病理学技术在水生动物疾病学上的应用进展.pdf

中田I 柯方竹(1、l 蔓)渔业譬术论坛沦文!三 1 8 文其乙产气荧膜梭菌肠霉素的致病机理研究进展 J 动物医学进展2 0 0 2，2 3(2)：1 7-1 9 病理学技术在水生动物疾病学上的应用进展汀开鞔何敏李证军(四川农业人学水生动物疾j i i i 研究中心雅安市6 2 5 0 1 4)(P q 川省水产局成都市6 1 0 0 7 2)摘要本文对病理学技术在水生动物疾病研究中的地位和作用进行了阐述，并对传统病理学技术向现代病理学技术的发展进行了分析，同时对病理学技术在水生动物研究中的应用所取得的进展进行了综述总结。关键词水生动物疾病病理学技术1水产动物病理学技术的发展病理学是研究动物疾病的原因、发生、发展规律及患病机体的形态结构，物质代谢和机能变化的-r l 学科。它既可作为基础理论学科为临床医学奠定坚实的基础，义可作为应H j 学科直接参与疾病的诊断和防治，因此病理学长期以米被形象地喻为“桥梁学科”和“权威诊断”。传统病理学主要是采心尸检、活检、肉眼观察及光镜观察等研究手段。观察动物组织的病变特点，它为病理学的进一步发展奠定了坚实的基础。国际著名病理学家K a r lL e n n e r t提出：“技术是病理学之母”。随着科技进步，传统病理学与其它学科的相互渗透。细胞病理学、超微病理学、免疫病理学、分子病理学、信息病理学等相继出现，构成了现代病理学体系。该体系吸收了当今生物化学、免疫学和分子生物学的最新研究方法和取得的最新成果，使病理学的观察从器官、细胞水平，深入剑弧细胞、蚩白表达及基冈的改变。这不仅使病理学的研究更深入一步，同时也使病理学的研究方法渗透剑各基础学科。水生动物病理学技术是水生动物疾病研究不可缺少的部分，与人类医学和兽医学中病理学的应州相比，水生动物病理学技术起步较晚，技术水平相对落后，但近年来取得了飞速的发展。有关水生动物病理学第一部较完整的著作是W E。里贝林、G 三垣两博士1 9 7 2 编著的鱼类病理学，但该寸5 只是分类编辑了一次国际的鱼病研究学会的论文。其后，日本的江草周三等1 9 7 9 年出版了鱼类病理组织学：美国的R o b e r t s 七十年代早期编著的 F i s hP a t h o l o g y 第一版，重点是描述传统病理学和微生物技术方面的研究，现在 F is hP a t h o l o g y 已经出版了第一二版，其内容也在原米基础上加入了分子生物学技术，说明水产动物病理学的发展已进入一个新的研究阶段。在我国，著名的鱼病学专家黄琪琰教授等一批学者对我国水产动物病理学的发展作出了重人贡献，对许多水产动物疾病进行了较早的研究和描述，为奠定我国水产动物疾病学研究打下了重要的基础。随着水生经济动物养殖业的发展，特别是海水经济动物养殖的兴起，养殖品种的不断扩大，疾病研究的范嗣也随之扩人，不但对淡水温水性鱼类的疾病进行研究，而且对冷水性鱼类、海水鱼类、咸淡水鱼类、甲壳类、软体动物、两栖类、爬行类以及观赏性水生动物等水生养殖动物的疾病利防治也展开研究，研究技术也已从显微组织病理深入到弧显微组织病理、生物化学技术、免疫组织化学技术以及分子生物学技术，尤其是分子生物学技术在水生动物疾病上的研究对水产动物病理学的发展产生了深远的影响，促进了水生动物病理学技术的飞速发展。1 9 42 病理学技术在水产动物疾病上的应用中国南方行(市、区)渔、l k 学术论坛论文集2 1 常规癍理技术常规病理技术主要是指病理解剖技术和组织痫理学技术，是最基本也是最重要的病理学技术，病理学的研究最先就从这里开始，无论其它病理技术的发展应用程度如何，在病理学诊断和研究中，常规病理技术都是必不可少的。病理解剖技术是通过解削动物体观察机体各组织器官的病理变化，找山主要病变、分析判断直接死亡原I 灭|的一种重要方法，是病理学技术最基础且最重要的一部分。水生动物疾病学的发展首先也是在这一技术基础上不断发展的。常规的组织病理学技术主要是采朋石蜡切片及H E 染色等，通过光学显微镜观察水产动物组织的病变特点，此法是病理学研究从宏观到微观的第一步。黄琪琰等(1 9 8 3)运川组织病理学技术研究了草鱼细菌性烂鳃病的组织病理变化。郑德崇等(1 9 8 6)啦!对草鱼出血病组织病理学进行了系统的研究。黄珙琰等(1 9 9 1)o。”相继对异育银鲫溶血性腹水病和草鱼疖疮病的组织显微病理进行了研究。L i g h t n e r(1 9 9 3)插应删G i e m s a 染色涂片法对虾B P V 进行检测。黄琪琰等(1 9 9 5)州报道淡水鱼类细菌性败血症的肝、脾、肾组织弧显微病理变化及防治方法，并比较了鲫、团头鲂、鲢、鳙患此病后的症状和病理变化。