蛋白质剪切及其应用.pdf

!卷#期#$%年%月生物工程学报!#$%&%()*$+,(-.#(/%0$(,(12&()!*)#!+,-./#$%收稿日期：#$#0!$0!1，修回日期：#$#0!#0#$。基金项目：国家高科技研究发展计划项目资助（*)23%0!$#0$0440$!）。通讯作者。56(：230!$034271#27；8,9：230!$034271#27；:0;,?66A蛋白质剪切及其应用宋利萍黄华（中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京!$!$!）摘要蛋白质剪切是一种翻译后修饰事件，它将插入前体蛋白的中间的蛋白质肽段（CA6，A6-,(D-A6 E-,?0;6A）剪切出来，并用正常肽键将两侧蛋白质多肽链（:9A6，E(,F?D-A6 E-,?;6AB）连接起来。在此过程中不需要辅酶或辅助因子的作用，仅需四步分子内反应。CA6 及其侧翼序列可以通过突变产生高度特异性的自我切割用于蛋白质纯化、蛋白质连接和蛋白质环化反应，在蛋白质工程方面有广泛的应用前景。关键词蛋白质内含子，蛋白质剪切，环状肽，纯化，蛋白质工程中图分类号G3!1文献标识码H文章编号!$0%$3!（#$%）$#0$#40$3#$世纪$年代，蛋白质剪切的发现开辟了生物化学的新篇章。自从第一个蛋白质剪切元件 芽殖酵母中的&+H A6 基因被报道以来，在真细菌、古细菌、单细胞真核生物中已经陆续发现了!2 种 A6!。蛋白质剪切元件 A6 对于蛋白质工程来说是一个功能强大的工具。C0A6载体不仅可用于纯化，表达毒性蛋白，而且可以产生 CIJ（CA6;6K,A6K D-A6(?,A）所需的活性末端，引入在核糖体生物合成过程中不能加入的非天然的氨基酸（如磷酸化或糖基化修饰）、标签、发色基团、部分修饰或标记的蛋白质，研究结构活性之间的关系。此外，A6 还可以有效的介导蛋白质环化，提高蛋白质的稳定性。本文试从 A6 的结构、蛋白质剪切机制、A6 在蛋白质纯化、蛋白质连接、蛋白质环化等方面的应用作一概述。!CA6 的结构及蛋白质剪切的机制CA6 是一段存在于前体蛋白的蛋白序列，是在蛋白质剪切过程中被剪切出来的片段。大部分 A6 均具有双功能：蛋白质剪切活性和自导引核酸内切酶（L;?6K=.(60,B6）活性。自导引核酸内切酶活性是位点特异性的，在识别序列和功能上与核酸内含子的自导引核酸内切酶类似，可以在无 A6 的等位基因的双链 M*H 处定点切割，引起 A6的插入#。30%&+HC A6 的 N0射线晶体衍射图谱显示它具有双结构域。结构!包含 A6 序列的*末端（前!2#个氨基酸）和 O 末端（最后 44 个氨基酸），几乎均为折叠，为剪切结构域。结构#位于二者之间，为自导引核酸内切酶结构域%。突变研究及序列数理统计研究表明 A6 普遍拥有这种双结构域结构4，7。30%&+HC A6 以及 4/)P6.H A6 的自导引核酸内切酶结构域的缺失可产生仅具有蛋白质剪切功能的微 A63，1。45%QR-H 在天然状态下就缺乏内切酶结构域，但仍具有蛋白质剪切活性。这些发现提示 A6 的 O 端及*端可组装成蛋白质剪切的功能性结构域，而位于中间的结构域对于蛋白质剪切并不重要。但也有例外，在 IBDI(0C A6 内，核酸内切酶的结构域不同大小的缺失均可以导致失去剪切活性2。CA6有!$个保守的 A6 模体（图!）。其中 4 个位于自导引核酸内切酶结构域中。CA6 和下游 69A6 的第一个残基提供了蛋白质剪切的几乎所有的必要条件。对 A6的多重序列比较发现了 4 个在剪切邻近区域保守的残基。（A6*0末端的半胱氨酸，苏氨酸或丙氨酸。（A6 O0末端的天冬酰胺。（）位于下游 69A6 的*末端第一个残基处的半胱氨酸、苏氨酸或丝氨酸。此外 A6 倒数第二个组氨酸可辅助 A6 O 末端的切割反应!$。蛋白质剪切有%个明显的特点：（!）蛋白质剪切完全由蛋白质内含子的氨基酸介导。（#）蛋白质剪切是一个分子内过程。（%）蛋白质剪切不需要辅酶或代谢能，其过程主要涉及键的重排。蛋白质剪切分为 4 步（图#）：（!）在剪切体的上游，A6的第一个残基半胱氨酸或丝氨酸（S6-!）的侧链发生*0S 或*0T 酰基重排，产生具有易断裂肽键的线性酯键中间体，在中性 DL 条件下，酰胺键0巯酯键之间的平衡趋向于形成酰胺键。这种巯酯键关联在巯基试剂存在的条件下，易发生亲核万方数据图!蛋白质内含子模体#$%&!