“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测”实验改进.pdf

2 0 1 4 年 第 4 9 卷 第 3期 生物学通报 5 1 “一淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 实验改进 徐 平珍(浙江 省 镇海中 学 浙 江宁 波 3 1 5 2 0 0)摘要 新课 程标准倡 导探 究性学 习 实验是 学 习生物技 术的有效途径之 一。本 实验按 照教 材 中 的 实验 步骤 需要 2 h左 右，无 法 满 足 高 中课 堂教 学要 求。另 外 本校 前 几届 师 生根 据 此 步骤 进行 实验，收集 的流 出液加入碘液 混匀后显黄 色而非红 色。从搅拌 时间、蒸馏水洗涤的体积、流 速控 制等 方面对本 实验进 行 了改进 将 实验 时间控 制在 3 0 mi n左右，以便 学生在课 堂 中完成 相 关 实验：并 对 以往 实验 中遇 到 的 一 些疑 问进 行 了探 讨。关 键 词 淀 粉 酶 实验 改进 中国图书分 类号：Q-3 3 文献标识码：B 生 物 技 术 是 一 门 既古 老 又 现 代 的技 术，而 且 涉及 的范围极 为广泛。如酿造 工业 的产品酱 油、醋、酒 等。是人 们 日常生活 中的必需 品。由于 生物技术 的迅猛发展，每 年都 需要消耗大量 的生 物酶制剂，淀粉酶作为一类重要 的生物催 化剂，在 医药、化工、食 品及饲料添加剂等领域都有广泛 的 应 用，其 产 量 几 乎 占据 整 个 酶 制 剂 总 产 量 的 5 0，且 需求量越来 越大。但是，酶在 水溶液 中 很不稳 定，容易 受到酸、碱 和有机溶 剂 的影 响，而 且溶液 中的酶很难 回收 不 能再利用 反应后酶混 在产 品中又可能影 响产 品质量 这些 因素影 响了 酶工业化 的应用，而固定化 酶技术 能很好地解决 这 些 问 题“仅一淀 粉 酶 的 固定 化 及 淀 粉 水 解 作 用 的检 测”是浙科 版生 物学 选修 1“生 物技 术实践”模 块 中第 2部 分“酶 的应用”实 验 6的 内容，也是 浙 江省生 物教学 指导 意见 中提 出 的学 生需要 掌握 的 7个 实验之 一。选修 课“生 物技术 实践”，是一 门以 自己动手做实验为主 的课程。而本 实验按照 原实验步骤 需要 2 h左右，在 高中教 学安排 中很 难 满足此要求。另外按照教材 中的实验 步骤进行 实验，得不 到理想的实验结果，本校教师和前几届 学生在 实验 中观察到流出液加碘液混匀后 溶液显 黄 色而非 红色。生物课 程标准 的基本 理念之一 是倡 导探 究性学习，实验是学 习生物技术 的有效 途径 之一。教师应尽可能为学生提供或 创造动手 操作 的机 会，通过 亲手操 作。学生在实践 中学习新 知识，并使 知识得 到延 伸，同时也 能学 习相关 实验 操作 的技能。笔者对本实验进行 了适 当改进，使学 生能在课堂时间 内完成相关实验，此外对 以往 实 验 中遇到的一些疑问进行了探讨。1 实验 材 料 仅 一 淀粉酶、可 溶性淀 粉、石英 砂、碘、碘 化钾、5 mL一次性注射器、铁 架台、烧杯、天平、滴瓶、玻 璃棒、绳 子、量筒、试管、试管 架和冰箱。2 实验 方 法 2 1 试剂 的配制 O 5 淀粉溶液：称取 0 5 g 可溶性淀粉溶 于 1 0 0 mL热水 中，搅拌 均匀。5 m m o l L K I I 溶液：称取 0 1 2 7 g碘和 O 8 3 g碘化 钾，加蒸 馏水 1 0 0 mL，完 全溶 解 后装 入 滴瓶 中。