bar基因_PAT蛋白和草丁膦的特性与安全性[1].pdf

bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性与安全性3刘洪艳 弭晓菊 崔继哲3 3(哈尔滨师范大学生物学系,哈尔滨150025)摘 要 在转基因技术得到认同并且给全球带来了巨大的经济和社会价值的同时,也引起了人们对其安全性的关注。目前在转基因作物中抗除草剂作物种植面积最大。本文对除草剂草丁膦及其抗性基因之一 bar基因及其产物PAT蛋白的一些特性和安全性作了阐述。bar基因及筛选剂草丁膦在植物基因工程中发挥着重要作用。bar基因无多效性,与食物中的DNA一样安全。PAT蛋白对小鼠无直接毒性,与已知毒素和过敏原无同源性、无糖基化位点,其热稳定性和消化稳定性无食物过敏原和毒素的特性,对人体和动物安全无毒性。草丁膦是一种生物除草剂,在土壤中易被快速分解,作物收获时未检出残留,对哺乳动物无毒性作用。关键词 bar基因;PAT蛋白;草丁膦;安全性中图分类号 Q948 文献标识码 A 文章编号 1000-4890(2007)06-0938-05Characteristics and safety ofbargene,PAT proteins and glufosinate.L I U Hong2yan,M IXiao2ju,CU I Ji2zhe(Departm ent of B iology,Harbin Nor m al University,Harbin150025,Chi2na).Chinese Journal of Ecology,2007,26(6):938-942.Abstract:Aswhile as the development of transgenic technology creates enor mous economic andsocial values,more attention has been paid to its safety.At present,the planting area of herbi2cide2resistant crops is the largest in transgenic crops.In this paper,the characteristics and safetyofbargene,PAT proteins and glufosinate were expatiated.Thebargene and glufosinate play im2portant roles in plant engineering,andbarsequences are considered to be as safe as any otherDNA in food and have no pleiotropis m.As the products ofbargene,PAT proteins are devoid ofadverse effects in mice,have no sequence homologywith known toxinsor allergens and no N2gly2cosylation sites,and do not possess the characteristics associated with food toxins or allergens byheat and digestive stability experiments.Therefore,they are safe for animal and human health.As a bio2herbicide,glufosinate can be rapidly degraded in soil,and has no remnants in maturecrops and no toxic effect on mammals.Key words:bargene;PAT proteins;glufosinate;safety.3 黑龙江省教育厅科学技术资助项目(10551101)。3 3 通讯作者E2mail:收稿日期:2006207218 接受日期:20072032161 引 言随着转基因生物技术的飞速进展,转基因的研究、中试、田间释放及商品化种植等取得了一系列突破性成就。自1983基因工程元年,抗除草剂转基因作物就一直处于主导地位,至1994年研制成功并大面积推广的抗除草剂作物已达26种,抗除草剂类型及品种已超过65种(苏少泉,2002)。1997年抗除草剂作物在转基因作物中种植面积达到54%,超过抗虫转基因作物上升至第一位,之后逐年增加,2001年为77%(阎新甫,2003)。随着转基因作物性状的增加,其所占比重有所下降,但仍居首位,2004年为72%。抗除草剂作物创造了巨大的经济价值,转基因作物为全球繁荣起了重要作用,但其安全性仍是人们关注的焦点。