郭琼林等(1 9 9 5)o报道鳗鲡爱德华氏菌病病变性质为化脓性炎症。陆宏达等(1 9 9 6)坤1 对鳖嗜水气单胞菌败血痖的病理学变化进行了研究。蔡完其等(1 9 9 7)州对中华鳖爱德华氏菌病病原和组织病理进行研究。郭琼林等(1 9 9 7)u 刨报道了鳗鲡出血性开口病的组织病理变化。蔡完其等(1 9 9 8)tzJ对由嗜水气单胞菌，普通变形菌等多种细菌引起的中华鳖穿孔病的病理变化进行研究。潘连德等(2 0 0 0)u 纠对鲟鱼心外膜脓肿的病理学进行了初步研究。郭琼林等(2 0 0 1)u 引报道了鲤肠道巨囊病的组织病理学变化。汪开毓等(2 0 0 2)o 对鲤鱼进行了喹乙醇急性中毒的病理学研究。陆宏达等(2 0 0 3)u 纠发现病虾腹部向浊的肌肉组织肌纤维肌浆内存在嗜碱性包涵体，肝胰腺、血细胞、心脏和鳃组织细胞脑浆内也有嗜碱性包涵体出现。汪开毓等(2 0 0 4)u 州报道了由嗜水气单胞菌嗜水种(A e r o m o n a sh y d r o p h il as u b s p h y d r o p h il a)感染鲤鱼引起细菌性败血症的病理学变化，并在病理变化观察的基础上探讨了该病发生的机理。绳秀珍等(2 0 0 6)对患淋巴囊肿病毒病的牙鲆和鲈鱼的组织进行显微观察，并对病毒感染的靶器官进行了研究。黄琪琰等(1 9 9 3)刚对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病人种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，证实寄生虫性鳃病均可引起鳃纽织发生炎症反应。李海燕等(2 0 0 6)u 町也运用此法对义尾斗鱼(M a c r o p o d u so p e r c u l a r i s)的火钩关睾虫(B e t e r o n c h o c l e i d u sm a g n i h a m a t u sZ h a n ge tJ i)和小钩关睾虫(H b u s c h k i e l iB y c h o w s k y)病进行了病理学研究。叶仕根等(2 0 0 6)脚1 用含质量分数为1 0 的氧化鱼油半精制饲料饲喂鲤，并对鲤摄食氧化鱼油后的病理学变化进行了研究。这些研究涉及了细菌、病毒、寄生虫、营养、中毒等多方面的原冈引起的疾病，研究的对象包括了淡、海水的鱼虾鳖等多种水生动物。2 2超微病理学技术超微病理学技术是研究细胞的超微结构及其病变的一种有力手段，在半个多世纪的实践中，已显示山它旺盛的生命力和J 阔的应用前景。它不仅在水生动物疾病的病冈、发病机制的阐明和对疾病本质的认识方面发挥了卓越的作 j，而且在对疾病的诊断方面亦起着日益重要的作用。如张奇丽等(1 9 9 9)托对患暴发性传染病的鳜病变组织进行了超微结构观察。周化民等(2 0 0 0)盟1 应川电镜研究斑节对虾向斑综合症杆状病毒(W S S V)感染的组织特异性，证实W S S V 组织特异性著，感染外胚层和中胚层米源的各种组织细胞的细胞核。李海燕等(2 0 0 0)比卅从亚显微结构观察患有由柱状屈桡杆菌引起的鳜烂鳃病的鳃、肝、肾组织_ j f I I 细胞的病变情况。陆宏达等(2 0 0 2)嵋刮通过相差显微镜和电镜观察了中华绒螯蟹血细胞胞质内有无颗粒以及颗粒人小、染色反应、折光性和形成方式的特点。汪开毓等(2 0 0 3)幢酬对鲤慢性喹乙醇中毒的超微病理学进行了研究。耿毅等(2 0 0 5)拉酬进行了斑点义尾劁疱疹病毒感染的病理形态学观察。乇晓杰等(2 0 0 6)拉对许氏平啬由鳃、头肾、脾脏在盐度胁迫下的超微结构1 9 5中闻向方行(市，I 蔓)渔业。术沦坛论文集病理变化进行研究，表明水体盐度变化使实验鱼头肾中细胞排列的紧密程度、粒细胞结构发生了明显变化。2 3 生物化学技术2。3 1 双向电泳技术双向电泳(2-D E)是指利川蛋白质的带电性和分子鼍人小的筹异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。随着人类基冈组计划的完成，功能基冈纽时代和蛋白质组时代的剑米，双向电泳技术已经成为生物学研究的核心技术之一。近年来已有研究者将双向电泳技术圳于水产动物疾病研究中，如H u l t o n 等(2 0 0 2 划根据对虾自斑综合征病毒(W S S V)的基冈组分析出其含有的蛋白质等电点，并对其蛋白质进行分析，找山可能与疾病相关的蚩白质，这对该病的诊断以及疫苗研究具有重要意义。