()*$(+,)$-./*01)*2+$(34 3(5 61)*2+$(34 784$9$(%2*%$,(-,2+)/*784$9$(%5,+3$(，:,+$(%;(5,(7?、0、=、0A、#、B 32*)/*784$9$(%+,)$-7&094*,8/$4*7 32*C,D*5置换，形成具有巯酯键末端的靶蛋白。如果替换$()*$(0 末端的半胱氨酸或丝氨酸（E*2!），0 端剪切体肽键的切割就会完全被封阻。（）通过剪切位点 6 末端的半胱氨酸或丝氨酸攻击线性酯键中间体形成分枝酯键中间体。剪切连接处下游半胱氨酸的巯基或丝氨酸，苏氨酸的羟基亲核攻击上游剪切处的前面的羰基碳原子，导致 0 端*D)*$(转移到 6 端*D1)*$(第一个残基的侧链上。这种分支结构的形成是可逆的。（F）()*$(6 末端剪切处的天冬酰胺环化形成琥珀酰亚胺环，同时分枝酯键中间体断裂，产生带有 6 末端琥珀酰亚胺环的$()*$(和通过酯键连接的两个*D)*$(。倒数第二个氨基酸组氨酸对于邻近天冬酰胺的环化有辅助作用。组氨酸替换成其它氨基酸时，会影响 6 末端的切割反应。（A）琥珀酰亚胺环水解，*D)*$(之间的酯键发生 G10 或 E10 酰基重排，产生稳定自然的肽键!。图 蛋白质剪切的机制#$%&./*+*9/3($7+,-82,)*$(784$9$(%!()*$(介导的蛋白质纯化()*$(有很多通用的模体，提示它们有共同的进化起源。然而，每个$()*$(在其各自的宿主中都经过很长时间的进化来优化剪切过程，因此对各自剪切位点邻近的氨基酸有一定的喜好。对于这些在$()*$(中参与肽键形成、断裂的残基的研究为$()*$(的应用打下了坚实的基础。()*$(与*D1)*$(几乎没有序列同源性，天然的*D)*$(常常可以替换成外源的蛋白质而不影响$()*$(的剪切活性。这一点是$()*$(作为融合蛋白进行蛋白质纯化的理论基础。我们可以将靶基因与 0 或 6 末端修饰过的$()*$(融合，纯化标签嵌在相反方向或者$()*$(的内部，融合蛋白表达、纯化后，通过诱导$()*$(的切割活性，释放出靶蛋白（图 F）。基于$()*$(的蛋白纯化技术与其它系统相比，该系统无需使用蛋白酶，避免了蛋白酶切割所带来的非特异性酶解，也无需进一步纯化去除蛋白酶，提供了一个省时经济的方法!。根据蛋白质剪切位点氨基酸替换的类型，蛋白质剪切可以分为$()*$(0 末端剪切和$()*$(6 末端剪切（图 F）。到目前为止，商业化的表达载体中利用的$()*$(有!#BH2?、!$%II!、&#JK?。下面就两种纯化策略举例说明。!#在靶蛋白的$末端融合%&(%&，在%&(%&)末端剪切（图*左）8.L=!载体将靶蛋白融合在 E9*JK?$()*$(的 0 端，几丁质结合蛋白纯化标签$()*$(融合在$()*$(的 6 端。E9*JK?$()*$(6 末端剪切位点的天冬酰胺被突变成丙氨酸，封阻$(1)*$(6 末端的自剪切，仅允许由半胱氨酸 01E 酰基转移介导的$()*$(0 末端的切割。亲核试剂 M.、1巯基乙醇或半胱氨酸可以通过攻击巯酯键，诱导$()*$(0 末端的切割。将靶蛋白融合在连有几丁质结合蛋白纯化标签的$()*$(的 0 末端，通过几丁质柱纯化融合蛋白前体后，在还原试剂存在的条件下诱导切割获得目的蛋白!。靶蛋白的产量取决于在细胞抽提物中获取的融合蛋白的产量及其柱上结合后的切割效率。在大肠杆菌中表达异源蛋白，尤其是当靶蛋白为真核生物来源的时候，常常会产生包涵体或者由于密码子使用的偏好不同而导致不表达。这些问题在 0 末端融合外源蛋白时就更加突出。低温诱导可以减少包涵体的形成，提高融合蛋白的折叠及可溶性。切NO生物工程学报!卷万方数据图!#$%&#介导的蛋白质纯化示意图(&)*!#$%&#+%,&-$%,./0$%&#.1/&2&3-$&0#割效率主要受与&#$%&#切割位点邻近的靶蛋白的氨基酸序列的影响。以麦芽糖结合蛋白为例，45 多种氨基酸中的绝大多数氨基酸都不会影响融合蛋白的纯化及 677 介导的切割。当靶蛋白 8 末端的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和苏氨酸时，体内切割效率提高，会导致融合蛋白的产量下降。当靶蛋白 8 末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸时，只有在高温和长时间的诱导才能诱导融合蛋白的切割。如果&#$%&#附近为脯氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺时，677诱导的切割根本无法进行4。