对于转基因生物的安全性国际上出台了一系列条约如:1993年经济合作与发展组织(OECD)提出“实质等同(substantial equivalence)”性原则,2003年正式生效的 生物安全议定书 等。bar基因是抗除草剂基因,编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase,PAT)。PAT蛋白能使除草剂草丁膦(glufosinate)脱毒,从而使转生态学杂志Chinese Journal of Ecology2007,26(6):938-942bar基因的作物具有抗除草剂的性状。草丁膦是bar基因的筛选剂之一,杀草迅速,能快速杀死100种以上的禾本科和阔叶杂草。它是传统除草剂,仍占除草剂市场的主体,2002年在除草剂销售中排名第5,销售额达3110亿美元(刘志俊等,2004)。2bar基因bar基因(bialaphos resistance gene)最初是从吸水链霉菌(Streptom yces hygroscopicus)中分离出来的,也能用化学合成方法得到。bar基因的作用机理在于其编码表达的产物PAT蛋白,能使草丁膦的自由氨基乙酰化,从而使草丁膦对植物无毒性作用。211bar基因与其筛选剂草丁膦在植物基因工程中的作用21111 遗传转化的筛选标记基因 bar基因作为筛选标记基因具有快速简便、高效,细胞产生的假转化体少,并且使植物获得优良的抗除草剂农艺性状的优点。它是目前用得最多的选择标记基因之一,如与B t基因共同导入到玉米(Zea m ays)(杜娟等,2003;张艳贞等,2004)、水稻(O ryza sativa)(姚方印等,2002)等作物;与几丁质酶基因共同转化番茄(Lycopersicon esculentum)(谢映忠等,2003)和西瓜(Citrullus lanatus)(王果萍等,2003);同pin2 基因共转化于水稻(程仲毅和薛庆中,2003;罗明等,2002)中;与麦谷蛋白基因共导入小麦(Triticum aes2tivum)(Blechl&Erson,1996)中;同AGP转入磨芋(Am orphophallus rivieri)(李贞霞和张兴国,2004);与抗菌肽B基因转入水稻(王惠中等,2000)中;与天麻抗真菌蛋白(GAFP)和兔防御素(NP21)双价抗病基因共转化到小麦(黄益洪等,2004)植株内。21112 培育抗草丁膦植物,解决作物培育中的草荒问题 控制杂草提高农作物产量是农业生产中最为重要的问题,杂草造成的直接经济损失约占农作物总产值的10%20%(黄大年,1997)。杂草和农作物竞争水分、养料和光照,影响农作物产量,杂草种子还会降低农产品的质量。控制杂草最根本最经济的方法就是发展抗除草剂作物,有资料表明,开发一个抗除草剂所需费用仅占开发一个新型除草剂的1%5%(梁丽娜等,2005)。抗除草剂转基因植物便于作业管理,节省人力、物力、财力,同时避免了土壤侵蚀,具有一定的生态效益。到目前为止,培育的抗草丁膦植物种类较多,如农作物马铃薯(Solanum tuberosum)(苏少泉,2002)、小麦(苏少泉,2002;Melchiorreet al.,2002)、大豆(Glycinem ax)(Plineet al.,1999;苏少泉,2002)、玉米(苏少泉,2002)和水稻(苏少泉,2002;Dattaetal.,1992)等;油料作物油菜(B rassica cam pestris)(彭仁旺等,1998;苏少泉,2002)、花生(A rachis hy2pogaea)(Braret al.,1994)等;经济作物棉花(Gos2sypium hirsutum)(苏少泉,2002)、烟草(N icotianatabacum)(苏少泉,2002;deBlocket al.,1987)等;林木如白杨(Populus alba)(de Block,1990)、辐射松(Pincus radiata)和挪威云杉(Picea abies)(Shinetal.,1994)等。抗草丁膦作物的发展非常迅速(苏少泉,1998),抗草丁膦玉米于1997年在美国出售种子,经营此类玉米品种达180种以上;抗草丁膦油菜在1997年开始大面积种植达510105hm2,1998年引入欧洲;抗草丁膦大豆早在1998年于美国开始出售种子后在巴西和其他国家销售;抗草丁膦棉花与抗草丁膦水稻在2000年前就已处于田间筛选阶段。我国华南植物园培育的转bar基因水稻,分别于2003年和2004年相继通过了农业部“农业生物基因工程安全管理实施办法”规定的试验,2005年正式批准进入生产试验。21113 应用于作物杂种优势方面 首先是育成纯合显性的抗除草剂基因的新型恢复系,再利用此恢复系配制出杂交种,用除草剂可同时去除假杂种和非目的性杂种和杂草,得到整齐一致的杂种群体,提高杂种产量和质量。在这方面,主要是应用于水稻杂交育种,我国水稻研究所的业绩最为突出(黄大年等,1998)。