高效毛细管电泳法在中药分析中的应用.pdf

4 4 中国兽药杂志 2 0 0 3，3 7(1 0)：4 4 4 6，3 2 何绮霞 高效毛细管 电泳法在 中药分析 中的应用 何绮 霞(广东省 兽药与饲料监察 总所，广东广 州5 1 0 2 3 0)收稿 日期 2 0 0 3 0 1-0 8 文献标识码 B 文章编号 1 0 0 21 2 8 0(2 0 0 3)1 00 O 4 4 0 4 中图分类号 1 1 2 8 4 1 摘 要 简要介绍 了高效毛细管 电泳的六种主要分离模式及 其在分析 中药材 的生物碱、黄酮、有机酸、香豆素类、醌类、苷类等成分和 中药复方制剂 中的应用，并分析 了该技术的发展前景。关键词 高效毛细管 电泳；中药分析 中药成分复杂，品质受各种 因素制约。中药材 基源、产地、栽 培方法、生长环境、采收季 节及加工 处理过程不 同，对中药产品的质量影 响很 大，因此 如何保证药品质量、提高药物疗效是急待解决 的问 题。随着科学 技术 的进步，各种仪 器的发 展，用于 分离和分析中草药的仪器 日益增 多，其中高效 毛细 管电泳(HP C E)技术是 近几年分析化学 中发展最 为 迅速 的领 域 之 一_ l J。现代 毛 细管 电泳 技 术 由 J o r g e n s o n 和 L u k a c s 于 1 9 8 1年提出，该方法效率 高(每 1 m理论塔板数达 1 0 一1 0。)；分析时间短；柱上检测无 死体积；需要样 品体积很小(15 0 n L 的进样体积)；操作 条件 选择和操作模 式切换相 对 容易，便 于开发新的分析方法；一般在水相介质 中 进行分离，有 机废液可忽 略；仪 器易于 自动 化。因 此逐步应用于中草药分析、鉴定中。1 HP C E的分类及其基本原理。电泳是导电物质在 电场 中受吸引或排 斥而 引 起 的迁移运动，利用这种差速 移动作为分离的模式 称为电泳技术。H P C E主要有六种分离模式。1 1 毛细管区带电泳(C Z E)C Z E是最常用 的一 种毛细管 电泳 分离模式。它是通过 在充满 电解 质 溶液的毛细管中，不 同质荷 比的组分在电场作用下 迁移速度 的不同而进行分离 j。1 2毛细管胶束 电动色谱(ME K C)ME K C是在 缓 冲液体系中加人表面活性剂，当表面活性 剂浓度 大于其临界胶束浓度时，则在运行缓 冲液中形成胶 束。因此，在 ME K C体系中实际上存在着类似于色 谱 的两相：一个是流动 的水 相，另一个 是相对 固定 的胶束相，溶质在这两相之 间分配，并 由于其 在胶 束 中不 同的分配差异而实现分离。1 3 毛细管凝胶 电泳(C G E)及无胶 筛分(N G S)C G E是分离效率最高的一种 C E模式(N1 0 )。它是一种把普 通凝胶 电泳 移到毛细管 中进 行的凝 胶 电泳。1 4 毛细管等 电聚 焦(C I E F)C I E F是依 据样 品 组分(主要是两性化合物)的等电点不同而实现分 离的一种技术。即有一个 p H的位置梯度，那么有 可能使有不 同等电点 的分子 分别聚焦在不 同 的位 置上，不作迁移而彼此 分离，这就是所谓 的等 电聚 焦分离过程。1 5 毛细管等速 电泳(C I T P)与 C Z E技术 一样，C 1 T P的分离原理也是依据样 品组分 电泳淌度 的不 同来进行分离。1 6 毛细管 电色谱(C E C)C E C是在毛细管中填 充了液相色谱用的固定相 载体，使被分离组分在这 些 固定相载体上进行保 留和分配，它与液相色谱技 术的区别之处在于前者是以电渗力为驱动力，而后 者是 以压力为驱动力。2 HP C E分析中草药的优越性 H P C E用于分析中草药，具有以下优势：分离 模式多，适合于 中草 药 中存在 的各类 物质 的分 析。简化对样品前处理的要求；分析时间一般 比 何绮霞(1 9 6 3年)，女，副主任药师，主要从事中、西兽药的质量标准研究。维普资讯 http:/ 2 0 0 3，3 7(1 0)：4 4 4 6，3 2 何绮霞 中国兽 药杂 志 4 5 H P L C短；由于柱效高，有可能使 同一个分离条件 适合多种样品中多组分 的分析；H P C E所 采用 的 毛细管柱 易于全面清洗，不必担心柱污染而报废；所用的化学试剂少，价廉，分析成本 低，特别适合 于我 国国情。3 H P C E在 中药分析 中的应用 对中药及其制剂的成分分析，目前较常用的方 法为 C Z E和 ME K C。已有关 于芍药、人参、黄芩、黄 连、黄柏、麻黄、大黄、甘草等 中药材以及葛根汤、小 柴胡汤、加味逍遥散等几十种中药 复方及其制剂 中 某些药效成分分析 的报道。3 1 生物碱 生物碱 在 自然 界中分布很广，一般 都具有强烈 的生理活性，有的甚至具有很强 的毒剧 作用，如乌头 中所含 的乌头碱，因此 建立生物碱 的 分析方法十分必要 和重要。在 中草药 的毛细管 电 泳分析 中，它是 被研 究得 最 多的一类 标 志性化 合 物。由于生物碱在低 p H下荷正 电，所 以生物碱常 常能在 p H低于 7的缓冲溶液 中得到分离分析。对 于生物碱的分析，多采用 C Z E模式，如麻黄及其制 剂 中的 6种麻黄碱 的毛细管 电泳(C E)分析，黄 连 中 8种季胺碱的 C Z E分析。