DNA双螺旋结构是怎样发现的.pdf

物理与工程 Vol.15No.22005近代物理发现DNA双螺旋结构是怎样发现的3向义和(清华大学物理系,北京 100084)(收稿日期:2004212216)3 本文研究课题得到清华大学国家工科基础课程物理基地教改项目资助.摘要文章具体地介绍了DNA双螺旋结构是怎样发现的.克里克和沃森两位不同国籍,不同学科的科学家是怎样走到一起进行研究的,他们所采用的分子建模方法和实验依据.他们的建模过程怎样由三螺旋到双螺旋;由主链在内到主链在外;碱基键合怎样由离子键到氢键;碱基配对怎样由同类配对到互补配对.以及从这一研究过程中在思想方法上应吸取的教益与启迪.关键词分子建模方法;DNA化学结构式;DNA的X射线衍射分析;氢键;碱基同类配对;碱基互补配对DNA双螺旋结构的发现是20世纪自然科学最重要的三大发现之一.这一结构直接表示了遗传物质的一种可能的复制机制,揭示了生命的秘密;这一发现开启了分子生物学的新时代,为人类从分子水平上认识生命过程及生命活动的机制奠定了基础.DNA双螺旋结构的发现是由英国物理学家克里克(Crick.Francis,1916)和美国生物学家沃森(Watson.James D,1928)在1951年9月到1953年4月间共同研究的结果.他们是在当时遗传学关于遗传物质的确定1,生物化学对DNA化学结构式的研究2,X射线晶体学对DNA纤维的X射线衍射分析2和结构化学对化学键、尤其是对氢键的认识,以及通常使用的分子建模方法等方面的研究知识积累到一定程度的基础上进行工作的.本文要讨论的问题是沃森和克里克这两位不同国籍、不同学科的科学家是怎样走到一起的?他们是如何得到这一结构的?他们的思想渊源来于何处?在探索过程中经历了哪些重大事件?遇到了哪些困难?获得了哪些帮助?得到了哪些启发?他们又是如何分析并解决这些问题的?以及从这一发现中我们吸取到的教益与启迪.1 走向DNA合作研究之路克里 克1916年出生于英国北安普敦 郡(Northampton).1937年 从 伦 敦 大 学 学 院(University College London)物理系毕业后,他的研究生工作是研究水在高温下(100 以上)的粘滞性.二战期间在海军实验室研究磁性水雷.在战争结束后的1946年,他阅读了薛定谔写的 生命是什么?一书,书中提出的“可以用精确的物理概念,即物理学和化学的概念来考虑生物学的本质问题”,使他受到很大的启发.他读罢书后有这样一个印象,“伟大的事情就在转折处”(Greatthings were just around the corners)3.他所说的伟大的事情指的就是当时英国物理学家伯尔钠(Bernal J.D,19011971)利用X射线对蛋白质和核酸的研究.19471949年间,他在英国医学研究 委 员 会(Medical Research Council简 称MRC)的一个实验室工作,研究的题目是,细胞中磁性粒子的运动,后来在 实验细胞研究 杂志上发表了一篇长达72页的论文.1949年6月克里克进入布拉格领导下的卡文迪什实验室,与佩鲁兹(Perutz Max,1914)一起从事血红蛋白的X射线研究.一年后,他参加了一个题为“狂热追求什么(What Mad Pursuit)”的研讨会,他对X射线结晶学研究中所遵循的一些基本技术和解释模式感到不满,针对分子结构的复杂性,提出了正确的研究方法.他说:“像我以前说过的那样,X射线数据通常只给我们显示出晶体三维结构一半的信息(即只给出了全部傅立叶分量的强度,而没有给出44物理与工程 Vol.15No.22005它们的相位).有什么方法能使我们获得这失去的部分 数 据 呢?”这 就 是 他 提 出 的“同 晶 置 换(Isomorphous replacement)”方法4.