龙须菜叶绿素- 蛋白复合物的分离及鉴定.pdf

植物学通报 2004,21(4):449 454Chinese Bulletin of Botany国家自然科学基金重大项目（39890390）资助。通讯作者。Author for correspondence.E-mail:收稿日期：2003-08-11 接受日期：2003-11-03 责任编辑：白羽红龙须菜叶绿素-蛋白复合物的分离及鉴定王广策 庄仲华 曾呈奎（中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室 青岛 266071）摘要 以海洋经济海藻龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）为材料，机械破碎与超声波相结合破碎这种含胶量非常多的细胞，蔗糖密度梯度超速离心纯化其类囊体膜，去垢剂Triton X-100增溶纯化的类囊体膜，再用蔗糖密度梯度超速离心方法分离其叶绿素-蛋白质复合物。P700差示光谱鉴定分离的光系统（PS）颗粒，并且检测到了具有DCIP光还原活性的光系统（PS）颗粒。结果表明，尽管海藻类囊体膜增溶困难，但只要条件合适，可以得到具有活性的光系统颗粒。关键词 龙须菜，叶绿素-蛋白复合物，光系统颗粒，光系统颗粒Isolation and Characterization of Chlorophyll-proteinComplexes from Gracilaria lemaneiformisWANG Guang-Ce ZHUANG Zhong-Hua ZENG Cheng-Kui(Institute of Oceanology,the Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071)Abstract Gracilaria lemaneiformis,an economical seaweed containing a lot of polysaccharide inthe cell,was homogenized by means of the combination of the mechanical grinding and ultrasonicdisruption,and then the thylakoid membrane was purified by the sucrose gradient centrifugation.The intrinsic chlorophyll-protein complexes with different pigment composition were isolated by thecentrifugation after the purified thylakoid membrane had been fragmented with the non-ionic detergent,Triton X-100.Differential spectrophotometry of these isolated chlorophyll-protein complexes showedthat the photosystemwas obtained,and the photosystem was detected to have the activity ofphoto-reduction for DCIP.All these results indicated that the photosystem particles with activitiescan be obtained although the marine algal membranes are extremely resistant to attack by detergents.Key wordsGracilaria lemaneiformis,Chlorophyll-protein complexes,Photosystemparticle,Photosystem particle存在于叶绿体类囊体膜中的蛋白质复合物是植物进行光能吸收、传递和转换的关键部位，因而一直是光合作用研究的热点（匡廷云等，1999）。长期以来，对嵌合在类囊体膜中的蛋白质复合物,尤其是叶绿素-蛋白质复合物的研究主要集中在陆地高等植物和海洋绿藻类，对褐藻特别是墨角藻（Fucus sp.）也进行了一些研究。对于光合生物进化的另一支红蓝植研 究 简 报45021(4)物（红藻和蓝藻）（曾呈奎和周百成，1983），由于其主要的捕光色素系统是附着在类囊体膜上的藻胆蛋白或藻胆体，所以一直是以藻胆蛋白或藻胆体的结构与功能为光合作用研究的重点（王广策和曾呈奎，1998），而嵌合在类囊体膜中的叶绿素-蛋白质复合物的研究却鲜有报道。其实，红藻中不但存在叶绿素-蛋白复合物，而且其在红藻的光合作用中也起着非常重要的作用。红藻光系统的捕光色素系统主要由叶绿素a-蛋白质复合物构成，光系统的捕光色素系统则由藻胆体和叶绿素a-蛋白质复合物共同构成（王广策等，2000a;2000b）。