3 2 黄酮及黄酮苷对黄酮类化合物 的 C E分离，主要采用 ME K C及 C Z E两种方法，而其 中以 ME K C 为多，如银 杏提取物 中 6种黄 酮 的分 析 。若用 C E MS技 术分析 黄酮，可同时进行 定量 和结 构分 析。3 3 有机酸C h e n t 3 用 C Z E法，1 0 m i n内分离 了 甘草酸和甘草次酸，并 测定 了 2 1种成药 中二者 的 含量，获得 了良好的重现性和 回收率。3 4 香豆素类 香豆素类 中草药成分 的分离，如 独活中 9种香豆素的分离分析 j。3 5 醌类化合物醌类物质是 中草药中存在 的另 一类重要 的成分，关于大黄中五种葸醌的分析 比较 热 门。宗玉英等 用 ME K C模式 分离测定 了各种 大黄中芦荟大黄素和大黄酚等 5种成分。3 6 苷类化合物H a n d a 。对芍药中主要成分 芍 药苷和氧化芍药苷进行含量测 定，采用 内标法，定 量结果和 H P L C相同，据称 可作为一 种标准检测方 法。人参 甲醇提取 液 中的人参皂 苷 R b l、R b 2、R c、R d、R e、R f、R g，可用 ME K C实现相互 分离，重现性 好。3 7 中药复方制剂分析 L i u等 在分离 6种麻 黄碱的基础上，对 l 9种含麻黄的中药复方制剂(如 防风通圣散、小青龙汤、桂枝芍药散等)中麻黄碱和 伪麻黄碱的含量进行了测定。他们在建立 了黄柏、黄连有效成分 的分析方 法后，又对 2 3种含这两 味 药物的复方制剂 中小檗碱、巴马亭和黄连碱的含量 进行了测定。小承气汤 由大黄、枳壳、厚 朴等 中药 组成，含有柑橘苷、厚 朴酚、大 黄素、番泻苷等 6种 不 同的活性成分，用 ME K C可 在 2 0 mi n内将上述 成分基线分离，并 可作定量分析 。4 H P C E的发展前景 目前，T L C和 H P L C仍然是分析 中成 药的主要 手段，但是 T L C分离度 低，重现性较差，不 易定量；HP L C对实验条件及样品处理要求较严。与这两种 方法相 比，C E用于分析时，除 了分离效率高和分析 时间短外，还具有 以下优点：除 了可以配与 H P L C 同类型的检测器进行常规 的定性定量分 析外，还可 以采用 C E MS或 C E MS MS联机方式，将 C E的 高分离效率和 MS的定性 优势结合起来，建立药材 和复方药物 的指纹 图谱定性 和多种成分 的多指标 定量 一；由于毛细管不易被污染，即使 被污染也 容易清洗再生，因此用 C E分析 中药 制剂如蜜丸等 具有一定 的优越性；毛细 管电泳的微量分析，尤 其是采用柱上 富集技术来提 高灵敏度，可 以使 C E 检测灵敏度 与 H P L C媲美 玎 。由于 C E所需 样 品量小，可实现微量至痕量分 析，如 配高灵敏 度检 测器可进行单细胞分析，可望在中药制剂 的小剂量 药物分析、毒剧性中草药和名贵中药 的微量组分分 析以及它们 的代谢产物分析领域得到迅速发展。毛细管 电泳与其他 色谱法相 比也有一些 不足 之处：C E的定 量精密度低 于 H P L C，采用 电动进 样和外标法定量 时 的峰 面积精 密度 和定量 精密度 尤其难以接受。采用 内标法 可将 定量精密度 控制 在 2 以内 J，如经过全 面的方法学确证后，定 量精密度可低 于 1 2 7 。由于毛细 管电泳柱 上检测 光程短，其 浓度灵敏度 比 H P L C低 12个 数量级 。虽然 采用 柱 上 富集 技 术 可提 高灵 敏 度，但 由于该技术 的影 响因素较多，其定量 精密度 难以达到满意的程度。对于一般 中药 的分析，可 以 采用柱前富集 的方法，或增加样 品溶液浓度(一般 每毫升毫克或微克级即可满足定量要求)。维普资讯 http:/ 4 6 中国兽药杂志 2 0 0 3，3 7(1 0)：4 4 4 6，3 2 何绮霞 尽管如此，毛细管电泳仍然是一种潜力巨大的 分析工具。参考文献：1 T e r a b e S，O t s u k a K，I c h i k a wa K，e t a 1 E l e c t r o k i n e t i e s e p a r a t i o n w i t h m i c e l l a r s o l u t i o n s a n d o p e n t u b u l ar c a p i l l a r y J A n a l Ch e m，1 9 8 4，5 6：1 1 1 2 We me r G，K u h r C a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s J A n al C h e m，1 9 9 0，6 2：4 03R 一 41 4R 3 C h i e n R L，B u r g i DS O N c o l u mn s a mp l e c o n c e n t r a t i o n u s i n g fi e l d a mp l i fi c a t i o n i n C Z E J A n al C h e m，1 9 9 2，6 4(8)：4 8 9 A 4 J W J o r g e n s o n Z o n e e l e c t r o p h o r e s i s i n o p e n t u b u l ar s c a p i l l a r-i e s J A n al C h