2 2 相关 装置的制作 利用 5 mL一次性注射器 和医用输液器制作 固定化 酶柱(图 1，见封三)，拆 取一次性输液器 注射细软管部分，将 剩余塑料软 管上 的控制 阀安装 于细软 管处，以便 通过调节控 制 阀控制细软管 中溶液 的流速，这样就 制成 了一 个 价格低廉且实用 的固定化 酶柱。在 灌注前将 剪好 的近 圆形 小 布片放人 注射器底 部作为筛 板，防止柱 内的石英砂从底部漏 出。2。3 具体实验步骤 仪 一 淀粉酶的固定化方案如下：甲组：在烧杯 中将 5 mg 0【一 淀粉 酶溶 于 4 mL 蒸馏 水 中，再加入 5 g石英砂，不时搅拌。3 0 m i n 后装入 固定化酶柱 中，然后 置于 4 冰箱 中保存 过 夜。5 2 生物学通报 2 0 1 4年 第 4 9卷 第 3 期 乙组：在烧杯 中将 5 mg O t 一 淀粉 酶溶 于 4 mL 蒸 馏 水 中，再 加 入 5 g石 英 砂，不 时 搅 拌。1 0 m i n 后装入 固定化酶柱 中。然后 置于 4 c c冰箱 中保存 过 夜。丙 组：在烧杯 中将 5 mg仪 一 淀粉酶 溶于 4 m L 蒸 馏水 中，再加 入 5 g石 英砂，不时搅拌。3 0 m i n 后装入固定化酶柱中。现用 现配制及装 柱。丁组：在烧杯 中将 5 m g仪一 淀粉酶溶 于 4 mL 蒸馏水 中，再加入 5 g石英砂，不 时搅 拌。1 0 mi n 后装入 固定化酶柱 中。现用现配制及装柱。将 固定化酶 柱用绳 子 固定 在铁 架 台上，调 整 高度，下方用烧杯接收 留出的液体。打开控制 阀，使 酶柱 中剩余 的酶液流 出。用量筒量取 l 0倍柱体积(5 0 m L)的蒸馏水。将蒸馏水缓慢加至 固定化酶柱 中，直至加 满，之后 调节流速 至 l mL mi n，约 2 0滴 m i n。过程中不断 往酶柱 中添加蒸馏水。蒸馏水洗涤了约 1 5 m L后，取 1支试管，加入 l mL可溶性 淀粉 溶液，再加 入 几滴 固定 化 酶柱 的流 出液，混 合后加 入 1滴 K I I：溶 液，混 匀后 观察 溶液 的颜色。若溶 液显 红色，说 明流 出 液 中仍然 有 淀粉 酶，继续 用蒸 馏水 洗 涤；若 溶 液 显 蓝色，说 明流 出液 中没 有淀 粉酶 了，可 以进 行 后续实 验。向固定化酶柱上部滴加 0 5 淀粉溶液，控 制流速约 2 0滴 mi n。在 流 出约 2 m L后，用 1支试 管 接收约 1 m L流出液，加入 1滴 K I I 溶液，混 匀，观察 溶 液 颜 色。用蒸馏水稀释 1倍后再观察颜色。实验后，用 1 0倍柱体积的蒸馏水(5 0 m L)洗 涤此柱，放置在 4 c c 冰箱 中，3 d后 再重复实验，看 能 否 得 到 相 同 的 结 果。3实 验 结 果 与 讨 论 甲、乙、丙、丁 4组 的实验结果记 录表如下：显 色结果 处 理 甲组 乙组 丙组 丁组 1 mL蒸馏 水+l滴 K I I 2 溶液 黄色 1 m L淀 粉溶 液+1滴 K I I 2 溶 液 蓝色 1 mL淀 粉溶 液+5滴酶柱 流 出液+1滴 KI I 溶 液 蓝色 蓝 色 蓝色 蓝色 1 m L流H 液+1滴 KI I 2 溶液 红色 红色 红色 红色 丁组 实验结果 如图 2(见封j)所示。甲、乙、丙、丁 4组 实 验 结 果 均 能 观 察 到 流 出 液 遇 碘 液 显 红 色 的现 象，因此 从 实 验 结 果 方 面 考 虑 这 4组实验方案均可行。从实验时间及学生 的 参 与度方 面考 虑，丁组的实验方案最佳，其实验 只 需 3 0 m i n，完全满足课堂 时间完成整个实验 的要 求。且学生能参与淀粉酶的固定化和淀粉水解 的 整个过程。用蒸馏水洗涤酶柱后至无蒸馏水残 留，关 闭控制 阀置于 4 冰箱保存 3 d后，利 用该使用 过 的固定化酶柱重复上述实验，取得相 同结果，证 实 了固化酶具有可重复使用 的优点。