当时这一研究方法人们很少使用,克里克完全正确地预见到使用这一方法能够揭示蛋白质结构的细节.1952年春克里克还与科克兰(Cochran W)和万德(Vand V)在 结晶学报(Acta Crystallographica)发表了“在螺旋上原子的变换”的文章2.他们推导出在沿着螺旋线等距离分布的原子在衍射空间中的傅立叶变换式,这一理论为研究蛋白质和核酸结构,分析X射线衍射图片提供了有力的工具.沃森1928年出生于美国芝加哥.1943年进入芝加哥大学攻读动物学.他在大学即将毕业时,也像克里克一样,阅读了奥地利物理学家薛定谔写的 生命是什么?一书,从而使他对遗传学产生了向往之情,后来他在 双螺旋 中说:“这本书非常清楚地提出了一个信念,即基因是活细胞的组成部分以及要懂得什么是生命,必须知道基因是如何发挥作用的”3.正是这部书引导他去“寻找基因的奥秘”.1947年在他获得芝加哥大学理学士后,就进入印第安纳大学攻读病毒学博士.指导他做博士论文的导师是在意大利受过教育的微生物学家卢里亚(Luria kalckar).研究的问题是噬菌体遗传学.当时在一些遗传学家中存在着这样的猜测,即病毒就是赤膊基因的一种形式.果真如此,则解释什么是基因以及如何复制的最好方法乃是研究病毒的性质.这样,鉴于最简单的病毒是噬菌体,在20世纪40年代一批科学家建立了噬菌体研究小组,他们希望研究噬菌体最终将会弄清楚基因是怎样控制细胞遗传的.领导这个小组的是卢里亚和玻尔的学生、德国理论物理学家德尔布吕克(Delbruck Max,1906).1948年春在他遇见德尔布吕克后,就被噬菌体学派的目标和方法“钩住了”3.1950年他获得了博士学位.1951年5月他有机会赴意大利参加了一次在那不勒斯(Naples)举行的“生物大分子结构国际会议”.会上,英国物理学家威尔金斯(Wilkins,Maurice)关于DNA2X射线晶体衍射的报告,使他对DNA结构产生了浓厚兴趣5,大大激发了他对DNA结构的好奇心,促使他迈出了人生关键的一步 进入卡文迪什实验室.1951年9月沃森来到了卡文迪什实验室在博士后 站 点 工 作,与 佩 鲁 兹 的 合 作 者 肯 德 鲁(Kendrew John C 1917)一起从事肌红蛋白的研究.正是在这里,他遇见了克里克.沃森和克里克相见后立即相处得非常融洽,这是因为他们志趣相投,知识互补.克里克是一位不仅了解X射线晶体学,蛋白质知识,而且是对基因的结构与生物学功能很感兴趣的物理学家.而沃森的确是一位知道许多关于噬菌体的实验工作和细菌遗传学知识的生物学家.沃森在 双螺旋 一书中写道:“从我到实验室的第一天起,我发觉和克里克谈得很投机.”“他是一位懂得DNA比蛋白质更重要的人,真是三生有幸.”又说:“我和克里克每天至少交谈几个小时,其他时间克里克就用晶体学武装我的头脑.”51951年12月沃森在给德尔布吕克的信中写道:“克里克无疑是我曾合作过的人当中最有生机的一个人,而且非常像我曾经见过的鲍林,事实上他长得也很像鲍林.他总是不停地谈话和思考 他吸引了许多有志向的年轻科学家,因此,我在他家的茶会上,经常遇到许多剑桥的人物.”3正是这种智力的共鸣,对探索基因本质的兴趣,强烈地把他们吸引到一起,开始了现代生物学史上的一次最富有创造性的,最激动人心的,或许也是最神奇的,跨学科专家的合作.2 分子建模的实验依据化学家如欲了解某物质之三维空间的构造,有两条重要途径可循:一是按照物质特性使用物理学的工具(如X射线衍射法,电子显微镜,核磁共振法)探讨分子中原子的相对位置;另一种方法是制作模型,对分子中的各种原子按照比例作出模型,并根据物理学的计算和实验数据,确定各原子间的距离和键之角度.美国著名的结构化学家鲍林(Pauling Linus,19011994)就是通过建立模型的方法确定了蛋白质的螺旋结构.