大肠杆菌生长曲线.doc

四川大学
化 学 实 验 报 告

课程名称 生 物 工 艺 学 实 验 课 程 号 309119060
学 院 轻 纺 与 食 品 学 院 专 业 轻工生物技术
学生姓名 赵凤佼 学 号 0843095035
指导教师 周荣清 成绩评定
实验日期 2011-06-20~2011-06-22

一、实验名称：大肠杆菌生长曲线的制作

二、实验目的：
1.通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生长特征与规律，绘制生长曲线。
2.掌握光电比浊法测量细菌数量的方法。

三、实验仪器及药品：
1.菌种：大肠杆菌。
2.培养基：LB培养基100ml，分装两支大试管（5ml/支），剩余90ml装入250ml三角瓶。
3.仪器和其他药品：722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管和无菌吸管等。

四、基本原理：
在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次，将一定量的细菌转入新鲜培养液中，在适宜的培养条件下细胞要经历延迟期、对数期、稳定器和衰亡期4个阶段。以培养时间为横坐标，细菌数目的对数或生长速率为纵坐标所绘制的曲线成为该细菌的生长曲线。不同的细菌在在相同的培养条件下其生长曲线不同，同种细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不同。
当光线微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比；而光密度或透光度可以通过光电池精确测出。因此，可利用一系列菌悬液测定的光密度及其含菌量，做出光密度—菌数的标准曲线，然后根据样品液所测得的光密度，从标准曲线中查处对应的菌数。
本实验用分光光度计进行光电比浊，测定不同时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。

五、关键步骤及注意事项：
1.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定
2.严格控制培养时间

六、操作步骤：
1.标记
取11支无菌试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。
2.接种
分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液（培养10~12h）转入盛有90mlLB培养液的三角瓶，混合均与后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌试管中。
3.培养
将已接种的试管置于摇床37℃振荡培养（振荡频率250r/min），分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。
4.比浊测定
用未接种的LB培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之间。

七、详细实验过程记录：

时间
实验进度要求
具体操作
备注
2011-06-20 上午
分组（2人/组）；准备、清洗实验仪器。
小试管3支，大试管3支，250ml三角瓶1个，5ml吸管3支，洗净干燥。

2011-06-20 下午
准备、清洗实验仪器；配置LB培养基。
（1）清洗仪器：6cm小培养皿8套，9cm培养皿48套，4个150ml三角瓶+玻珠，5ml吸管1支，0.5ml吸管12支，1ml吸管12支，洗净干燥。
（2） 配置1000mlLB培养基（5组用量）：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCL10g，蒸馏水1000ml，NaOH稀溶液调节PH至7.0后，分装入250ml三角瓶封装，于120℃灭菌20min。
LB培养基不加琼脂。
2011-06-20 晚上
一次接种。
取湿热灭菌后LB培养液分装2支试管各5ml，一支接入E.coli斜面菌种，一支做空白对照，静置培养。

2011-06-21 上午
观察一次接种生长情况；二次接种。
用5ml无菌吸管吸取3 ml大肠杆菌过夜培养液（培养10~12h）转入盛有90mlLB培养液的三角瓶，混合均与后分别取5ml混合液放入编号为1#~11#的11支无菌试管中，置于摇床37℃振荡培养（振荡频率250r/min）。

一次接种中接入E.coli的LB培养液浑浊，未接种的对照组培养液澄清。
2011-06-21 上午 ~
2011-06-22 上午
接种菌液分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存。

按编号将各组相同培养时间编号的试管分组统一放置于摇床中，按时取出置于冰箱保存。

2011-06-22 上午
光电比浊测定各培养时间段的细菌培养液OD值。
用未接种的LB培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之间。

2011-07-04
整理实验数据，分析实验结果，完成实验报告撰写。

八、实验报告：
1.结果
（1）将测定的OD值填入表V-1：

表V-1 细菌培养液OD值测定结果
培养时间/h
对照
0
1.5
3
4
6
8
10
12
14
16
20
取出时间
12:30
12:30
13:15
14:45
15:45
17:45
19:45
21:45
23:45
01:45
03:45
07:45
OD值
0
0.048
0.094
0.278
0.504
0.533
0.723
0.773
1.065
1.217
1.291
1.160

（2）绘制大肠杆菌的生长曲线：见 。

图V-4

实验结果分析：
通过比浊测定法和稀释平板菌落计数法对大肠杆菌生长曲线进行了测定，测定结果显示：大肠杆菌生长曲线基本符合延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期的划分，但是与典型生长曲线存在明显差异，延缓期较短，稳定期延长到十小时以上。
本次试验因采用以培养10—12小时的大肠杆菌，故延迟期较短。在培养3小时之后进入对数期，生长速率逐渐增大，在培养15小时之后，菌数不再发生变化，进入稳定期。由于培养时期较短，故无衰亡期。
2.思考题
（3）细菌生长繁殖所经历的4个时期中哪个时期的时代最短？若细胞密度为103个/ml，培养5小时候其密度高达2X108个/ml，计算出其代时。
答：对数生长期时间最短。细菌经过迟缓期进入对数生长期，并以最大速率生长和分裂，导致细菌数量呈对数增长，此时细菌生长呈平衡生长，即细胞内各成分按比例有规律的增加，所有细胞组分呈彼此相对稳定速度合成。对数生长期细菌的代谢活性及酶活性高而稳定，细胞大小比较一致，生活力强。
在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需时间为代时，以G表示。
细菌的比生长速率 μ=（lgNt-lgNo）/（t-to）×2.303=（8lg2-3）/ 5 ×2.303=2.4417h
∵G=t-to lnNt-lnNo=μ（t1-to）
∴ G=（lnNt-lnNo）/μ=ln（Nt/No）/μ=（5+ln2）/ 2.4417=2.3316（h）

（4）次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长规律，采用哪些措施可以使次生代谢产物积累更多？
答：稳定期次级代谢产物大量积累。由于营养物质消耗，代谢产物积累和PH等环境变化，环境条件逐步不适应细菌生长，导致细菌生长速率降低至零（即细菌增加的数量等于细菌死亡的数量），对数生长期结束，进入稳定生长期。稳定生长期的活细菌数最高并维持稳定。如果及时采取措施，补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等可以延长稳定生长期，获得更多的菌体物质或代谢产物。

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