在红藻光系统中，外周捕光色素系统藻胆体捕获光能后，通过内周捕光色素系统叶绿素 a-蛋白质复合物传递给 PS 反应中心（Glazer,1985）。因此，研究红藻中叶绿素 a-蛋白质复合物的结构与功能对阐明红藻的光合作用机制意义重大。同时，红藻的进化地位特殊（Martin and Herrmann,1998），认识光合生物的进化过程必须深入研究红藻的生理生化过程，所以研究红藻的叶绿素 a-蛋白质复合物也将有助于我们认识光合生物的进化规律。江蓠属（Gracilaria）属于红藻门（Rhodophyta）、真红藻纲（Florideophyceae）、杉藻目（Gigartinales）、江蓠科（Gracilariaceae），主要分布在热带和温带海域，是一种重要的经济海藻。在我国，江蓠是继海带、紫菜和裙带菜之后的第 4 种人工栽培海藻，年产量大约为几万吨（鲜品）（张学成，1999）。江蓠的主要用途是生产琼胶（agar）和琼胶素（agarose），同时江蓠也是一种良好的食品以及养殖动物（如鲍鱼）的饲料。因此，江蓠的经济价值很高。然而，至今对江蓠的基础研究开展得很少，尤其是江蓠独特的代谢活动如光合产胶过程的研究。本文以龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)为材料，分离纯化江蓠类囊体膜中的叶绿素-蛋白质复合物，测定 PS 和 PS 复合物的活性，为深入研究江蓠的光合产胶过程奠定基础。1 材料与方法1.1 材料龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)采自青岛汇泉湾太平角，-20保存，使用时于室温下融化。1.2 方法1.2.1 类囊体膜的分离纯化 取 50 g鲜重的龙须菜，消毒海水洗净后剪成1 cm左右的小段，加入150 mL 0.05 mol.L-1 Tris-HCl缓冲液（内含0.0005 mol.L-1 K2HPO4，0.001 mol.L-1 MgCl2，0.005 mol.L-1 EDTA，0.002 mol.L-1 NaNO3，0.001 mol.L-1 MnCl2，0.1 mol.L-1蔗糖，pH7.8），在组织捣碎机中匀浆 3 min，匀浆液在冰浴中再用超声波处理 5 min，超声波的输出功率为 400W。然后，匀浆液 4 层纱布过滤后超速离心（140 000 g，4，60 min），超速离心所得的沉淀用上述缓冲液悬浮后铺在含蔗糖密度梯度离心管的上层，进行第2次超速离心（140 000 g，4，210 min）。离心管的蔗糖密度梯度为不连续蔗糖，自下而上的组成为 60%、50%、40%和 30%（W/V）。取出第2次超速离心后位于50%60 蔗糖浓度处的层带，用不含蔗糖的上述缓冲液稀释并进行超速离心（140 000 g，4，30 min）以去除蔗糖。沉淀用缓冲液悬浮，即得到较纯的类囊体膜制剂。1.2.2 色素蛋白复合物的分离 将上述纯化的类囊体膜制剂用Triton X-100在室温避光的条件下增溶 30 min，Triton X-100 与叶绿素的质量比为 200:1；随后进行蔗糖密度梯度离心4512004王广策等：龙须菜叶绿素-蛋白复合物的分离及鉴定（140 000 g，4，15 h），蔗糖密度梯度依下至上依次是 60、50、40、30、20、15和 10。取出蔗糖密度梯度中可见的层带进行光系统活性的鉴定和光谱测定。1.2.3 chla 含量的测定 测定方法参照文献（Jeffrey and Humphrey，1975），吸收光谱用Beckman DU-650 紫外及可见分光光度计测定，吸收池光径为 1 cm。1.2.4 光系统活性鉴定 P680和P700差示光谱的测定：反应液组成为50 mmol.L-1 Hepes-NaOH（pH 7.0）,2.5 mmol.L-1 MgCl2,10 mmol.L-1 KCl,0.5 mmol.L-1 高铁氰化钾，0.5 mmol.L-1 抗坏血酸，样品叶绿素浓度为10 g.mL-1。DCIP 光还原活性的测定：参考 Kuwabara（1982）的方法，反应液组成为 300 mmol.L-1蔗糖,10 mmol.L-1 NaCl，25 mmol.L-1 Hepes-NaOH(pH6.0),0.06 mmol.L-1 DCIP,1 mmol.L-1DPC，样品叶绿素浓度为 10 g.mL-1。2 结果与讨论2.1 类囊体膜的制备图 1是龙须菜细胞的匀浆液经过蔗糖密度梯度离心的结果。由图 1可以看出，30%40蔗糖层、40%50层以及 50%60%层处均有明显的条带。30%40层处的条带为红颜色，是较为完整的藻胆体；40%50层处的条带为浅绿色，可能是细胞破碎过程中产生的类囊体膜片段；50%60%层处的带是离心管中的主带，呈暗绿色，是龙须菜较完整的类囊体膜。龙须菜细胞中含有大量的碳水化合物，其中大部分碳水化合物为琼胶，一般约占细胞总重的 30%40%（纪明侯，1997），这些琼胶的存在使细胞破碎极为困难。江蓠属的海藻细胞的破碎用机械捣碎的办法，由于其强度太小很难充分破碎细胞；用大功率的超声波破碎，可能强度过大又会破坏类囊体膜的完整性。经反复实验，本研究探索出了组织捣碎和低功率超声波相结合的方法，既能够保证较高的细胞破碎率，又能保持类囊体膜尽可能的完整。