沃森和克里克曾经认真讨论了鲍林是怎样发现蛋白质的螺旋结构的.鲍林认为大多数已知蛋白质中的多肽链,由于氨基酸之间氢键的作用,会自动卷曲成螺旋状.鲍林提供了一个查看分子中各原子相对位置的方法,即先根据理论上的考虑建立模型,再用X射线衍射结果来检验模型.正如沃森在 双螺旋 一书中所说:“鲍林成功的关键在于他运用了结构化学的简单规律.他发现螺旋结构并不仅仅靠X射线衍射图谱.相反,其主54物理与工程 Vol.15No.22005要方法是探讨原子间的关系.不用纸和笔,他的主要工具是一组分子模型.”5沃森和克里克采用模型方法进行工作的步骤是:依据他们所掌握的资料,提出他们可供选择的模型,然后再用X射线衍射图象进行对比和检验.早在20世纪30年代就已经确定了DNA的化学构成,它是由4种称为核苷酸(nucleotide)的基本单位组成,每种核苷酸又是由3种基本的亚单位,一个碱基,一个脱氧核糖和一个磷酸基团组成,其中碱基有4种,它们是腺嘌呤(adenine)、鸟嘌呤(guanine)、胸腺嘧啶(thymine)和胞嘧啶(cytosine).DNA分子是由许多核苷酸连接而成的长链分子,在DNA中核苷酸是通过磷酸基团连接起来的.每一个核苷酸的脱氧核糖与另一个核苷酸的磷酸基连接在一起,形成糖2磷酸基骨架,构成了DNA主链2.1950年,奥地利生化学家查加夫(Chargaff,Erwin)发现腺嘌呤之量等于胸腺嘧啶之量,鸟嘌呤之量等于胞嘧啶之量.20世纪4050年代用X射线衍射分析DNA结构的实验主要是在伦敦国王学院(KingsCollege at London)进行,沃森和克里克建模所依据的资料主要来自于该院威尔金斯小组和由英国物理化学家富兰克林(Franklin,Rosalind)领导的小组所获得的实验结果.1951年7月在剑桥举行的蛋白质会议上,威尔金斯表述了他的关于DNA思想的重要发展.他把子午线上不存在反射看成是有意义的,而且从DNA衍射图上衍射最大值呈十字交叉的分布,直接地推断出DNA分子具有螺旋结构的特征,交叉式样的倾斜度给出了螺旋的坡度(见图1)6.沃森在 双螺旋 一书中回忆说:“威尔金斯在剑桥一次夏季讨论会上已经使用了“螺旋”这个名词.在我第一次到达那里的六周以前,他曾经把那张DNA的X光衍射图谱拿出来展示过.那张图谱显然存在子午线上缺少任何反射迹象.他的同事、理论家斯托克斯(Stokes,Alex)告诉他,这个现象是与螺旋结构相符合的.根据这个观点威尔金斯猜想有三条多核苷酸链形成螺旋结构”6.1951年1月富兰克林来到伦敦国王学院从事DNA纤维的晶体构型的研究.同年9月她得到了相对湿度为90%以上的、后来称为B型DNA的X射线衍射图(见图2).在这张图上你能看到衍射强度呈十字交叉分布的最明显的特征.1951年11图1DNA螺旋结构说明图图2B型DNA结构的X射线衍射图月21日,在伦敦国王学院举行的核酸结构学术讨论会上富兰克林展示了这张图,首先引起她注意的是子午线上0.34nm处的亮斑,她指出这两个倾斜的亮斑的连线与子午线呈40 角,还指出赤道线上有强反射点和子午线上的2.7nm亮点.她还测量出在这种状态中的水含量为每个核苷酸有8个水分子.并得出磷酸基是在外边的结论6.在富兰克林的笔记本上,她对这个阶段的结果作出了解释,提出了螺旋结构的证据.她认为由于受力不平衡,解开的直链是不可能存在的;在结晶形式中子午线上反射的不存在,表明存在螺旋的构型.在这种构型中投影到纤维轴上的电子密度几乎是相同的;强烈的2.7nm反射周期的存在,表明这个螺旋的螺距是2.7nm6.3 三螺旋模型的失败在伦敦国王学院1951年11月21日举行的核酸结构学术讨论会后,沃森和克里克受到这些研究成果的的激励,立即着手建立模型的工作.