因此，在使用这种载体时，往往需要向剪切位点附近添加额外的甘氨酸，降低体内的切割效率，提高体外的切割效率。!在靶蛋白#末端融合$%&$%，在$%&$%(末端剪切（图)右）.79:4载体将;3%&#$%&#倒数第二个组氨酸突变为谷氨酰胺，削弱了&#$%&#8 末端的天冬酰胺介导的切割反应，同时将 8 端蛋白质%?$%&#的第一个氨基酸半胱氨酸突变为丙氨酸，封阻体内剪切。亲和标签插入在&#$%&#自导引核酸内切酶结构域处，不影响&#$%&#剪切结构域的结构和剪切活性。此外，在&#$%&#的 A末端还融合了一小段 5 个氨基酸左右的 端%?$%&#用来提供翻译起始位点来优化表达。靶蛋白的 末端紧邻&#$%&#的 8 末端。这种表达载体表达的融合蛋白前体产量较高，体内不发生剪切反应，剪切位点的切割完全在体外来进行。靶蛋白 末端的氨基酸会影响&#$%&#8 末端的剪切!。绝大多数氨基酸在 BC、D5E 或者 4!C、BE，可以介导 F G5H的切割，在 DC时，蛋氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺可以介导有效的切割，而缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸会抑制&#$%&#8 末端的切割。靶蛋白 末端的色氨酸、半胱氨酸和苏氨酸可以导致体内剪切，使融合蛋白的产量下降4。)#$%&#介导的蛋白质连接（IJ）和表达蛋白连接（KIJ）引入非天然的氨基酸来改变蛋白质的结构及功能，将会大大提高我们对于蛋白质的理解，为生物医学研究提供新的工具，创造出新的治疗药物。例如蛋白质的位点特异性磷酸化修饰、引入荧光标签、自旋共振探针、交联试剂等可帮助我们深入地了解生物学过程，然而目前引入非天然氨基酸的方法仍然困难重重D。在天然化学连接中，一个含有 末端的半胱氨酸的肽与一个拥有 8 末端巯酯键的蛋白质连接，在连接位点形成天然肽键G。然而，到目前为止，用于天然化学连接的含有 8 末端巯酯键的的肽仅能通过化学合成来产生，而该方法在技术上要求苛刻，且有片段大小的限制（LGM6）。蛋白质剪切可以产生重组的 8 末端巯酯键。蛋白质剪切的第一步 A;（或 AN）酰基转移，端%?$%&#转酯至位于&#A$%&#氨基端的半胱氨酸O色氨酸O苏氨酸残基的;P 或 NP 侧链上。基于这个原理，我们可以设计突变，使&#$%&#仅仅能促进蛋白质的剪切的第一步B。融合表达在这样的&#$%&#氨基末端的蛋白可以通过分子内硫酯键的转酯反应被巯基试剂（=K;，$E&0.E%#0Q）切割，产生重组的!巯酯键R。含有氨基端半胱氨酸残基的蛋白和拥有羧基端!巯酯键的肽在含有巯基试剂的条件下可以产生巯酯键介导的化学浓缩，然后;A 酰基转移，形成天然的肽键S。这个过程叫&#$%&#介导的蛋白质连接（IJ）。用于 IJ 的蛋白片段既可以是化学合成的也可以是基因表达产物。最初，IJ 仅用于将拥有羧基端!巯酯键的重组蛋白与合成的含有氨基端半胱氨酸残基的肽段相连接，形成荧光标记的蛋白、特异性修饰的蛋白（如磷酸化），合成细胞毒性蛋白质（T-U%，!#内切核酸酶）V，45。=1&/D用KIJ方法产生含有磷酸化的酪氨酸肽段来研究磷酸化对于U/3 酪氨酸激酶活性和构象的影响。IJOKIJ 的下一步飞跃是在天然条件下连接两个表达蛋白4即表达蛋白连接（KIJ，K?./%UU%,./0$%&#Q&)-$&0#）（图 D），运用该技术区段性用同位素标记蛋白，大大提高了=T 蛋白质结构的分辨率。同时，连接多个合成或表达的肽段也成为可能。以 8 末端片段起始，顺序地向其 端加入片段，每个片段必须拥有一个羧基端的!巯酯键和一个氨基端的被屏蔽的半胱氨酸。当连接反应发生后，这个半胱氨酸通过蛋白酶消化解屏蔽而进行下一轮的连接。基于&#$%&#的蛋白质纯化载体通过产生具有反应活性末端的蛋白质扩展了天然化学连接的应用范围。在核糖体生物合成过程中不能加入的如磷酸化或糖基化的非天然的氨基酸、标签、发色基团等等都可以使用 IJ 技术引入到蛋白质中去。IJOKIJ 加速了对于腺体A配体结合、转录后修饰对于酶活稳定性、亚单位相互作用的生化及生物物理分析的研究进程。*#$%&#介导的蛋白质环化环化的蛋白质由于其!个明显的优势而备受生物学家G44 期宋利萍等：蛋白质剪切及其应用万方数据图!表达蛋白连接#$%!&()*+*,()-.*#/0#$1.#-/的青睐。（2）稳定性好。