2 3 2W e s t e m 印迹W e s t e m 印迹义称免疫印迹或转移印迹技术，以凝胶电泳高效分离和同相免疫测定相结合而形成。它借助高分辩率的P A G E 电泳将混合蚩白质样品有效允离成许多蛋自区带，分离后的蛋白经电泳转移至同相支持物上，通过与特异性抗体的结合，即可定性或定量检测靶蛋白，从而可直接观察到抗血清与特异性抗原的反应。张晓华等(1 9 9 7)删利用此技术对1 3 株不同来源的副溶血弧菌的外膜蚩自及其抗原性进行了比较研究，发现它们有相似的S D S-P A G E 图谱，其中一条4 4 k D a 的免疫反应带儿乎是所有副溶血弧菌菌株共有的，推测极有可能与副溶血弧菌抗原的特异性有关。2 3 3 同：I：酶技术同一：酶是生物机体中生理生化的天然标记，可反映机体内的各种变化。不同的疾病所导致的同1：酶表型及活性变化规律，彼此之间存在显著的差异，冈而作为一种研究水产动物疾病机制的：j：具被J 1 泛运朋。王金星等(1 9 9 5)恻对中国对虾四种组织的蛋白质、酯酶、乳酸脱氢酶和超氧化物歧化酶等同：l：酶进行了分析研究，并将健康虾与流行病病虾进行了比较，找出了它们之间的差异。江开毓等(2 0 0 0)”运用S O D 同I：酶电泳酶谱分析鱼类应激性出血症病理，发现病鱼的过氧化物同，l：酶酶谱出现条带的缺失、移位莆l 增加等异常现象。王永杰等(2 0 0 1)m 3 运用S L D H 同j 1 I 酶谱型变化建立了草鱼出缸病的快速诊断方法。吴惠仙等(2 0 0 2)啪1 研究发现酯酶、过氧化物酶、乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶等同j l r：酶在日本沼虾中存在着组织和器官的特异性，患黑鳃病后酶带发生显著变化。薛俊增(2 0 0 2)岍采刚乖直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对正常和患“抖抖病”的中华绒螫蟹儿种组织中的可溶性蛋白质及乳酸脱氢酶、酯酶和过氧化物酶等同工酶进行了比较分析，证明了同：1：酶可以作为水产动物疾病检测与诊断的生理生化指标。2 3 免疫组织化学技术免疫组织化学技术是利月j 免疫反应以定位组织中某类抗原成分分布的一门技术，借助于荧光素、酶、胶体金等标记抗体与组织切片中相关抗原相结合而特异的识别目标抗原，是一项特异、敏感和简便的技术。免疫荧光抗体和免疫酶标技术在水产动物疾病研究方法上的应用具有灵敏度高，特异性强，定位准确和应刚J 泛等优点。2 3 1 免疫荧光抗体技术免疫荧光抗体技术以荧光素为标记物，与已知抗体结合作为标准试剂，f l j 于检测未知抗原，可在荧光显微镜卜早现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。这项技术将免疫反应的特异性、灵敏性与显微镜技术的精确性相结合，是现代标记免疫检测的重要方法之一殷战等(1 9 9 4)恻应H J 此技术观察感染鲢鱼组织中的病原菌。夏春等(1 9 9 8)制作了6种兔抗中国淡水鱼主要病原菌的纯化抗体，州免疫荧光抗体法与各病原菌以及米源丁水环境和鱼体分离菌发生反应，表明此法能用于检测中国鱼类病原菌的并发、继发和混合性感染。王军等(2 0 0 2)o 疗。建立了人黄鱼病原溶藻弧菌的免疫荧光抗体检测方法，圳丁-已感染发病或已感染朱发病大黄鱼的快速检测。徐宋娟等(2 0 0 4)惮1 应用免疫荧光抗体技术(I F A T)和标记1 9 6中团南方省(订了、区)渔、I k 学术论坛论文集链亲和f 素一生物索(L S A B)免瘦组化法对患淋巴囊肿病牙鲆的1 0 种组织进行了检测，发现体表有囊肿症状病鱼的胃、肠、鳃和表皮纽织内有淋巴囊肿病毒存在；体表术见囊肿症状病鱼的。胃、肠和表皮组织内也检Y,l J N T 病毒，说明此免疫技术可以应刚于牙鲆淋巴囊肿病的检测与诊断。2 3 2 免疫酶标技术免疫酶标技术是利用抗原一抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，达剑在细胞或砸细胞水平上示踪抗原或抗体的部位。其中，酶联免疫吸附试验是免疫酶标技术中最具特异性、敏感性，结果易于检测等特点的一种，所以近米J“泛被川于水生动物疾病的诊断上。叶雪平等(1 9 8 9)恻戍川此法检测出草鱼出血病病毒抗原。江育林等(1 9 9 0)m 1 用此法检测了虹鳟的传染性胰脏坏死病病毒。S n o w(1 9 9 9)n 等建立出血性败血症病毒(V H S Y)的E L I S A检测方法，刚米检测感染的人菱鲆。