冰冻切片实验步骤.doc

全部实验步骤

1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时
2 30%蔗糖脱水48小时以上
3 -250C包埋（冰冻切片机内）
4 冰冻切片
冰冻切片步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤：
冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子)

你确定你是冰冻切片吗？？？
冰冻切片不能用热修复啊！！！
以下是我的步骤：

1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。

2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

3 PBS冲洗，5分钟×3次。

4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

6 PBS冲洗，5分钟×3次。

7 显色剂显色（DAB）。

8 自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇
溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。
配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。

冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。
免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)
1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。
2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
3 PBS冲洗，5分钟×3次。
4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
5 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
6 PBS冲洗，5分钟×3次。
7 显色剂显色（DAB或AEC）。
8 自来水充分冲洗，复染，封片。

1. 冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，
2. PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）
3. 用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。
4. PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。
5. 5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
6. 甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。
7. 配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。
8. 放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。
9. 第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，
10. 滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。
11. 滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。
12. DAB显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低）
13. 终止DAB显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止5min，后在显微镜下观察是否有DAB颗粒附着。
14. 甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为6-10s，可不用酒精分化，直接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。
15. 水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）个3min，滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜
16. 封片后干燥1h(或者在通风橱吹风的情况下15min)，用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。观察照相。

针对脱片问题，我做了如下处理。但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。
自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过
1. 单涂胶：往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul，用另一张玻片推片，然后叠加其上，停留5分钟，中间推动玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片，滤纸吸干玻片下缘，置玻片架上600C烤干1h备用。
2. 双涂胶：往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul,单涂胶600C烤干,同样方法重复涂胶1次"600C烤干,备用。

我用过的尼氏染色的方法，效果不错。
1． 溶液配制：
(1) 溶液A：焦油固紫0.2g, 纯水500ml
(2) 溶液B：0.1M冰醋酸 冰醋酸3ml， 纯水500ml
(3) 溶液C：0.1M无水醋酸钠 无水醋酸钠4.1g，纯水500ml
(4) 溶液D：PH3.5~4.5醋酸缓冲液 B液94ml＋C液6ml
(5) 工作液：A液10ml＋D液90ml 过滤后使用，避光保存
注：焦油固紫遇光分解，整个过程应避光操作，可以用黑色塑料袋罩着。
2． 具体步骤：
⑴ 如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤⑵开始；如果为冰冻切片，从步骤⑵开始。
⑵ 将凉干的切片放入纯水中3～5min。
⑶ 切片放入焦油固紫染色液中1～1.5h。
⑷ 切片放入纯水中洗去浮色。
⑸ 切片放入70％－80％－95％的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。
⑹ 切片放入特殊分色液中褪背底（1：1：1的无水乙醇，氯仿，乙醚）。
⑺ 切片放入100％乙醇，5min×3次；二甲苯5min×3次，透明封固。整个过程要保证切片不能干掉。
3、结果
尼氏小体：深蓝紫色；核、核仁：浅紫色；背底：洁白无色。
我个人觉得特殊分色液挺重要的

Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）
1、试剂配制：
甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml
碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至水
（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟
（3）用碱性乙醇分化液分化数秒
（4）水洗
（5）苏木素复染2分钟
（6）水洗
（7）脱水,透明,封固
3、结果：淀粉样物呈桔红色。
4、类淀粉染色的应用：
确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，

冰冻切片脱脂问题：
0.5盐酸乙醇分化液 配置

直接免疫荧光法测抗原
基本原理
　　将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器
l 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
l 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
l 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
l 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
l 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
l 荧光显微镜
l 玻片架
l 滤纸
l 37℃温箱等。
实验步骤
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项
1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
（1） 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
（2） 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
（3） 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
　　如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化：
不同的是
1 免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同
2 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定
3 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察
4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）
5 条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久
6荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光
87荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照

注意事项
1. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。

2. 每次试验时 ，需设置以下三种对照：

（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物

（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物

（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
免疫荧光组织（细胞）化学技术：如何设置对照（直接法、间接法和补体法）
cyh(2010-07-28 11:23:08)
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　　为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时设置对照：
　　1、直接法
　　（1）标本自发荧光对照
　　标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称为自发荧光。
　　（2）抑制试验
　　可分为一步方法和二步方法。
　　一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。
　　二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。
　　（3）阳性对照
　　用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。
　　2、间接法
　　（1）自发荧光对照：同直接法。
　　（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。
　　（3）抑制试验：同直接法。
　　（4）阳性对照：同直接法。
　　结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。
　　3、补体法
　　（1）自发荧光对照
　　（2）荧光抗体对照
　　（3）抑制试验
　　（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1:10稀释，先作用于标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。
　　（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。
　　（6）阳性对照。
　　（1）~（5）结果阴性，（6）待检标本阳性时，则为特异性荧光。