对 本 校 教 师 和 前 几 届 学 生在 实 验 中 观 察 到 流 出液 加 碘 液?昆匀 后 溶 液 显 黄 色 的 问题，笔 者 也 做 了一些探究。不论淀粉酶固定化是过夜、现制备，还是搅拌不 同时 间，若淀粉溶液流过 固定 化酶柱 的流速 为 0 3 m L m i n(约 7滴 rai n)或 更 慢，则 流 出液遇碘 液显黄色；若流速 过快，如 6 0滴 ra i n或 更 快，则 流 出液 遇 碘 液 显 蓝 色；若 流 速 控 制 在 l O 2 0滴 mi n，则流 出液遇碘液 显红色。流速过快 显蓝色是 由于淀粉溶液未充分水解 以致流 出液 中 含有较多淀粉，淀粉遇碘显蓝 色。显红色是 由于淀 粉在酶柱 中 一 淀粉酶的作用下水解 生成糊精，糊 精 遇碘液显红色。流速为 0 3 m L m i n时流 出液 为什么遇碘液显 黄色?回顾教材 中淀粉完全水解 的过程(如图 3所示)：淀粉在 仅 一 淀粉酶 的作用 下 生成糊精，糊精在 p 一 淀粉酶 的作用 下生成 麦 芽 糖，麦芽糖在糖化 淀粉酶作用下 生成葡萄糖。麦芽 糖 遇 碘 液 不 显 色，则 溶 液 呈 现 的颜 色 就 是 碘 液 本 身 的颜色，即与在蒸馏水 中滴加碘液后 的颜 色相 同，均 为黄 色。因此 根 据 教 材 分 析 只要 实 验 过 程 中 存在 B 一 淀粉酶，则流 出液遇碘显黄色。淀 粉 ：塑 曼 呻糊 精 麦 芽 糖 堕 坐 葡 萄 糖 遇 碘显 蓝色 遇碘 显 红色 遇 碘不 显色 图 3淀 粉水解 的过 程 B 淀粉酶广泛存 在于大 麦、小麦、玉米、大豆 及甘薯 等植物和许多微 生物 中，例如 多粘芽孢杆 菌(B a c j j j u s p o l y my x a)、蜡 状 芽 孢 杆 菌(B a c i l l u s c e r e u s)、环 状 芽 孢 杆 菌(B a c i l l u s c i r c u l a n s)、巨 大 芽孢 杆 菌(B a c i l l u s me g a t e r i u m B 6)、耐 热 梭 状 芽 孢 杆 菌(C l o s t r i d i u m t h e r m u s u l f u r o g e n e s S V 2)、日 2 0 1 4年 第 4 9卷 第 3期 生物学通报 5 3 本 根 霉(R h i z o p u s j a p o n i c u s)、链 霉 菌(S t r e p t o my c e s s p )、假 单 胞 菌(P s e u d o mo n a s s p )等 微 生 物均 能 产 生 B 一 淀粉酶。教师和学 生的整个实验 过程 均未在无 菌环 境下操作，使用 的器具也是有菌 的，甚 至试剂公 司在制备 o【一 淀粉酶 的过 程中，都 无法 排 除环境 中微 生物产生的 B 一 淀粉酶的干扰。已显 红色的流出液在室温下放置较长 时间后 溶液颜 色会 变淡甚 至消失，其原 因可能就是微 生物的影 响。因此在 实验 中应 尽可能地 以量取胜，一 淀粉 酶 的量要 远远 大于 B 一 淀粉 酶的量。此外还应控制 底 物淀粉 溶液 的流速，如果流速 足够慢，即使 B 一 淀粉酶 的量很 少 也可 以将糊 精水解 为麦芽糖，从 而使 流出液遇 碘呈黄色。笔者实验结果显示 流速 控 制在 1 0 2 0滴 mi n之间。则 流出液遇碘液显红 色，因此淀粉溶液的流速可以与蒸馏水洗 涤酶柱 的流速相 同 这样 可以节省调 速的时间。此外实验 时环境 的温度 也会影响实验的结果，因为温 度不 同，酶活性会有差异 因此一定要在教师预实 验的 基 础 上，再 开 展 学 生 实 验。事实上，一 淀 粉酶与 B 一 淀粉 酶均作用 于淀粉 中的 一 1，4糖 苷键。