他们结合基本的实验事实:衍射图形所显示的螺旋64物理与工程 Vol.15No.22005特征,晶胞的尺寸,每个晶胞中碱基的数量和含水量,经过一周的努力,构建了一个三螺旋模型7.他们把三条多核苷酸链以一定方式彼此缠绕在一起,作出了一个沿螺旋轴每隔2.8nm绕一周的螺旋模型.三条糖2磷酸主链盘绕在圆柱形分子的内圆柱面上,靠钠离子或镁离子与磷酸根形成的盐键相互连接.碱基在圆柱形分子的内外圆柱面之间在垂直于螺旋轴的平面上(见图3).至于多核苷酸链之间是由什么力维系着的问题,克里克确信是金属离子和磷酸基团之间的静电吸引力.1951年12月中旬他在一篇未发表的关于建模工作总结的文章中写道:“这个结构必定由带电原子控制.除了在碱基环和水中以外,没有原子能够提供氢键.因此氢键在这个结构中,不大可能像它在多肽螺旋结构中那样起着控制的作用.静电力相对于范德瓦尔斯(van der Waals)力是如此之大,以致于我们可以确信,Na+和PO-2之间的静电吸引力将主要决定这个结构的稳定性”6.克里克认为不能用碱基中的氢键来建立一个有规则的结构的理由是,由于他引入的化学限制,涉及到碱基被描述为具有几种互变异构的形式,这就意味着当一个原子从这个分子上的一个位置迁移到另一个位置时,一种形式就会改变为另一种形式.因此他不同意在刚性的螺杆中,碱基中的氢键是使长链保持在一起的力.图3 三螺旋模型示意图沃森在 双螺旋 中同样认为维系着多核苷酸链之间的力是盐键.他指出“在这种盐键里,两价正离子如Mg+可以维系两个或更多的磷酸基团.”他把镁离子嵌进糖2磷酸骨架之中,就得到了一种非常精致的结构5(见图4).1951年12月中旬的一天,克里克和沃森邀请伦敦国王学院的晶体学家们来观看他们制作的图4 在螺旋结构中心Mg+结合磷酸基负电荷的方式DNA三螺旋模型,并听取对方的意见.当克里克谈到在这个由三条多核苷酸链组成的模型中,磷酸基团之间是由Na+离子联结时,富兰克林直截了当地指出,Na+离子由水分子外壳紧密地包围着,这就意味着它们之间的电荷隔着一段距离,所以这些Na+离子很难于与磷酸基牢固地结合在一起,因而它们不可能是一个紧凑结构的主要部分.富兰克林随之发现他们的含水量有错误,并不是像沃森告知的每个晶胞中,即在24个核苷酸中有8个水分子,而是每个核苷酸中有8个水分子,即少了24倍.她还郑重地表明糖2磷酸脊骨必须在分子圆柱的外边,指出放在里边是错误的7.富兰克林指出的这一系列错误,宣告了沃森和克里克首次建立的DNA三螺旋模型的失败.此后半年,克里克回到了他的蛋白质研究课题,沃森决定暂时转向烟草花叶病毒(TMV)的研究.TMV中 含 有 另 一 种 核 酸,即 核 糖 核 酸(RNA).1952年6月沃森得到所需的X射线图谱,克里克指出了那些意义重大的螺旋反射.证明TMV是一种螺旋.由于对TMV的研究在短期内不会有什么突破,他们又转回到DNA的结构上来.4 碱基互补配对思想的产生第一次建模失败后,DNA结构的稳定性仍然困扰着他们.沃森仍然喜欢赋予离子在这个结构的稳定性中具有关键的作用,但是他对二价金属离子的热情没有影响克里克.克里克考虑的是由于在这些碱基上电荷的移动产生的偶极子所引起的吸引力,现在叫做堆积力(stacking forces),即一个堆积在另一个上面的两个碱基的偶极子之间的静电吸引力.他请求一位剑桥年轻的数学家格里菲斯(Griffith John)计算同类碱基之间的这种吸引力.格里菲斯也是对生物学问题很感兴趣的人,他答应计算.1952年6月的一天,当克里克在茶会上见到格里菲斯时,他问格里菲斯是否做完了计算,格里菲斯回答说:“我做完了,而且我发74物理与工程 Vol.15No.22005现了腺嘌呤吸引胸腺嘧啶,鸟嘌呤吸引胞嘧啶.”