这是由于环化的蛋白质可减少非折叠状态的构象熵值。（3）折叠速率快。这是由于其减少了折叠途径的数目。（4）对于氨基端和羧基端的蛋白酶具有抗性33。环化的蛋白因其不同寻常的热稳定性和生物活性在医药和工业上备受重视。5-0,*)6*)$1/,7)*#$8.-/通过化学交联方法，形成肽骨架9 末端和 7 末端的肽键而产生了第一个环化蛋白:牛胰腺胰岛素抑制剂（;）34，然而这种方法并不适用于结构并不十分清楚的大蛋白质。最近，#/.*#/已经被用来介导蛋白质或肽的环化。可以分为两种方式进行环化。!#体外环化图?/.*#/介导的体外环化3!#$%?!#$%&A0#B1.#-/(=C9 DA+.*E3!=8*=C9+A+.*E+1/,F#8*+1.1)$*.()-.*#/（(）6*.F*/.F-#/.*#/+1/,1/()-,G*1/9:.*)E#/10 A+.*#/*1/,1 7:.*)E#/10.8#-*+.*)-/.8*+1E*61.*)#100A*()*+*,()-.*#/%/.*#/2，)*0*1+*+1/9:.*)E#/10 A+.*#/*-/.8*.1)$*.()-.*#/%K.8#-0)*1$*/.#/,G*+0*1J1$*-H/.*#/3 1/,)*0*1+*+.8*.1)$*.()-.*#/F#.8 1/1.#J1.*,7:.*)E#/10.8#-*+.*)%=F-)*1.#-/(1.8F1A+1/-G)，*#.8*)1/#/.*)E-0*G01)*1.#-/.81.0*1,+.-(-0AE*)#B1.#-/-)1/#/.)1E-:0*G01)*1.#-/.-$*/*)1.*1#)G01)()-.*#/%/6-.8(-+#6#0#.#*+1(*(:.#,*6-/,#+H-)E*,G)#/$.8*0#$1.#-/)*1.#-/其中一个方法便是在同一个表达蛋白中产生具有 9#/:.*#/:靶蛋白:7#/.*#/形式的融合蛋白。在体外，经巯基试剂及(L 诱导切割，产生 9 末端的半胱氨酸和 7 末端的巯酯键，然后 9 末端和 7 末端反应，产生环化蛋白或串联蛋白3!。基于这一原理的(=C93!系统（图?）已经成功地环化了)%*+$硫氧还蛋白（23MI），麦芽糖结合蛋白（!3MI），脑结合肽（N11），血小板凝集抑制剂 O5I（2P11），7IO:L4Q73（2R11）22。另一种方法使用#/.*#/9 末端的切割载体来表达靶蛋白。将位点特异性的蛋白酶识别序列融合在靶蛋白 9 末端的半胱氨酸的邻位，表达纯化出融合蛋白后，在体外经蛋白酶切产生 9末端带有半胱氨酸的靶蛋白:#/.*#/:7;I 的融合蛋白，然后 9末端半胱氨酸攻击#/.*#/7 末端巯酯键，形成环化分子22。这种自环化的反应的成功与否在很大程度上都取决于活性位点的暴露情况和靶蛋白的折叠状态如何。!$体内环化图 R/.*#/介导的体内环化3R#$%R/.*#/E*,#1.*,$#$#A0#B1.#-/（D7STVD，.1)$*.()-.*#/）6*.F*/$*/*+H-).8*7:#/.*#/（7）1/,9:#/.*#/（9）-E(-/*/.+-H 1/#/.*#/%&()*+#-/#/1+G#.160*8-+.A#*0,+1 HG+#-/()-:.*#/.81.H-0,+.-$*/*)1.*1/1.#J*#/.*#/%=8*#/.*#/1.10AB*+.8*1.1M-H 1+#,*81#/G0*-(8#0*H)-E.8*1)6-A:.*)E#/G+-H.8*VD G(-/.8*1)6-/A0 1)6-/-H.8*1E#/-1#,1.8*1E#/-:.*)E#/G+-H.8*VD.-$*/:*)1.*1 01.-/*01)#1.#/.*)E*,#1.*%=8*A0#()-,G.#+0#6*)1.*,1+1 01:.-/*6A A0#B1.#-/-H.8*1+(1)1$#/*)*+#,G*1.8*1)6-A:.*)E#/G+-H 7蛋白质和肽的体内环化对于在体内大规模产生环化的蛋白质和肽至关重要。这个技术同时也为在体内产生大规模的用于功能筛选和生物物理鉴定的环化肽库提供了可能。因为它可以在生物体内产生更稳定的没有副产物的环化蛋白，便于体内功能筛选和工业化生产3?。体外环化蛋白因其需要通过在体外化学处理产生 7:末端的巯酯键中间体而受到限制。这种困境可以通过利用人工或者是天然存在的分裂的#/.*#/的蛋白质的反式剪切活性得以解决。基因重建试验说明#/.*#/可以缺失自导引核酸内切酶结构域而不影响*.