干军等(2 0 0 1)H 引建立了网箱养殖人黄鱼病原菌-N 溶血弧菌酶联免疫吸附法。杨鸢劬等(2 0 0 5)3 1 制备了鳗弧菌B _ l l 菌株的兔抗血清，并应刚间接酶联免疫吸附法能检出1 5 1 0 5 个m l 浓度的B-1 1 菌株，对患病鱼体的组织培养物鳗弧菌进行检测，r 旱现明显的I；lI 性反应。2 4 分子生物学技术分子生物学技术是在细胞生物学与分子生物学理论指导下发展起来的一种高新技术，其重要标志是分子克隆技术和细胞融合技术。分子生物学技术已成为指导生命科学发展的尖端技术之一，它也将是征服水生动物疾病，保证水产养殖动物健康、稳定、持续发展的支柱科学。2 4 1 单克隆抗体技术单克隆抗体是一个抗体产生细胞与一个骨髓瘤细胞融合而产生的杂交瘤细胞，经无性繁殖而米的细胞群产生的。它与常规血清抗体相比，具有特异性强，亲和性一致，能识别单一抗原决定簇，且容易制备等特点。h r k u s h 等(1 9 9 2)H 副制备7 种斑点义尾鲴病毒c A 8 0 5 株的单克隆抗体，采用中和试验及直接荧光抗体等方法，发现了C A 8 0 一5 株与其它儿株的抗原性筹别。黄健等(1 9 9 5)副应川单克隆抗体酶联免疫技术检测对虾皮下及造血组织坏死病的病原及其传播途径。战文斌等(1 9 9 9)1 应用单克隆抗体的荧光抗体方法观察白斑病毒在日本对虾体内的感染增殖。王亮等(2 0 0 4)H 列成功获1 8 株抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，并通过保持细胞系重复获得相同的抗体。而今，单克隆抗体技术已在水产动物病原体检测中得到了广泛应用，如应用于诊断海湾扇贝的鳃立克次体病、鱼类及牡蚜的淋巴细胞病毒病、鲑鳟红嘴病及疖疮病、鳗弧菌病、斑点义尾劁病毒病、嗜水气单胞菌败血症等。2 4 2P C R 技术，P C R 技术又称D N A 体外扩增技术，它是利用体外酶促合成特异D N A 片段的一种方法，由高温变性模板，引物与模板退火，引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的D N A 得以迅速扩增。它具有特异性强、敏感性高、重复性好、快速、简便、易自动化等特点。战文斌等(2 0 0 0)m 采川P C R 技术对不同生长期的中国对虾进行了W S S V 的检测。冯现维等(2 0 0 2)m 1 采H J P C R 技术对鲤鱼的鳃、口腔黏膜，肌肉、心、肝、脾、肾、肠等组织进行了吉陶单极虫D N A 的检测。周化比等(2 0 0 2)唧根据副溶血弧菌野生型菌株B B 2 2F l a I基冈c D N A 序列，通过合理的P C R 反麻，成功地合成i l j 编码极鞭毛蚩白的F l a I 基因全长片段，井将其克隆至p l D l 8 一T 载体质粒上，其序列分析和酶切鉴定显示F l a I 基冈得到了正确的合成和克隆。邱丽华等(2 0 0 4)倬采州同源克隆和锚定P C R 技术，从花鲈中克隆肿瘤坏夕E I 灭l 子Q(T u m o rn e c r o s i sf a c t o rQ，T N FQ)的c D N A 全序列，证实了花鲈T N Fa 基闪存在组成型和诱导型两种表达调控机制，在抵御病原感染过程中发挥重要作用。邹慧斌等(2 0 0 5)嶂副通过E S T 和I 锚定P c R 技术，从海湾扇贝中克隆得剑一种溶茵酶基冈的全。长c D N A，在其编码的氨基酸序列中发现了g 型溶菌酶的活性中心(G n 8 2，A s p 9 7，h s p l 0 8)，同时6 个保守的半胱氨酸，与1 9 7中阳南办行(市、I 蔓)油业学术论坛论爻集脊椎动物g 型溶菌酶同源性较高反映了c 型、g】弘溶荫酶从无脊椎剑脊椎动物的进化是平 r 发生的，这对进一步研究溶菌酶及其分子进化具有重婴意义。2 4 3 核酸原位杂交技术核酸原何杂交技术是在一定生物结构基础之上的核酸尔交，其可反应基闪杂交的准确部位，即可检测到特定基闪的准确位置。常青山等(2 0 0 0)怖3 1 以海捕中国对虾为材料，利川P C R技术和核酸探针技术，对从中国对虾杆状病毒核酸随机文库中筛选的4 个片段，J I j 地高辛标记作为探针，进行斑点杂交，检测对虾杆状病毒。M a r t h a 等(2 0 0 1)B”以患T S(T a u r a S y n d r o m e)病毒的病虾上分离的T S V 的c D N A 为探针进行原位杂交以检i!|J T S V 病毒的存在。2 4 4D N A 分子标记技术D N A 分子标记是以个体间遗传物质内核莳酸序列变异为基础的遗传标记，快速直接的观察和探究到整个基冈组的基冈变异。