这不是相同碱基之间的相互吸引,而是不同碱基之间的相互吸引.听到这话克里克并没有不知所措,而是回答说:“好,那是完全正确的.A造成B,而B造成A,你正好有互补的复制”6.这时克里克和格里菲斯都认识到不同种类碱基之间优先选择的吸引必将导致互补的复制.事实上碱基的这种互补配对不是由堆积方向上的静电吸引力引起,而是由垂直于纤维轴方向上的氢键引起的.格里菲斯还指出这些配对的碱基不是互相重叠,而是边缘相接的8.1952年7月的一天,肯德鲁给沃森和克里克引见了正在拜访剑桥的奥地利生物化学家查伽夫(Chargaff Erwin,1905).按照克里克的说法,在这次会面中,他们作了如下的交谈.首先,克里克问查伽夫:“核酸研究工作进展得怎样?我们想知道这个.”查伽夫略微迟疑了一下,回答道:“当然,比例是11.”克里克说:“指什么?”查伽夫说:“噢,都已经发表了!”克里克没有读过这篇文献,所以他不知道.于是查伽夫告诉了他,指的是不同种类碱基总量的比例.从而使克里克大为吃惊,所以他记得这件事.克里克突然想到:“哎呀!我的上帝,如果是互补配对,那么比例肯定是11.”不过当时他的确一点也想不起格里菲斯曾经告诉过他什么.他不记得这些碱基的名称,于是他去找格里菲斯,问他那些碱基叫什么,并要求他写下那些碱基.但是他又把查伽夫告诉他的东西忘了,于是他又回去看文献.令他惊奇的是,格里菲斯和查伽夫所说的配对竟然一样6.在这个阶段克里克把格里菲斯的计算和查伽夫的比例联系起来,认识到碱基的互补配对可以解释不同种类碱基总量比例为11的规则,而这个11的实验结果又可以验证碱基互补配对思想的正确性.所以克里克说:“查伽夫规则意味着碱基互补配对.”从而使他认识到不同类型的碱基配对可能是DNA分子结构的基础.这个认识极为重要,因为他揭示出DNA分子如何被维系在一起,以及如何复制自己.然而还没有证据表明DNA分子由几条链组成,或者链与链之间的空间关系如何.5 主链的数目、位置和方向1938年阿斯特佰里根据DNA的密度为1163g/cc的测量值,得到DNA的主链数不少于2、不多于4的结论9.这表明晶体学的密度数据能够用于分析讨论DNA的主链数.后来威尔金斯认识到早期主张3条链的决定是草率的.1951年富兰克林把A型DNA的含水量估计为42%,连同阿斯特佰里把DNA的密度估计为1.63g/cc,给出了在每个晶胞中大约有46个核苷酸.她后来的工作表明他们测量的含水量在改变,所以这个结果并不是令人完全满意的.1953年1月富兰克林在她作的1952年的年度报告中说:“如果A型DNA的含水量在干重量的22%到50%之间,那么在每个晶胞(unit cell)中核苷酸的数目就处在44到56之间,由于在每个晶胞中每条链上有11个核苷酸因此密度测量说明有4条链通过这个晶胞.或者是与每个晶格对(lattice pair)相联系的二条链”4.沃森在1953年1月最后一周的星期五拜访了伦敦国王学院,从威尔金斯那里他知道了富兰克林报告的全部内容.他问威尔金斯:“你们为何偏爱3条链?”威尔金斯回答:“那是由于这个密度值.”威尔金斯把富兰克林最近工作的一些结果告诉沃森,在由DNA的A型变到B型的过程中,这条轴的周期性长度(即螺距)由0.28nm变到0134nm,纤维长度大约增加了20%.由于B型DNA的碱基间的距离是0.34nm,因此A型DNA的碱基间的距离必定是0.34nm0.8=0.27nm.A型DNA在一个螺距中碱基的数目必定是2.80.2710.如果采用三螺旋,在这个晶胞中的碱基数很可能是30、60、或90;如果是双螺旋很可能是20、40或80.富兰克林的数值为46,它是接近于40而不是30或60,因此双螺旋比三螺旋更有可能6.这时需要沃森在两条链和三条链之间作出选择,他决定制作一个双链模型.他说:“克里克一定会同意.