*#/的剪切活性，#/.*#/可以分开表达为两个多肽链，通过非共价结合而重新获得剪切的活性。通过将靶蛋白的基因表达在分裂内含子的中间，表达具有 7 端#/.*#/:待环化的目3?3生物工程学报2N 卷万方数据标蛋白!端#$%&#$结构的融合基因，在体内通过分子内的反式剪切作用，靶蛋白的氨基端和羧基端在体内通过正常的肽键连接而产生环化产物（图）。这种方法叫做体内分裂#$!%&#$介导的肽或蛋白质的环化（()*+,-(）./。理论上讲，这种策略不仅适用于天然分裂蛋白，也适用于具有相似结构的人工改造蛋白。到目前为止报道的#$%&#$中，仅有 0 个适于在体 内 产 生 高 水 平 的 环 化 靶 蛋 白：!#$%&%()*(+1,-2301 4$56#$%&#$/，,./0(789#:;8;1-)!-78).#$!%&#$/，11)02$./03(*(的.$/4#$%&#$/，其中!#$%&%()*(+1,-2301 5#67#$%&#$由于其两端的肽段具有固有的亲和力，这种天然的#$%&#$显然更适于介导体内环化/?水平剪切的结果，它们在核酸水平上存在，在成熟的基因产物中消失。自从在/3 世纪 3 年代被发现，在#$%&#$的化学及结构基础方面以及#$%&#$的应用等诸多方面已经取得了令人瞩目的成就。对#$%&#$的蛋白质剪切及切割活性的调控为我们提出了蛋白质表达和操作的全新策略。改造的#$%&#$已经用来产生独特的反应基团而广泛地应用于表达蛋白纯化，连接，环化等方面。利用#$%&#$区段性标记蛋白扩展了 A 结构分析对于蛋白质大小的限制，并为应用 A 分析特异区域的构象改变及大分子量的多体蛋白质提供了可能/，/2。)$%&#$介导的环化提高了蛋白质的稳定性及生物活性。)$%&#$载体产生的蛋白质*末端的巯酯键在蛋白质化学中具有重要的价值。尽管#$%&#$的应用尚属起步阶段，但从近几年发表的文章来看，#$%&#$已经迅速地成为一个多功能的工具。我们拭目以待它在蛋白质工程方面作出更大的贡献。#$#%&#（参考文献）.B%=：CCD#:#$7:9E5%#F;1G&#HE5$15F1#IC J=#&%9:C#$%&#$;C/-&9I&9 K L1-9:%&#$;=I#F#$M:7#$%&#$;5$N B&NM&B:M 58%:=9:%&:IO;#;：;%98F%89&，78$F%#:$5$N&P:I8%#:$1-$33，.2，()（.）：.Q R 0 485$S，T#EDI&K(，U8#:FB:K?1*9O;%5I;%98F%89&:7-)!(F&)，5B:E#$M&$N:$8FI&5;&G#%B=9:%&#$;=I#F#$M 5F%#P#%O1-$33，.，*(：VVV Q VR R W5G5;5X#A，:M5E#(，(5%:G Y$)631)N&$%#7#F5%#:$:7%B9&F:9&9&M#:$;&;&$%#5I 7:9=9:%&#$;=I#F#$M:7%B&O&5;%ZE5.=9:%:HOE&1?95$N:E E8%5M&$&;#;%8NO:7%B&$%#9&ZA?.!N&9#P&N&$N:$8FI&5;&;&8&$F&1 8 9*3-&$:，.，)+)（/V）：.V2 Q.VR V :M5E#(，(5%:G Y，,BO5 Y，?$95X8 Y1-9:D#$M$:P&I&I&E&$%;7:9=9:%&#$;=I#F#$M#$%B&O&5;%ZA?.=9:%:HOE&：5;%8NO:7 9&=I5F&E&$%E8%5M&$&;#;5$N#$%95M&$#F;8=9&;#:$1;$#$)*/(，.，,-+（.）：0Q 2V *B:$M(，S8 A U1-9:%&#$;=I#F#$M:7%B&(5FFB59:EOF&;F&9&P#;#5&ZA?#$%&#$G#%B:8%B&$N:$8FI&5;&E:%#7;1 8 9*3-&$:，.，)+)（/V）：.VV2 Q.VV3 4&9DO;B#9&Z，:N 4，8$)631 T&$&%#F N&7#$#%#:$:7 5=9:!%&#$!;=I#F#$M N:E5#$：78$F%#:$5I E#$#!#$%&#$;8=:9%;%98F%89&=9&N#F!%#:$;5$N 5 E:N&I 7:9#$%&#$&P:I8%#:$1,./!4，.，(-（/.）：.R Q.R.2 8，S8 A U，+#8 S U1-9:%&#$%95$;!;=I#F#$M 5$N 78$F%#:$5I E#$#Q#$%&#$;:7 5 FO5$:D5F%&9#5I N$5L#$%&#$1 9*/&*:9*+&(4/)6，.2，,.