如今，其已被J-泛应J-t J 2 J 水生动物的基冈定位与克隆、物种鉴定及疾病诊断等领域中。2 4 4。lR F L P 标记R F L P H P 限制性片段长度多态性，利刚特定的限制性内切酶切割不同个体的基冈组D N A，得到K=短、数营、种类不同的限制性D N A 片段，通过电泳和S o u t h e r n 杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，利用一定的D N A 标记探针与之杂交，放射白显影后就可得剑反映个体特异性的D N A 限制性片段多态性图谱。由丁动物线粒体D N A(m t D N A)分子量小，结构简单，可直接酶切进行R F L P 分析，冈此目前R F L P 技术在水产动物疾病中的应川主要是对m t D N A 的分析。N i c h o l s o n 等(1 9 9 6)婚”在对水产上引起多种鱼病的双R N A 病毒进行基冈组筹异分析，对编码V P 2 蛋白的一段c D N A 进行酶切、分析，为不同地区水产双R N A 病毒的分类提供了依据。L e e 等(2 0 0 2)嶂副应用此技术检测一些鱼类致病菌在环境中的分布情况及其在不同时期的存活情况。M a r i n a 等(2 0 0 4)。利H R F L P 结合血清学数据，显示不同地区鲑鱼致病菌(L a c t o c o c c u sg a r v i e a e)菌问的遗传关系。2 4 4 2R A P D 标记R A P D 杖P 随机扩增多态性D N A，是州一系列不同的碱基顺序随机排列的寡核督酸单链作为引物，对所研究的基冈组D N A 进：f T P C R 扩增。扩增产物经凝胶电泳，溴化乙锭染色或放射白显影便可得剑许多不同的特征条带。如果基冈组在某些区域内发生D N A 片段插入、缺欠或碱基突变就可能导致这些特定结合位点的分布发生相应的变化。冈此，目前常借助R A P D 分子标记技术进行水产动物的物种鉴定、亲缘关系确定以及系统发育研究。B a r d a r k c i 等(1 9 9 4)瞄引应刚R A P D 技术扩增了罗非鱼属的3 个种和尼罗罗1 卜鱼的4 个种的基闪宝H D N A。梁利群等(2 0 0 3)酬根据其获得的鲤抗寒性状分子标记及已构建的鲤遗传连锁图谱，结合计算机软件的分析功能，最终将5 N 1 4 5 1 C 这一与鲤耐寒有关的分子标记定位剑鲤的遗传图谱上。2 4 4 3A F L P 标记A F L P 即扩增片段长度多态性，是R F L P 希I P C R 结合的产物。它将D N A 进行限制性酶切，再将特定的接头连接在酶切片段的两端，形成一个带接头的特异性片段并以此为模板，以接头序列和限制性内切酶的切点序列为基础设计引物，进行P C R 扩增。只有与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增，从而检测出要求基冈组D N A 的多态性。N a k a m w a 等(2 0 0 1)1应川A F L P 技术构建了虮鳟向化病个体的遗传图谱，发现其中有4 个标记与白化病基冈位点相关并紧密连锁。T h o m a s 等(2 0 0 4)3 对抗鲑鱼贫血症的个体和染病夕E 亡个体进行了基冈裂分析，得到了3 4 0 个A F L P 标记，这将有助于从分子水平诊断及防治鲑鱼贫血症提供有效途径。2 4 4 4 微卫星标记技术微卫星标记技术是基丁-基冈组D N A 水平的差异进行检测，不受组织，器官种类、环境条件等|灭I 素影响，冈此可以方便的用丁辅助育种、覆盖目标基闪的连锁遗传图谱的构建，通过基冈图谱可以详细了解控制那些有价值的抗病性状的位点组成利表达调控机制，以便r 操纵这些基因而有效的避免一些病害的爆发。M a r i a 等(2 0 0 3)m 应用1 1 1 个微甲星标记和3 5 2 个1 9 8巾喇南方竹(市、区)渔业学术论坛论文集A F L P 标记构建了H 本比口鱼的第一个遗传连锁图谱，为奄找比E|鱼病毒性表皮增生，病薛性神经坏夕匕和体色异常等疾痫致病基冈的位点有很人帮助。2 4 51 6 Sr R N A 技术1 6 Sr R N A 是核糖体R N A 的一种，具有分子量适中，所含的遗传信息丰富，在结构上分为保守区(C o n s e r v e dd o m a i n)平可变区(V a r i a b l ed o m a i n)，保守区能反映生物物种的亲缘关系，可变区具有能揭示生物物种的特征核酸序列等特点，被认为是最适细菌系统发育和分类鉴定的指标。