尽管他是一个物理学家,他也知道重要的生物体都是成对出现的.”后来克里克接受了沃森的关于“在生物系统中成对生物体的重复发现告诉我们必须建立两链模型”的主张,并且在这个说法下划了一条线6.关于主链的位置,早在1951年11月富兰克林根据X射线衍射图的特征,已经明确指出磷酸基2糖链在DNA分子的外边.但是沃森和克里克在他们首次建立的模型中并没有使用这个重要的信息,于是受到了富兰克林的批评.富兰克林指出把含水的磷酸基放在里边,这些水必然会成为这84物理与工程 Vol.15No.22005个结构的一部分,如果磷酸基在外边,这些水只能在水合物周围摆动.富兰克林还从电子密度图上在直径为1.8nm处的强烈散射,得出磷酸基2糖链在DNA结构外边的结论.沃森和克里克把主链放在里边,碱基放在外边的理由是“只要这些碱基在外边,人们就不必担心把它们如何装进去.”沃森在 双螺旋 一书中说:“碱基要是在里边,问题就麻烦了.怎样才能把带有不规则碱基顺序的两条或多条的多核苷酸链包装在一起?”5经过对包装问题的分析和思考,最后沃森建立了主链在外的模型.关于主链的方向,DNA的化学结构式表明单核苷酸是由碱基、脱氧核糖和磷酸基团组成.脱氧核糖上碳原子的位置以1 到5 表示.DNA内的单核苷酸是通过脱氧核糖上的3 位置和5 位置之间的磷酸二酯键(phosphate2di2ester linkage)彼此连接起来.1953年2月佩鲁兹把在1952年12月医学研究委员会的报告的复印件转递给克里克,使他们了解到主链的方向问题.该报告指出:“DNA的晶体形式是单斜晶,它的晶胞具有二重轴线或螺旋二重轴,这表明糖2磷酸主链具有指向意义,它的方向由核苷酸间的磷酸二酯键的指向决定,用3 5 的方向来表示”又指出:“单斜晶具有C2对称性,显然意味着两条链沿着相反的方向行进,是反平行的.一条上的磷酸二酯键的指向为3 5,另一条为5 3 指向”6.6 氢键的作用氢键(X-H22Y)是处于两个电负性较强的原子X和Y(如F、O、N等)之间的氢原子与Y原子的结合力(用虚线22表示).这里原子X和H之间是共价键(用实线-表示).分子X-H具有较强的电偶极性,它与电负性较强的Y原子之间的静电吸引力构成了氢键,氢键弱于使原子结合在一起形成分子的共价键,但它大于范德瓦尔斯力.例如水分子之间通过氢键而具有亲合力.一个带正电的氢核虽然“属于”氧原子,但它仍被另外一个水分子中带负电的氧原子吸引,这个吸引力就是氢键.鲍林首先指出,氢键在生物化学和生理过程中起着重要的作用.在他看来,生物大分子与无机分子的化学反应不同.在无机分子中原子的个性影响着化学键的性质,而生物化学反应中只涉及氢键(通常是氧和氮原子之间的氢键),原子的个性不突出了,重要的是分子的空间构型.早在1946年克里克就阅读过一篇介绍鲍林写的 现代结构化学 的文章,他感到惊奇又高兴.鲍林在书中说:“我相信物质的特殊的生理性质不是由这些强的分子力决定的,而是由弱力 范德瓦尔斯力、氢键 在分子间起作用.”7显然当时克里克接受了这个观点.然而在他们建立三螺旋模型时克里克并不重视氢键的作用.现在当碱基键合的问题提上日程的时候,就不得不考虑氢键的问题了.沃森在 双螺旋 一书中说:“怎样才能用碱基之间的氢键把交织的多核苷酸链联结在一起,也是一个令人头痛的问题.一年多以来,克里克和我否定了碱基可能构成规则的氢键.可是现在问题很清楚,我们完全错了.碱基上的一个或几个氢原子可以从某个位置移到另一个位置.”5也就是说在碱基与碱基之间有可能形成氢键,沃森认为有考虑此问题的必要.(未完待续)参考文献1 向义和.薛定谔对基因性质的物理学分析及其思想影响.物理,2002.11.7417452 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