*+（.Q/）：R/Q R0/B%=：CCGGG1$&D1F:EC$&DC#$%&#$;1B%EI.3(:8%BG:9%B A，?N5E 6，-5$&4$)631*:$%9:I:7=9:%&#$;=I#F#$MDO#$%#&$795ME&$%9&5;&EDIO1?&$719 80.#63，.2，,+（R）：.2 Q/.S8 A U，6P5$;*_91)$%&#$!E&N#5%&N I#M5%#:$5$N FOFI#H5%#:$:7&!=9&;&N=9:%&#$;1 1$)&=(，/33.，)-（0）：/V Q/./S8 A U，-58I8;1 5$N*B:$M(1 K8;#:$;%:;&I7!;=I#F#$M#$%&#$;7:9=9:%&#$=89#7#F5%#:$1 1$)&=(7#A:3，/333，.)/：0 Q R.2.0*B:$M(，A:$%&II:T 6，aB5$M?$)631 b%#I#H#$M%B&*!%&9E#$5IFI&5P5M&5F%#P#%O:7 5=9:%&#$;=I#F#$M&I&E&$%:=89#7O 9&F:ED#$5$%=9:%&#$;#$5;#$MI&FB9:E5%:M95=B#F;%&=1 0/3$*/4/*=(B$(，.2，)/（/）：V.3 Q V.V.R A8#9 ，(:$NB#4，*:I&-?1 6=9&;&N=9:%&#$I#M5%#:$：5 M&!$&95I E&%B:N 7:9=9:%&#$&$M#$&9#$M1,./!4，.2，(!（./）：3V Q.3.V 45G;:$-6，A8#9 ，*I59X!+&G#;)，W&$%(L1(O$%B&;#;:7=9:!%&#$;DO$5%#P&FB&E#F5I I#M5%#:$1!/*$#/$，.R，)/（V.2）：Q/R Q/V.*B:$M(，A&9;B5 K L，*:ED 4 T$)631(#$MI&!F:I8E$=89#7#F5%#:$:779&9&F:ED#$5$%=9:%&#$;8;#$M 5;&I7!FI&5P5DI&577#$#%O%5M N&9#P&N79:E 5=9:%&#$;=I#F#$M&I&E&$%1;$#$，.，,()（/）：/，?O&9;L，*:GD89$4，A8#9 1*B&E#F5I I#M5%#:$:7 7:IN&N9&F:ED#$5$%=9:%&#$;：;&ME&$%5I#;:%:=#F I5D&I#$M:7 N:E5#$;7:9 A;%8N#&;1,./!4，.，(/（/）：022 Q 00/(#&D:IN*，69$#L1)$%&#$!E&N#5%&N FOFI#H5%#:$:7 5;:I8DI&5$N 5E&ED95$&=9:%&#$*#F*F：78$F%#:$5$N;%5D#I#%O1 9*+&(-&$:，/33/，(/（/Q 0）：.0 Q./0 T:IN&$D&9M 4-，*9&#MB%:$61*#9F8I59 5$N F#9F8I59IO=&9E8%&N7:9E;:7 D:P#$&=5$F9&5%#F%9O=;#$#$B#D#%:91 8 13 9*3，.20，,/!（/）：R3 Q R.0/R 6P5$;*_9，L&$&9 _，S8 A U1 B&FOFI#H5%#:$5$N=:IOE&9#H5%#:$:7 D5F%&9#5IIO&=9&;&N=9:%&#$;8;#$M E:N#7#&N;&I7!;=I#F#$M#$%&#$;1 89*3-&$:，.，)+-（/）：.20V Q.200/V)G5#，+#$M&I?，-I8FX%B8$?1*OFI#F M9&$7I8:9&;F&$%=9:%&#$=9:!N8F&N#$P#P:8;#$M 5$59%#7#F#5IIO;=I#%-)!-78)#$%&#$79:E-O9:F:FF8;789#:;8;1 8 9*3-&$:，/33.，)+/（.）：.VR2 Q.VVR/(F:%*-，?D&I!(5$%:;6，5II A，5B$:$4*，L&$X:P#F(_1-9:N8F%#:$:7 FOFI#F=&=%#N&;5$N=9:%&#$;*#F*F1,./!4，.，(/（/R）：.002 Q.0R00V/期宋利萍等：蛋白质剪切及其应用万方数据!#$%&%，()*+,-，.(/,01-，2,&,3,01，-+%/%0*24 5&6)%7(89(/&(:$,;19%$%6(;,$1%:$%,;,)/()6)%?