目前1 6 Sr R N A 序列分析己J 泛J H j 丁水产动物病原菌的鉴定。R a g n h i l d 等(1 9 9 5)1通过对分离丁人两洋鲑鱼、虹鳟鱼、人菱鲆和鳕鱼中的致病弧菌的1 6 Sr R N A 序列进行比对，对鱼类致病弧菌进行分类。C a r l o s 等(1 9 9 9)o 通过对2 6 株不同来源的鱼病菌的1 6 Sr R N A 基冈序列的分析，确定了鱼出血性败血症病原美入鱼发光杆菌的分类地位，并建立了基于1 6 Sr R N A 基冈的巢式P C R 病原检测方法。C e r d a 等(2 0 0 1)M”利川一种特异的1 6 S r R N A 基冈探针对V v u l n i f i c u s 病毒进行检测。邹玉霞等(2 0 0 4)泐1 通过对人菱鲆出血症病原菌的1 6 Sr R N A 基冈进行系统发育学分析，确定了该病原菌为鳗弧菌。耿毅等(2 0 0 6)恻从发生急性流行性传染病的斑点义尾鲴肝、肾分离到一高致病性的菌株，经1 6 Sr D N A 序列分析，鉴定其为嗜麦芽寡养单胞菌(S t e n o t r o p h o m o n a sm a lt o p h i l i a)。2 4 6 基闪芯片技术基冈芯片义称D N A 芯片，属于生物芯片中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，其基本原理是将人鼙寡核苷酸分子闹定丁支持物上，然后与标记的样晶进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样晶中靶分子的数萤，具有微砸化、集约化和标准化等特点。S t e p h e n 等(2 0 0 3)廊川人类c D N A 微阵列对健康和感染A e r o m o n a ss a l m o n i c i d a如病菌的人两洋鲑鱼肝脏内基冈表达的著异进行比较，发现4 个位点的基冈表达住染病个体内有明显增加，证明了应川人类c D N A 微阵列检测鲑鱼体内差异表达基冈的可行性。S a n t i a g o等(2 0 0 4)1 对海鱼的5 种重要的病原体进行检测，证实其对检测引起人和鱼类多种疾病的多重病原体是一种敏感性强、精确度高的实验手段。3 结语水产动物病理技术已经过近半个世纪的发展，随着水产动物疾病研究广泛地与其它先进技术手段相结合，尤其与分子生物学技术的结合，为水产动物疾病的发展带米革命性的变化。快速准确的病原体检测手段，高效免疫疫苗的制备都在很人程度上缓解了病害所带来的严重损失。然而目前的高新技术主要应瑚予基础性研究，这些技术要真正的应用于生产，还有待于条件方法的优化以及仪器设备成本的降低。近儿年米，我国在水产动物疾病防治上取得了一定的进展，但在免疫防护、病害的预测和预报以及健康养殖模式上还有待于进一步深入研究。1 黄琪琰，郑德崇，7(2)：9 5-1 0 4 2 郑德崇，黄琪琰，1 5I 一1 5 9 参考文献蔡完其，等草鱼细菌性烂鳃病的组织病理研究 J 水产学报，1 9 8 3，蔡完其等草鱼出血病的组织病理研究 J 水产学报，1 9 8 6，1 0(2)：3 黄珙琰，郑德崇，刘丽燕，等异育银鲫溶血性腹水病的组织显微病理研究 J 水产学报，1 9 9 l，1 5(3)：2 1 2-2 1 8 4 黄琪琰，范丽萍草鱼疖疮病的组织病理研究 J 水产科技情报，1 9 9 1，1 8(1)：5-7 5 李霞，干J 军水产动物病理学研究方法的进展 J 水产科技，2 0 0 2，5：5 8 5 黄琪琰，6 黄琪琰，郑德崇，金丽华淡水鱼类细菌性败血症的组织亚显微病理及防治研究 J 上海1 9 9中罔南万行(市、区)渔业学术论坛论文棠水产人学学报，1 9 9 5，4(1)：2 7-3 4 7 郭琼林，卢全章鳗鲡爱德华氏菌病的组织病理学研究 J 水生生物学报，1 9 9 5，1 9(1)：5 6 6 0 8 陆宏达，金丽华鳖嗜水气单胞菌败血症的研究 J 水产学报，1 9 9 6，2 0(3)：2 2 3 2 3 4 9 蔡完其，孙佩芳，刘至治中华鳖爱德华氏菌病病原利组织病理研究 J 水产学报，1 9 9 7，2 l(4)：4 2 8 4 3 3 1 0 郭琼林，陈燕鳗鲡出血性开口病的病理学研究 J 水生生物学报，1 9 9 7，2 1(4)：3 2 7 3 3 3 1 1 蔡完其，赵金良中华鳖穿孔病病理变化 J 中国水产科学，1 9 9 8，5(4)：1 7 2 1 1 2 潘迮德，李淑云，夏勇涛鲟鱼心外膜脓肿的病理学初步研究 J 水生生物学报，2 0 0 0，2 4(5)：5 6 3-5 6 61 3 郭琼林，谢杏人中国鲤肠道巨囊病的组织病理学研究 J 鱼类病害研究，2 0 0 1，2 3(3)：7 7-7 7 1 4 汗开毓，耿毅鲤鱼急性喹乙醇中毒的病理学研究 J 畜牧兽医学报，2 0 0 2，3 3(6)：5 6 5 5 6 9 1 5 陆宏达，陈海清。