该技术采用基因枪轰击法获得抗草丁膦水稻京引119和春江03、秀水11三个品种的纯合优良株系,作为2系法杂交稻恢复系,选光敏不育系培矮64S和M2S为母本,进行人工授粉配制杂交,所获得的杂交稻种子,播种后幼苗在45叶秧苗期,喷洒草丁膦,4 d就可杀死假杂交种,从而解决了2系杂交稻制种纯度低的难题,保证制种纯度,突破了杂交稻制种纯度达100%的技术难关,使纯度鉴定时间缩短,加快了2系杂交稻的大面积推广应用,具有不可估计的社会效益。另外,我国研究人员将抗除草剂应用于谷子(Setaria italica)杂种优势研究也取得了突出的成果(王天宇,1998)。212bar基因的安全性21211bar基因供体吸水链霉菌是安全的 bar基因的供体吸水链霉菌,在自然界中广泛存在,属于生物圈的一部分。链霉菌属中几乎没有任何菌种与939刘洪艳等:bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性与安全性人、动物、植物的病原体有关。吸水链霉菌与链霉菌属的许多菌种相似,而且它们的PAT蛋白具有相同的专一酶活性,因此认为这些菌种至少含有bar基因的同源物,目前尚无这些同源物对人和动物是毒素或 过 敏 原 的 报 道(Kutzner,1981;Bartsch&Tebbe,1989)。因此认为bar基因供体是安全的。21212bar基因无直接毒性作用且不会产生基因多效性 WHO和FDA等组织认为转基因DNA本身不会对人体产生直接毒害作用(贾士荣,1997)。由于外源DNA其组成、消化代谢的方式与普通DNA相同,且日消耗量很少。因此bar基因和食物中的任何DNA一样安全。目前还无法精确控制外源基因在受体上的插入位点,其整合是随机的。虽然外源基因插入可能产生多效性(曾北危,2004):一是引起受体内某些基因的失活或激活;二是导致其随机变异或者异化;三是失活基因或者沉默基因在外界环境胁迫或者诱导下可能被激活爆发或突变形成意想不到的后果,例如由于外源基因的插入使受体内某种沉默基因激活,可能改变植物代谢,或引起代谢途径的紊乱,致使有害物质在植物体内累积,但是目前尚无随机插入激活毒性代谢途径的报道。bar基因表达产物多效性已在23个科中试验,无安全性问题(贾士荣,1997)。3PAT蛋白由bar基因编码表达的PAT蛋白分子量约为23 KDa,是同源二聚体,由183个氨基酸组成(We2hrmannet al.,1996)。PAT蛋白属于乙酰转移酶家族,它与乙酰转移酶类具有相对相同的结构和功能(Hrouetet al.,2005)。PAT蛋白是一种新酶,在人体内无内源的这种酶。其生理作用是能使除草剂草丁膦乙酰化,抑制草丁膦的活性,从而使草丁膦脱毒。311 不同来源的PAT蛋白结构和功能相同对转bar基因的大肠杆菌(Escherichia coli)、棉花、油菜这3种材料的PAT蛋白分别作SDS2PAGE和Western blotting试验,表明不同来源的PAT蛋白电泳迁移率无差异,且免疫活性相同。Edman降解实验进一步证实它们的PAT蛋白相同(Hrouetetal.,2005)。可见植物和大肠杆菌中的PAT蛋白的结构和功能相同。312PAT蛋白的安全性PAT蛋白在消化液内快速降解,与已知的毒蛋白无同源性,也不具过敏原的特性,如热或消化稳定性、无糖基化位点等。经米氏动力学分析:PAT蛋白在pH 611时对底物草丁膦都有很好的专一性。到目前为止,乙酰转移酶家族和PAT蛋白还未发生副作用的报道。并且PAT蛋白在植物中的表达量是极其低的,在植物材料中PAT蛋白含量2115 gkg-1,按急性毒性分级标准属无毒级;Ames试验无致突变作用,30 d喂养实验16、32和64 gkg-1各剂量组大鼠生长发育、体质量、食物的利用率、血常规、脏体比及病理学观察等指标与阴性对照组比差异均无显著性,无作用剂量为64gkg-1。另外,薛大伟等(2005)也用转基因的稻米对小鼠急性毒性实验、致突变实验和Ames实验,结果表明,转bar基因的稻米对小鼠是安全的。国外,用不同来源的PAT蛋白分别对小鼠静脉注射急性毒性试验研究(Hrouetet al.,2005),以抑蛋白酶肽和蜂毒肽为阴性对照和阳性对照。静脉注射PAT蛋白1和10 mgkg-1的小鼠未死亡也未发生毒性反应,而静脉注射蜂毒肽10 mgkg-1的小鼠在10 min内全部死亡;静脉注射蜂毒肽1 mgkg-1、抑蛋白酶肽1和10 mgkg-1的小鼠,也未表现出系统毒性。由此证实PAT蛋白没有急性毒性。31212PAT蛋白与已知毒素和过敏原没有同源性PAT蛋白与已知的120多种过敏蛋白无同源性(贾士荣,1997),PAT蛋白与其它的已报道经食用没有副作用的乙酰转移酶蛋白在结构上相似,并且与已知的安全的乙酰转移酶蛋白同源。同源性比较的主要方法,IgE交叉反应:是指一个含有80个以上(含80)氨基酸序列的新蛋白与已知过敏原的I m2munoglobulin E(IgE)交叉反应,如果有35%以上相同则认为是潜在的过敏原(Hrouetet al.,2005)。