$(1:4!#$%$&()，AAA，!（!）：BC D E!F#$%&%，5$%G，-+%/%0*2，2,&,3,01 4 GHI%$(8 9(/&(:$9 1:,;,)/()6)%$(1:：(:$),;?9(/&(:$19%$%6(;,(;1:/$J)%*/J 1:$(1:?&(81,$(8;1/,$1%:4#$*+,%#-./0，AAA，#$（EA）：KBEB D KBEE%&()*+,-.*/*+0 1+2 3(4 5-.*/1(*+L#GM N1?O1:/P.QGM P*,?N1,:/!（12-.#.3.,$4 5,2,.#*-627 8,9,&$:%,2.#$&$;0，*#,2*,-，,#?#2;BBB，1:/19,:(R;+819%7()(8 6%9$),:9;,$1%:,;(81$1:/6)%(99$J,$)(&%7(9,:1:$():,;6)%$(1:=),/&(:$=)%&$J(6)%$(1:6)(*)9%)4 S*)1:/$J(96;11:/6)%(99$J(1:$():,;6)%$(1:=),/&(:$，1:$(1:，$)1/()(8$J(9(;=?(T191%:=)%&$J(6)(?*)9%)6)%$(1:,:8$J(%:%&1$,:$;1/,$1%:%=$J(=;,:01:/6)%$(1:=),/&(:$9，(T$(1:94 J(9(;=?,$,;+919)(U*1)(9:(1$J(),*T1;1,)+(:3+&(9:%)%=,$%)9,:8%:;+1:7%;7(9=%*)1:$),&%;(*;,)(,$1%:94 Q:*&,$,;+$1)(918*(9 1:1:$(1:9,:8=;,:01:/=),/&(:$9 J,7(J;(8$%$J(8(7(;%6&(:$%=$J(6)%$(1:96;11:/6)%(99,9,6)%$(1:(:/1:()1:/$%;4 V%:?$)%;,;(,7,/(%=$J(6(6$18(,$1%:%=)(%&,:1;1$,$(8)(,$(9 V?$()&1:,;$J1%(9$()，RJ1J(T6,:89$J(9%6(%=J(&1,;1/,$1%:1:6)%$(1:4 5:$(1:9,:%:=1/*),$1%:$%=%)&,+;1 6%;+6(6$18(%:919$1:/%=$J(9(U*(:(;1:01:/$R%1:$(1:9*;(9*&,)13(9$J()(:$,87,:(1:$J(&(J,:19&%=6)%$(1:96;11:/,:8 1$9,66;1,$1%:9 1:6)%$(1:6*)1?=1,$1%:，6)%$(1:;1/,$1%:,:8 6)%$(1:+;13,$1%:47)8 9&246)%$(1:96;11:/，1:$(1:，6)%$(1:6*)1=1,$1%:，+;1 6(6$18(，6)%$(1:;1/,$1%:I(17(8：B?!BB!J19 R%)0 R,9 9*66%)$(8 J:%;%/+IXS O)%Y($%=VJ1:,（G%4FKW?B!?BA?EE?B）4!V%)(96%:81:/,*$J%)4(;：FK?B?KEFC!FC；Z,T：FK?B?KEFC!FC；?&,1;：J;P*,:/(:($194,4:生物工程学报（双月刊，!:$;年创刊）=#年#月第!:卷第?*+)4)A&+1.B C*()/?+.08（C*D+(?.8，EA+2)2*+!:$;）F1&/?=#G.H!:IHY4:；9JR*J1:,Y%*):,;4:($4:J2*()2 6881$%)1,;%,)8%=VJ1:(9(%*):,;%=1%$(?J:%;%/+（_J%:/*,:*:，(1Y1:/BBBFB）J2*(&?*+?*)B：2QGM LJ(:/?N1,-+4&)2 685:9$1$*$(%=H1)%,?8(&+%=L1(:(9%A6.*4?)2 68L1(:(O)(99（K S%:/J*,:/J(:/(:(1Y1(，(1Y1:/BB，VJ1:,）%&*+()2 68(1Y1:/_J%:/0(O)1:$1:/N1&1$(8 V%&6,:+KD)4(*/,A64/&*-(*+N%,;O%9$#=1(9K*4(&*6A()2 68(1Y1:/*)(,*=%)S19$)1J1:,Y%*):,;4:($4:5LLG BBB?WBK国内邮发代号：F!?W国外发行代号：HCKBF定价：!FaBB 元VG?AAFb国内外公开发行EC!