e m，1 9 8 1，5 3：1 2 9 8 1 3 0 2 5 J w J o r g e n s o n H i g h r e sol u t i o n s e p a r a t i o n s b a s e d o n e l e c t rep h o r e-s i s and e l e c t r o o s m o s i s J J C h r o m a t o g r a p h，1 9 8 1，2 1 8：2 0 9 2l 6 6 郑虎 占，董泽宏，余 靖中药 现代研究与应用(第 1版)第 6辑 M 北京学苑 出版，1 9 9 9 6 0 5 5 6 0 5 6 7 林柄承毛细管 电泳导论 M 北 京：科学 出版社，1 9 9 6 8 3一 l 5 9 8 魏 伟，王义明，罗 国安中成药 成分 的高 效 毛细管 电泳 分析 J 药学学报1 9 9 7，3 2(6)：4 7 6 4 8 0 9 I J i u Y M，S h e u S J D e t e r mi n a t i o n o f e p h e d n n e alk alo i d s b y c a p i l l a r y e l e c t mp h o res i s J J C h rom a t o g r a p h，1 9 9 2，6 0 0：3 7 0 1 0 I J iu Y M，S h e u S J D e t e r m i n a t i o n o f q u a r t e ma r y alk al o i d s f r o m c o p t i d i s r h i z o ma b y c a p i l l a r y e l e c t r o p h o res i s J J C h rema t o-g r a p h，1 9 9 2，62 3：1 9 6 1 1 P G P i e t t a A p p l i c a t i o n o f m i c e l l a r e l e c t r o k i n e t i c c a p i H a r y c h rem a t o-g r a p h y t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f F l a v o n o i d d r u g s J J c h mma t o-g r a p h，1 9 9 1，5 4 9(1。2)：3 6 7。3 7 3 1 2A r a me n d i a MA，Ga r c i a I，L a f o n t F，e t a 1 D e t e r mi n a t i o n o f i s o fl a v o n e s u s i n g c a p i l l a r y e l e c t rep h o r e s is i n c o mbi n a t i o n wi t h e l ect r o s p r a y m ass s p e c t r o m e t r y J J C h r o ma t o g r a p h A，1 9 9 5，7 0 7(2)：3 2 7。3 3 3 1 3 C h e n H R，S h e u S J A n aly s i s o f g l y c y r r h i z i n a n d g l y c y r r h e t i n i c a c i d i n C Z E J J C h r o ma t o g r a p h A，1 9 9 5，7 1 0：3 2 3。3 2 8 1 4 C b e n H R，S h e u S J De te r mi n a t i o n o f g l y c y r r h i z i n and g l y c y r r h e t in i c a c i d i n tr a d i t io n a l Ch i n e s e me d i c i n a l p r e p a r a t i o n s b y c a p i l l a r y e l e c tr o-p h o r e s i s J J C h r o ma t o g r a p h A，1 9 9 3，6 5 3(1)：1 8 4。1 8 8 1 5 宗玉英，余满堂，朱志强，等胶束电动毛细管色谱法分离和 测定几种大黄 含量 J 药学学报 1 9 9 5，3 0(8)：5 9 4-5 9 6 1 6 H o n d a S，S u z u k i K，K a t a o k a M，e t a 1 An aly s i s o f t h e c o m p o n e n t s o f p aco n i a r a d i x b y c a p i ll a r y z o n e e l e(t rep h o res i s J J C h mma t o-g r a p h，1 9 9 0，51 5：6 5 3 65 8 1 71 w a g a mi S，S w a b e Y，N a k a g a w a T Mi c e l l a r e l ect r o k i n e t i c c