淀粉在 仅 一 淀粉酶作 用下可水 解 产生麦 芽糖、异 麦芽糖、麦芽 三糖 和 o【一 极 限糊 精 _ 5 。淀粉在 B 一 淀 粉酶作 用下 可产 生麦 芽糖 与 B 一 极 限糊精。麦芽糖在麦芽糖酶作用下生 成葡 萄糖。但学生 所用的资料 主要是教材，因此 在面 向学生分析实验 现象 时 应 尽可能按照教材进行 分 析。4实 验 改 进 后 的 优 点 4 1 节 省 时 间 以 利 于课 堂 教 学 按 照 浙 科 版 教 材 中的实验步骤 大约耗 时 2 h，整个实验 过程无 法在正常教学 时间内完成 若 以课 外兴趣小组或 研究性学 习的形式，又不可能让每个学生参 与，而 新课 程标准 的基本 理念之一 是面 向全体学 生 应 尽可能让每个学生均有动手操作 的机会。丁组效 果 最佳 的实验步骤 耗时 约 3 0 mi n。确保学 生能在 4 5 m i n的课堂教学 时间内完成，使每个学生都有 实践 的机会。生物学科教学指导意见 中指 出，“酶 的固定 化”实验最好不要 由教师代做，应让学生 自己动手 做，让学生直接观察与感受 固定前、后石英砂 的变 化情况。按照原实验步骤此 目标无法达成，通过 实践探 索和验证，将搅 拌 时间缩短为 1 0 mi n 使 每个学 生均有制 备 固定 化酶柱 和感受 固定前、后 石 英砂 变化 的机 会。改进后 的实 验 0 5 淀粉溶液 以 2 0滴 mi n的 流速过柱，与之前 蒸馏水洗 涤酶柱的流速相 同，免 去 了 调 整 流 速 的 步 骤，缩 短 了 实 验 时 间。4 2 细化 步骤 以便于 学生操 作 改进 后 的实 验 步骤 中将 一些模糊 不易 操作 的指 标进行 了细化 使其 变为学生一 看即知及操作 相对 比较容易 的指 标。如 1 0倍 柱体积的蒸馏水，根据实际情况记 为 5 0 mL，学 生一看便 知该 如何操 作，且 了解 5 0 mL 这 一数值 的来 源。流速 1 mL mi n的调节需要计 时 工具及量筒，操作 比较麻烦且耗 时较 多。改进后 流 速 调节 至 2 O滴 mi n 学 生用 自戴 的手表 即可计 速，可操作性更强，便于学生在较短时间 内完成。4 3增 强检 测使 实验更 加严谨 原实 验步 骤 中 用 l 0倍柱体积蒸馏水洗 涤后 再 在酶柱上方加入 淀粉溶液。学生提 出疑 问：蒸馏水洗涤 的 目的是为 了除去 酶柱 中未 吸附的游离淀 粉酶 用 l 0倍柱体 积 的蒸馏水洗涤酶柱后就一定 没有游离的淀粉酶 了吗?也有可能实 际上不需要 5 0 mL的蒸馏水洗 涤就可 以除去 了。要解释这些疑 问，一定要有事实 证 据，因此 在 改 进 后 的实 验 步 骤 中增 加 了一 项 检 测 内容，即取 1支试 管，加入 1 mL可溶 性淀 粉溶 液，再加入几滴固定化酶柱的流 出液，混合后 加入 1 滴 K l I：溶 液，混匀后观察溶液 的颜 色。若 溶液 显红色，说 明流 出液 中仍然有 淀粉酶，继续用蒸 馏 水洗涤；若溶液显蓝色，说 明流出液中没有淀 粉酶 了，可以进行后 续实验。学生实验结果显示，洗 涤 约 1 5 mL蒸馏水即可去除游离的淀粉酶。增加该检测步骤，消除 了学生 的疑惑 确定 了 是 固定 在 石 英 砂 上 的 o【一 淀 粉 酶 而 非 游 离 的 o【一 淀 粉酶在起作用，排除 了干扰因素，从 而使实验 更加 严谨。另外实验时 间缩短 了约 3 5 mi n，增加了课 堂进行实验的可行性。4 4理论结 合实践，提高课堂效率 本实验 中理 论知识点并不多，在教室中上一节课有 点抽 象，且 5 4 生物学通报 2 0 1 4年 第 4 9卷 第 3期 利用光盘制作植物临时切片的制取装置 刘 均钰(广东 省佛山 市 南 海石门 实 验中 学 广东 佛山 5 2 8 2 2 5)摘要 针 对普通徒 手切 片法存在 的安全性低、操 作难度 高等 不足，利用光盘等 简单材料 制 作植 物临时切 片的制取装 置，大大提 高 了实验 的安全性，操作 简单，切 片效果 良好，适合在 中学 生物学教 学 中推 广。