生物工程学报A 卷万方数据蛋白质剪切及其应用蛋白质剪切及其应用作者：宋利萍，黄华樑作者单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101刊名：生物工程学报英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2003,19(2)参考文献(28条)参考文献(28条)1.Scott C P;Abel-Santos E;Wall M;Wahnon D C Benkovic S J Production of cyclic peptides and proteinsin vivo外文期刊 1999(24)2.Iwai H;Lingel A;Pluckthun A Cyclic green fluorescent protein produced in vivo using anartificially split PI-PfuI intein from Pyrococcus furiosus外文期刊 2001(19)3.Kawasaki M;Nogami S;Satow Y Identification of three core regions essential for protein splicing ofthe yeast Vma1 protozyme.A random mutagenesis study of the entire VMA1-derived endonucleasesequence外文期刊 1997(25)4.Duan X;Gimble F S;Quiocho F A Crystal structure of PI-SceI a homing endonuclease with proteinsplicing activity外文期刊 19975.Otomo T;Ito N;Kyogoku Y;Yamazaki T NMR observation of selected segments in a larger protein:central-segment isotope labeling through intein-mediated ligation外文期刊 1999(38)6.Otomo T;Teruya K;Uegaki K;Yamazaki T,Kyogoku Y Improved segmental isotope labeling of proteinsand application to a larger protein外文期刊 1999(02)7.Chong S;Montello G E;Zhang A the C-terminal cleavage activity of a protein splicing element topurify recombinant proteins in a single chromatographic step外文期刊 1998(22)8.Xu R;Ayers B;Cowburn D Chemical ligation of folded recombinant proteins:segmental isotopiclabeling of domains for NMR studies外文期刊 1999(02)9.Severinov K;Muir T W Expressed protein ligation a novel method for studying protein-proteininteractions in transcription外文期刊 1998(26)10.Xu M Q;Paulus H;Chong S Fusions to self-splicing inteins for protein purification外文期刊 200011.Xu M Q;Evans TC Jr Intein-mediated ligation and cyclization of expressed proteins外文期刊2001(03)12.Southworth M W;Adam E;Panne D Control of protein splicing by intien fragment reassembly外文期刊1998(04)13.查看详情14.Perler F B Protein splicing of inteins and hedgehog autoproteo