h r o ma t o g r a p h y f o r th e analy s i s o f c rud e d r u g s(I II)S e p 蛐a t i 0 n of g i n s e n o s i d e s i n g i n sen g r a d i x J S h o u y o k nga k u Z a s s h i，1 9 9 2，4 6 (4)：3 3 9 3 4 7 1 8I Ji u Y M，S h e u S J D e t e rmi n a t i o n o f q u a r t e ma r y a l k a l o i d s fr o m p h e l l o d e n d r i c o d e x b y c a p i l l a r y e l ect r o p h o r e s i s J J C h r o m a t o-g r a p h，1 9 9 3，6 3 4：32 9 1 9 S h e u S J，L u C F D e t e r m i n a t i o n of s i x b i o a e t i v e c o mpon e n t s o f H s i a o c h e n g c h i t a n g b y c a p i ll a r y e l ect r o p h o r e s i s J J HR C，1 9 9 5，l 8(4)：2 6 9 2 7 0 2 0 罗国安，王 义 明中药 复方 有 效 部 分研 究 法 以及 理 论 初 探 J 中成药，1 9 9 7，1 9(8)：4 4 4 6 2 1 C h i e n RL，B u r gi D S ONc o l u mn s a mp l e c o n c e n t r a t i o n u s i n g fi e l d a mp l i fi c a t i o n i n C Z E J A n al C h e m，1 9 9 2，6 4(8)：4 8 9 A 2 2 Z h ang C h K，T h o mann WH e a dc o l u mn fi e l d a mp l i fi e d s a mp l e s t a c k i n g i n b i n a r y s y s t e m c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s：a ro b u s t a p p r o a c h p r o v i d i n g o v e r 1 0 0 0一f o l d s e n s i ti v i ty e n h anc e m e n t J An al Ch e m，1 9 9 6，6 8：2 5 2 3 2 3 U n g e r M，S t o c k i g t J I m p rov ed d e t ect i o n o f alk a l o i d s i n c r u d e e x t r a c t s a p p l y i n g c a p i ll a r y e l ec t r o p h o r e s i s wi t h fie l d am p l i fied s am p l e i n j e c t i o n J J C h r o ma t o g r a p h A，1 9 9 7，7 9 1(12)：3 2 3 2 4 Ah r i a K D，C l a y t o n NG，Ha r t M，e t a A n i n t e r c o m any c r o$一 v ali da t i o n e x e r c i s e o n c a p i lla r y e l ec t r o p h o r e s i s t e s tin g of d o s e u n i f o rmi t y o f p a r a c e t am o l c o n t e n t i n f o rmu l a t i o n s J C h r o m a t o g r a p h i a，1 9 9 4，3 9：1 8 0 2 5 Do s e E V，Gu i o e h o n G P r o b l e ms o f q u anti t a t i v e i n j ect i o n in c a p ri 1 a r y z o n e e l e c t mp h o res i s J A n al C h e m，1 9 9 2，6 6 4：1 2 3 2 6 A l t r i a K D，G o o d d a l l D M，R o g an MQ u anti ta t i v e d e t e r m i n a ti o n of d rug c o u n t e r i ron s t o i c h i o me t r y b y c a p i H a r y e l ect r o p h o r e s i s J C h roma t o g r a p h y，1 9 9 4，3 8(9 1 0)：6 3 7 2 7S o n g J Z