罗氏沼虾肌肉自浊病的病原和组织病理 J 中国水产科学，2 0 0 3，1 0(2)：1 2 6 1 3 2 1 6 汪开毓鲤鱼细菌性败血症的病理学研究 J 四川农业大学学报，2 0 0 4，2 2(3)：2 5 7 2 6 2 1 7。绳秀珍，战文斌鱼类淋巴囊肿病毒靶器官的组织病理研究 J 中国海洋大学学报，2 0 0 6，3 6(5)：7 4 9-7 5 3 1 8 郑德崇，刘丽燕，等寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究 J 上海水产火学学报，1 9 9 3，2(1)：4 8-5 1 1 9 李海燕，香咏瑜义尾斗鱼关睾虫(单殖弧纲)病的鳃组织病理学研究 J 中国水产科学，2 0 0 6，1 3(5)：8 2 9 8 3 3 2 0 叶仕根，汪开毓，何显荣鲤摄食含氧化鱼油的饲料后其病理学的变化(J 大连水产学院学报，2 0 0 6，2 1(1)：l 一6 2 1 张奇弧，李正秋鳜鱼病毒病原的检山及组织病理分析 J 水生生物学报，1 9 9 9，2 3(2)：1 5 1 1 5 4 2 2 周化民斑节对虾白斑综合症杆状病毒(W S S V)感染的组织特异性徐州师范大学学报(自然科学版)，2 0 0 0，1 8(3)：5 4 5 6 2 3 李海燕，黄文芳鳜细菌性烂鳃病的组织及细胞超微结构观察 J 华南师范大学学报(自然科学版)，2 0 0 0，l：1 0 9 一1 1 22 4 陆宏达中华绒螯蟹血细胞的显微、亚显微形态结构及其分类 J 水生生物学报，2 0 0 2，2 6(5)：4 9 4-5 0 0 2 5 汪开毓，耿毅，叶仕根。等鲤慢性喹乙醇中毒的病理学和组织残留 J 水产学报，2 0 0 3，2 7(1)：7 5-8 2 2 6 耿毅，汪开毓斑点叉尾鲴疑似疱疹病毒感染的病理形态学观察 J 中国兽医学报。2 0 0 5，2 5(6)：6 3 6-6 3 9 2 7 王晓杰，张秀梅盐度胁迫对许氏平岱由鳃、头肾、脾脏超微结构的影响 J 中国海洋人学学报，2 0 0 6，3 6(B 0 5)：8 5-9 0 2 8 H u a n gC，Z h a n gX，L i nQ，e ta 1 P r o t e o m i ca n a l y s iSo fs h r i m pw h it es p o ts y n d r o m ev i r a lp r o t e i n sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fan o v e le n v e l o p ep r o t e i nV P 4 6 6 J M o I C e l1 P r o t e o m i c s，2 0 0 2，l(3)：2 2 3 2 3 1 2 9 张晓华，R o b eP 副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性研究 J 中国水产科学，1 9 9 7，4(4)：4 9 5 3 2 0 0中围南方省(i、区)渔业t 术论坛论文集3 0 千金星，赵小凡对虾组织萤F=1 质乖同I：酶犬型及其在痫虾中的变化 J 海洋科学，1 9 9 5，3：4 6 5 1 3 1 汀开毓，耿毅，钟妮娜鱼类应激性出血瘟的病理学研究 J 淡水渔业，2 0 0 0，3 0(I1)：2 8-3 1 3 2 干永杰，戚少燕，陈宁，等草鱼出血病的快速诊断方法的研究 J 安徽农业科学，2 0 0 1，2 9(4)：5 5 3-5 5 3 3 3 吴惠仙，薛俊增日本沼虾黑鳃病儿种同。l：酶的变化与病理分析 J 海洋湖沼通报，2 0 0 2(1)：3 2 3 73 4 薛俊增患抖抖病中华绒螯蟹可溶性蛋白质和同：I：酶分析 J 动物学杂忠，2 0 0 2，3 7(2)：1 7-2 1 3 5 殷战，徐伯亥，应用荧光抗体染色技术对感染鲢鱼组织中病原菌的观察 J 水生生物学报，1 9 9 4，1 8(1)：9 5 9 63 6 夏春间接荧光抗体法快速检测中国淡水鱼主要病原菌 J 中国兽医学报，1 9 9 8，1 8(5)：4 6 6 4 6 83 7 王军，鄢庆枇溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测 J 海洋科学，2 0 0 2，2 6(7)：l一4 3 8 徐宋娟，邢婧，程顺峰，等应川免疫技术检测牙鲆组织内的淋巴囊肿病毒 J 水产学报。