抗原表位同源性研究:决定氨基酸序列是否具有明显相似性的标准是“至少应有8个相邻的氨基酸完全相同”,这是判断新蛋白是否是潜在的过敏原的最小标准(Metcalfeet al.,1996)。31213PAT蛋白无糖基化位点 很多过敏原是糖基化的蛋白,可能糖基基团多的蛋白是潜在的过敏原。糖基化的主要标志是在多肽中有Asp2Xaa2Ser/Thr或Asp2Xaa2Cys这2个序列(Xaa代表除Pro以049 生态学杂志 第26卷 第6期 外的任何氨基酸),一般情况下Asp2Xaa2Cys序列很少出现。用Glyco2Profile试剂盒对PAT蛋白进行糖染,结果糖基化蛋白的标准样品出现强的条带,而没有糖基化蛋白的标准样品和PAT蛋白经糖染后条带很微弱,可见转化材料的PAT蛋白未被糖基化,此研究表明,在PAT蛋白上没有潜在的糖基化位点(Hrouetet al.,2005)。31214PAT蛋白热稳定性和消化稳定性 研究PAT蛋白的热稳定性和消化稳定性,表明PAT蛋白没有过敏原和毒素的特性(Hrouetet al.,2005):1)SDS2PAGE凝胶电泳分析热稳定性:PAT蛋白在90 时处理10 min,仍然保持完整性,加热至60 min时,蛋白未降解。在4045条件下处理15min,其活性受到抑制,当达到60 以上时,处理10min,PAT蛋白就会完全失活。在实验中,甚至在失去酶活性的情况下,PAT蛋白也仍具有免疫活性;2)SDS2PAGE和Western blotting分析消化稳定性:PAT蛋白在模拟的胃液和肠液中30 s内就能快速降解,5 min之内全部降解。另外,PAT蛋白在低pH的条件下,像在胃液中515 s其酶活性就会下降到零。由于PAT蛋白在胃和肠内很快被降解,表明PAT蛋白在消化途径中不能存活,因此在正常的条件下不能被人体吸收,在降解的过程中表达任何系统免疫原性或毒性的可能性较小。4 草丁膦草丁膦又称草铵膦,是广谱灭生性的有机磷类除草剂,其商品名有Liberty、Basta和Ignite等。该除草剂有2种同分异构体,其中D型不具除草剂活性,L型(L2PPT)是主要活性成分(Dr;ge2Laseretal.,1994)。PPT是谷氨酰胺的衍生物,在植物中抑制氨基酸生物合成酶即谷氨酰胺合成酶(GS)的活性,致使细胞内氨的大量积累,抑制植物的光合作用,导致植物死亡。411 草丁膦的吸收、传导、代谢运输方式高温、高湿和高光可增强草丁膦的吸收而显著提高活性,喷洒液中加入5%(W/V)硫酸铵能促进草丁膦吸收,有效提高草丁膦在低温条件下的活性(Plineet al.,1999)。草丁膦喷药后需要6 h内不降雨,利于其最大限度发挥药效。在土壤中,由于迅速被土壤微生物降解,故根系不能吸收或吸收很少,草丁膦主要对叶片起作用,处理后叶片快速产生药害,从而限制草丁膦在韧皮部与木质部的传导(苏少泉,2005)。研究发现,草丁膦优先运输到植物的顶部(Dr;ge2Laseret al.,1994)。对烟草、苜蓿(Medicagosativa)和胡萝卜植株中部的叶片用14C标记的PPT进行处理,经 射线观察发现,放射性主要分配在原来被处理的叶片中,部分在茎中,并且优先向上部的叶片移动,根中含量较少。412 草丁膦的安全性41211 草丁膦是生物除草剂 草丁膦是以生物除草剂双丙氨膦的化学结构进行结构优化,开发合成的类似物,因此属于生物除草剂。它具有生物除草剂的优点:高效、对生态环境影响较小、具有较高的转移性和选择性、在植物中无残留、可保证产品质量、对人畜相对无毒。尽管草丁膦抑制细菌、植物及哺乳动物的GS,但它不能通过血脑屏障并在肾中很快被清除,因此对哺乳动物无毒性作用(贾士荣,1997)。41212 草丁膦在土壤中易被土壤微生物快速分解 草丁膦在土壤中通过微生物迅速降解,在大多数土壤中淋溶不超过15 cm,土壤有效水影响其吸附与降解,在作物收获时未测出任何残留,半衰期37 d(Behrendtet al.,1990;Faberet al.,1997)。茎叶处理后32 d,大约有10%20%化合物即降解产物停留于土壤,至295 d,残留水平近于零(Faberetal.,1997)。到目前为止,尚没有资料表明转bar基因作物造成毒害作用。实际上,具有草丁膦抗性的多种植物广泛种植于美国、加拿大已有10年多的历史,人食用和动物饲养方面尚未出现不良影响;一些管理机构声称:澳大利亚、阿根廷、日本、南非、欧联盟的人和动物都在食用具有草丁膦抗性作物的产品,目前未造成副作用的报道(Hrouetet al.,2005)。另外,Bayer公司已经证实(FDA,2003),转bar基因的棉花的棉花籽、提炼油、烤熟的食品与非转基因的在营养成分、安全性、其它的相关参数没有本质上的不同。尽管如此,消费者也应该充分拥有知情权与选择权。参考文献程仲毅,薛庆中.2003.马铃薯蛋白酶抑制剂 2基因在转基因水稻中的遗传及表达.中国农业科学,36(6):603-609.杜 娟,胡汉桥,余云舟,等.2003.用基因枪法将B 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