h，H u ang D P，T i an S J，e t a D e t e r m i n a ti o n o f L-t h reo n a t e i n c alc i u m p rep a r a t i o n s b y c a p i l l a r y e l e e t r o p h o r e s i s w i t h i n d i r e c t U V d e t ect i o n J E l ect r o p h o r e s i s，1 9 9 9，2 0(9)：l 8 5 0 2 8 Son g J Z h，C h e n J，T i an S J，e t a 1 A s s a yf o r the d e t e r mi n a ti o n o f l o w d o s a g e f o rm o f f o r mo t e ml dr y s y r u p b y c a p i l l a r y e l e e t r o p h o r e s i s wit h h e a d。c o l u m n fi e l d amp l i fi e d s a mp l e s t a c k i n g J J P h a r m&B i o m e d A n al，1 9 9 9，2 1(3)：6 9 2 9 Son g J z h，X uH X，T i an S J，e t a 1 D e t e r mi n a ti o n o f q u i n o fi d i n e alk alo ids i n t r a di ti o n al C h i n e se h e r b al d r ugs by n o n a q u e o u s c a p i l l a r y e h c t r o p h o res i s J J C h r o m a t o g r a p h A，1 9 9 9，8 5 7(1 2)：3 0 3 3 0 A l b i n M，G ms s m a n P D，Mo r i n g S ES e n s i ti v i t y e n h a n ceme n t f o r c a p i l l a r y e h c t r o p h o res i s J A n al C h e m，1 9 9 3，6 5：4 8 9 A(下转 3 2页l 维普资讯 http:/ 3 2 中国兽药杂志 2 0 0 3，3 7(1 0)：3 03 2 伍金娥，等 而且还可降低药物 的不 良反应 和费用。在 人医I 临 床上 已将 P AE理论指 导临床用药，P r i n s等将庆大 霉素采用两种不同给药方式，即 4 m g k g 体重、1日 1 次用药 和 1 3 3 m g k g体重、1日 3次用药，结果 表明，1日 1 次给药方案同样能取得很好 的疗效，且 毒性 比 1日3次给药方案小。然而，在兽医临床 上，如何充分利用 P A E的特点，结合药动学参数优 化给药方案，还有待于进一步研究。参考文献：1 Z h a n e 1 T h e p o s t a n t i b i o t i c e ff e c t：a r e v i e w o f i n v i t r o a n d i n v i v o d a t a J D I C I ，1 9 9 1，2 5(2)：1 5 3 1 6 3 2 戴 自英临床抗菌药物学 M 北京：人民卫生 出版社，1 9 8 5 6 47 3 王浴生抗 生素后效 应及其 临 床意 义 J 中 国抗生 素杂 志，1 9 9 6，2 1(4)：3 0 6 3 1 5 4De b b i a E A，P e s c e A，S e h i t o GC I n v i t r o 强 e 明 缸 t o f t h e p o s t a n t i bi o t i c e ffe c t o f l o me fl o x a c i n a g a i n s t g r a m-p o s t i v e a n d g r a m n e g a t i v e p a tho g e n s J A m J Me d 1 9 9 2，9 2(4 A)：4 5 s 一 4 7 s 5王志强，陈杖榴兽 用氟喹诺酮类 的抗 菌后效 应、抗 菌后 亚抑 菌浓度效应、亚抑 菌 浓度效 应 J 中 国兽药 杂志，2 0 0 1，3 5 (5)：1 3 1 7 6朱 汝锦司帕沙星 和环丙沙 星对 绿脓 杆菌 和粪肠 球菌 体外 抗 生素后效 应 J 国外 医药抗 生素 分册，1 9 9 5，l l(6)：4 5 0 4 5 6 7Gu d m u n d s s o n AI mp a c t o f p H and c a t i o n i c s u p p l e me n t a t i o n o n i n v i t r o p o s t a n t i b i o t i c e ff e c t J A n t imi c r o b Ag e n t c h e m o d a e r，1 9 9 1，3 5(1 2)：2 6 1 7 2 6 2 4 8 王 晓 陶，雷 