关键 词 光 盘 植 物 临 时切 片 装 置 安 全 中 国 图书 分 类 号：Q一3 3 文 献 标 识 码：B “观 察 叶 片 的结 构”是 人 教 版 生 物 学 7年 级 上 册第 3单元第 3章“绿色植物与生 物圈 中的水循 环”里 开 展 的一 个 实 验，旨在 让 学 生 练 习 徒 手 切 片，通过观察切片认识 叶片的结构。但在教学实践 中，由于普通徒手切片法 的操作要求较高，对 7年 级学生 而言存在安全 隐患 而且切片效果欠佳，使 其成为教学难点，实验的开 出率较低。笔者采用光 盘等简单 材料制 成植物 临时切 片的制取装 置(下 文简称装 置)，取代普通 徒手切 片法，提 高 了实验 的安全性和切片质量，教学效果 良好。在使用 中发 现此装置还能应用于植物茎和叶柄 的临时切 片制 作，具备安全、简便、切片质量好和易推广等特点。1 装 置 的 制 作 方 法 3 1 2 4 图 1 植 物临 时切 片的 制取装 置 1 透 明光盘 2 置 于光盘 中央 圆孔 处 的半 块 刀片，其 刀刃距 圆 L 边缘 一 般 小于 0 5 c m 3 用透 明胶 纸将 刀片 两端 固定 在光 盘上 4 置 于光盘 底部 的盛 水培 养皿 其 直径小 于 光盘 直径 不够 充实。生物技 术实践 本 身就 注重于 实践。在 教 师 介 绍 固定 化 酶 柱 时 学 生 在 教 室 看 P P T 中 的示 意 图 和在 实 验 室 中 面对 桌 上 的 固 定 化 酶 柱 听 课 的感 觉 和心 情 是 截 然 不 同 的 而 兴 趣 和 激 情 是 最 佳 的学 习 助推 器 面对实物 介绍其构造 和特 点，针 对具体实验 步骤分析其 中的原 因和优、缺点，更加生动，并具有 实用性，也便于学生对相关知识的记忆和理解，促 进其对 问题 的思考。学 生的疑问是创 新精神 的体 现，也为教师改善实验指引了方 向。改 进后的实验能在一节课 时间 内完成，而 中 间一些 等待的时间，如用蒸馏水洗涤酶柱 时，恰好 可 以用来 补充理论 知识。理论结合 实践 动手操作 现学现用。新课标倡导探究性学 习 力 图促进学生 学 习方式 的变革，引导学生 主动参与探究过程。高 中阶段 的学 生本身 对于实验 充满好 奇和激 情 只 要提供平 台和适 当的引导便能使学生参 与其 中。主 要 参 考 文献 1 曾清平 淀粉 酶系偶 联 固定化技 术研 究 山东轻 T业学 院硕 士学位论 文 2 0 1 1：1 7 2王爱 丽 窦 向梅“d 一 淀 粉酶 的 固定化及 淀 粉水解 作用 的检 测”的实验 改进 生 物学 通报，2 0 0 9，4 4(7)：5 2 5 4 3 吴相 钰，刘恩 山生物 学选 修 1生物 技术 实践杭 州：浙江 科 学 技术 出版社 2 0 0 5：3 8 4张 剑，林 庭 龙，秦 瑛等 B 一 淀 粉酶 研究 进展 中国酿 造，2 0 0 9，(4)：5 8 5杨 荣武 生物 化学 原理 北 京：高等教 育 出版社，2 0 0 6：3 6 5 3 6 6 6赵 燕，李建科，霍 树春 等 酶法 制备 的玉米 全 淀粉 B一 极 限糊 精性 质初 步研 究 食 品科 学，2 0 0 7，2 8(9)：2 5 8 2 6 1 7 浙 江省 教育厅 教研 室 浙 江省普 通 高中新 课程 实验 生物 学 科教 学指 导意 见杭州：浙 江教 育 出版社，2 0 1 0：4 7 (E-ma i l：x u p z h 1 2 6 c o m)