2 0 0 4，2 8(B 1 2)：L 0 1 1 0 5 3 9 叶雪平，杨广智免疫酶柒色检测草鱼出血病病毒抗原的方法研究 J 鱼病简讯，1 9 8 9，2：1 6-1 8 4 0 江育林，于平，李正秋川酶联免疫吸附试验快速检测虹鳟的传染性胰脏坏死病病毒 J】水生生物学报，1 9 9 0，1 4(3)：2 7 6-2 7 9 4 1 S n o wM E x p e r i m e n t a ls u s c e p t i b i l i t yo ft u r d o tS c o p h t h a l m u sm a x i m u at ov i r a lh a e m o r r h a g i cs e p f i c a e m i av i r u si s o l a t e df o r mc u l t i v a t e dt u r b o t J D i s a q u a tO r g a n，1 9 9 9，3 8(3)：1 6 3-1 6 8 4 2 王军，鄢庆枇养殖大黄鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究 J 台湾海峡，2 0 0 1，2 0(3)：3 4 6-3 5 1 4 3 杨鸢劫，陈辉酶联免疫吸附法快速检测鳗弧菌 J 上海交通人学学报(农业科学版)，2 0 0 5，2 3(1)：6 9-7 2 4 4 崔青曼，袁春营，吴福西中国水产动物免j 殳学研究进展 J 河北渔业，1 9 9 9，1 0 6(4)：9-1 0 4 5 黄健，于佳，千秀华单克隆抗体酶联免艘技术检测对虾皮下及造血组织坏死病的病原及其传播途径 J 海洋水产研究，1 9 9 5，1 6(1)：4 0 4 4，4 6 战文斌，铃木信一白斑症病毒在日本对虾体内的感染增殖 J 水产学报，1 9 9 9，2 3(3)：2 7 8 2 8 2 4 7 王亮，孙修勤，张进兴抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备 J 高技术通讯，2 0 0 4，l O：8 0-8 3 4 8。战文斌，铃木信一聚合酶链反应(P C R)检测养殖对虾的向斑病病毒(W S S V)感染中国水产科学，2 0 0 0，7(1)：5 1-5 4 4 9 冯现维，徐J“宏P C R 技术检测鲤鱼组织吉陶单极虫D N A 动物医学进展，2 0 0 2，2 3(5)：6 2 6 3 5 0 周化比，苏永全副溶【缸弧菌(V i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s)F l a I 基冈的合成及其克隆与鉴定 J 自然科学进展2 0 0 2，1 2(1)：1 0 1 1 0 3 5 1 邱丽华，春林生花鲈肿瘤坏岁E 冈子基冈及其在L P S 雨I 病毒刺激卜表达的研究 J 高技术通讯，2 0 0 4，1 4(1 1)i8 1-8 6 2 0 l中J 竭I j：可竹(i l f、I 曼)渔业学术论坛论文集5 2，邹慧斌，永林生海湾扇焚g 艰溶菌酶壁F _ 人I c l)N A 的兜隆与分析赢技术通讯。2 0 0 5，1 5(7)：1 0 卜1 0 6 5 3 常青山，郭福生海捕中国对虾杆状病毒的检测 J 水产学报，2 0 0 0，2 4(3)：2 6 3 2 6 6 5 4 L e eM K，B l a k eS L，S i n g e rJ T，e ta 1 G e n o m i ev a r i a t i o no fa q u a t i eb i m a v i r u s e sa n a l y z ew i t hr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s J A p p l i e da n dE n v i r o n g m e n t a lM i c r o b i o l o g y，1 9 9 6，6 2(7)：2 51 3 2 5 2 0 5 5 L e eC，C h oj c，L e eS H，e ta 1 D i s t r i b u t i o no fA e r o m o n a ss p p a si d e n