振之，鞠长 德环丙沙 星、头孢 他啶、头 孢米诺、氨 曲南、亚胺 培南 西 司他 丁和 奈 替 米星 的体 外 抗 生 素后 效 应 J 中国抗生素杂志，1 9 9 6，2 1(3)：2 2 0 2 2 4 9徐 玉红，张华安抗 生素后效 应及 其临床 意义 J 中 国医院 药学杂志，1 9 9 6，1 6(1 2)：5 4 3 5 4 4 S t ud y o n t h e po s t a n t i b i o t i c e ffe c t o f s e v e n a nt i m i c r o bi al a g e nt s a g a i n s t S au r e u s a nd E c o i l WU J i n e ，L I D e x u e ，WAN G D a j u (1 T h eI n s t it u t e 矿V e t e r i n a r yP h a r m a c e u t ic a l s Hu a z h o n g A g r i c u l t u r e U n i v e r s it y，Wu h a n，Hu b e i 4 3 0 0 7 0；2 T he A n i m a l Hu s b a n d r y a nd V e te r i n a ry E p i d e micD i s e a s e B u r e a u，Wu h a n，Hu b e i 4 3 0 0 7 0；C h i n a)Ab s t r a c t：T h e i n v i t r o p o s t a n t i b i o t i c e f f e c t s(P A E)o f c i p r o fl o x a c i n，l o me fl o x a c i n，n o r f l o x a c i n，e n r o fl o x a c i n，g e n t a my c i n，p e n i c i l l i n a nd a mpi c i l l i n a g a i n s t Sau r e u s a n d Ec o i l we r e d e t e c t e d Di l ut i o n me t h o d wa s u s e d i n s t e a d o f r e mo v i ng d r u g s Th e g r o wt h o f b a c t e ria wa s mo ni t o r e d b y Mu e l l eHi n t o n a g a r c o l o n y c o u nt i ng Th e r e s u l t s s h o we d t h a t s e v e n d r u g s h a d o b v i o u s P AE o n S au r e u s，q u i n o l o ne s a n d g e n t a my c i n h a d l o n g P AE o n E c o i l，b u t B l a c t a m d r u g s h a d v e r y s h o r t P A E Ke y w o r d s：p o s t a n t i b i o t i c e f f e c t s(P A E)；S a u r e u s；E c o i f (上 接 4 6页)Th e u s e o f HPCE i n a na l y z i n g t r a d i t i o n al Chi n e s e m e di c i n e H E Q i x i a (G nan g d o n gI nst it u t e f o r V e t e r i nary D r a nd F e e d s t u ffs C o n t r o l。G u a n g z h o u-G nan g d o n g 5 1 0 2 3 0。C h i n a)Abs t r a c t：Th e a rti c l e d e s c rib e d t h e c l a s s i fic a t i o n，prin c i p l e a n d a p p l i c a t i o n s o f h i g h p e rfo r ma nc e c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s i n a na l y z i ng t h e t r a d i t i o n a l Ch i n e s e me d i c i ne Ke y wo r d s：h i g h p e r f o rm a n c e c a p i l l a ry e l e c t r m a n c e c a p i l l a ry e l e c t r o p h o r e s i s(H P C E)；a n a1)r s i s；t r a d i t i o n a l C h i n e s e me d i c i ne 、；1；j l 1 、；，j J l；，毒 每；fj f 毒I l ll 维普资讯 http:/