂)的凝胶用水冲洗掉，然后再印迹、杂交；n 如果测定RNA片段大小，可在同一块胶上加上分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。5.原位杂交n 定义：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针，与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。基本方法：A. 细胞或组织切片的处理B. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性C. 预杂交D. 杂交E. 杂交后处理F. 结果检测生物芯片技术n 生物芯片：指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray)。n 主要特点：高通量、微型化和自动化n 未来十年最具发展潜力的技术。常用的生物芯片的分类：n 基因芯片n 蛋白质芯片n 缩微芯片实验室基因芯片n 又称DNA芯片或DNA微阵列。n 将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称为基因芯片。基因芯片的原理与制备n 根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。DNA芯片技术包括四个主要步骤：n 芯片的设计与制备n 样品制备n 杂交反应和信号检测n 结果分析感染性疾病的分子诊断策略与方法n 感染性疾病：由细菌、病毒、支原体、衣原体、寄生虫等病原体侵入机体而引起的疾病。n 以前对于这些病原体多采用微生物学、免疫学和血液学相关手段进行检测，但是这些方法手灵敏度和特异性的限制，不易早期诊断。n 分子诊断技术主要是针对侵入体内的病原体基因，不同的病原体有各自的种族特异性基因或DNA片段。感染性疾病的分子诊断策略：n 一般性检测策略：n 只需提供是否有某种病原体的感染n 完整检出策略：n 不仅对病原体做出诊断，还要进行分型和耐药性方面的检测一般性检测策略和方法：n 感染性疾病分子诊断一般性检出策略：n 针对特异性的核苷酸序列进行核酸分子探针杂交n 利用常规PCR技术直接检测出微生物的DNA/RNAn 能够判断有无感染和是何种病原体感染n 条件：n 在该病原体核酸中有特异的核酸序列；n 能够根据特异的核酸序列设计和制备具有特定信号的探针或设计合成相应PCR引物；n 多数感染性疾病的病原体都具备上述两个条件。完整检出策略和方法n 一般性检出策略所提供的感染性病原体的信息量较少；对于感染性病原体的分子诊断来讲，应该尽可能地多了解病原体相关信息。n 感染性疾病分子诊断完整检出策略：通过分子杂交结合PCR技术、特殊PCR技术和芯片技术、核酸测序技术的运用，能够对大多数感染性病原体做出明确的判断，而且能够诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病原体进行分类、分型和耐药性的鉴定。n 杂交技术结合PCR能对很多病原体做诊断和分型鉴定，主要过程是PCR扩增后，用相应型别的探针进行杂交来分型；n 基因芯片技术也能提供更加完整的信息；n 基因序列测定是诊断感染性疾病的标准。n 感染性疾病分子诊断一般性策略只是快速诊断是合作病原体的感染，为了得到更多的进步病原体信息，建议应该采取完整策略，利用多种分子诊断手段对感染性病原体进行分析。