2.2 龙须菜类囊体膜的增溶及其色素蛋白复合物的分离2.2.1 增溶剂对类囊体膜的增溶 使用增溶剂Triton X-100增溶龙须菜的类囊体膜，Triton X-100与叶绿素的质量比为200:1。经过比较分析，发现这种增溶条件对龙须菜类囊体膜的增溶效果最好，经过蔗糖密度梯度超速离心后，获得 7 条明显的色素带（图 2）。类囊体膜的增溶是分离色素蛋白复合物的关键，不同性质的增溶剂以及不同的浓度对研究结果影响很大。高等植物类囊体膜的增溶条件并不一定适合海藻，因为海藻类囊体膜对增溶剂有很强的抗性（Anderson and Barrett，1979）。分离海藻类囊体膜的色素蛋白质复合物时，需要使用高浓度的增溶剂，但是得到的这些蛋白质复合物往往没有活性，或者活性很弱（Anderson and Barrett，1979）；使用一些温和的增溶剂，如毛地黄皂苷（digitonin），则不能使海藻类囊体膜增溶。本文报道了用中性的增溶剂Triton X-100增溶海洋红藻龙须菜的类囊体膜，不仅得到了明显的 7 条带，而且在这些条带测得了光合作用的活性。2.2.2 色素蛋白质复合物的分离与鉴定 经过 Triton X-100 增溶的龙须菜类囊体膜，通过蔗糖密度梯度超速离心分离，共获得了 7 条色素带（图 2）。通过光谱鉴定发现，各条带均在418 nm和 670 nm处有较高的吸收峰，在 435 nm处有吸收肩峰，在 496 nm和 540 nm处各有一个非常低小的吸收峰。435 nm和670 nm处为叶绿素a的特征吸收峰，418 nm处为脱镁叶绿素的特征吸收峰，496 nm 和 540 nm 处为藻红蛋白的特征吸收峰。这些结果表明，分离得到的各条色素带主要是叶绿素-蛋白质复合物。45221(4)目前，海藻叶绿素-蛋白质复合物的研究相对集中在海洋杂色藻类，如褐藻和硅藻等（Anderson and Barrett，1979；Caron et al.,1988）。用蔗糖密度梯度离心分离时，仅能得到 5 条色素带，比本文报道的色素带要少。其原因可能有两点：（1）物种差异，褐藻和红藻虽然都是海洋红藻，但分属两个不同的门，差异很大；（2）本文报道的增溶以及分离条件可能比较合适。光谱鉴定发现，本文报道的 7 条色素带的吸收光谱基本一致，与文献关于褐藻或硅藻等杂色藻类（Anderson and Barrett，1979；Caron et al.,1988）的结果不同。我们认为原因是龙须菜非水溶性色素（主要是叶绿素 a）比较单一。龙须菜主要的捕光色素为叶绿素 a 和高度水溶的藻胆蛋白。藻胆蛋白组成藻胆体，附着在类囊体膜上，在用超声波破碎细胞以及随后用 Triton X-100 增溶类囊体膜时，藻胆体从类囊体膜上解离，成为藻胆蛋白，溶解于缓冲液中，所以在用蔗糖密度梯度离心分离时得到各条色素带很少有藻胆蛋白的存在，主要是叶绿素 a 的吸收。2.3 分离的各条带的光系统鉴定以及活性测定2.3.1 光系统（PS）的鉴定 用 P700差示光谱的方法测定获得的各个条带差，发现F3 和 F6层带在700 nm处有峰，表明是PS的颗粒，其中F3条带的峰非常明显（图3，图4）。2.3.2 光系统（PS）DCIP 光还原活性的测定 图 5 是光系统（PS）DCIP 光还原活性测定的结果。从图 5 中可以看出，以蒸馏水为对照，F2、F3、F6 和 F7 4 个条带均显示了DCIP 光还原活性。其中，蒸馏水的DCIP 光还原活性为-0.0374，可以忽略不计；F2 层带 DCIP光还原活性最强，达到3.7049 微电子当量.mg-1 Chl h-1，因此认为 F2 条带含有大量光系统颗粒。图5还显示F3、F6和F7也有一定的光系统活性，这可能是Triton X-100增溶龙须菜类图 1 蔗糖密度梯度离心分离的龙须菜的类囊体膜（左边表示蔗糖浓度）Fig.1 The thylakoid membrane purifiedby the sucrose step gradient centrifuga-t i on f r om Gracilaria lemaneiformis（The numbers in the left indicate thesucrose densities）图 2 蔗糖密度梯度离心从龙须菜类囊体膜分离的叶绿素-蛋白质复合物（左边表示蔗糖浓度(W/V)，右边表示带号）Fig.2 The chlorophyll-protein complexes isolated by thesucrose gradient centrifugation from the purified thylakoidmembrane(The numbers in the left indicate the sucrosedensities(W/V),and the numbers in the right mean the bandnumber)4532004王广策等：龙须菜叶绿素-蛋白复合物的分离及鉴定囊体膜时各个色素蛋白质复合物并未完全分开。例如从P700差示光谱表明F3带是主要的PS颗粒，然而 F3 又表现出较弱的光系统活性，说明了 F3 带主要是 PS 组分，同时又含有一些 PS 组分。用蔗糖密度梯度离心分离褐藻或者其他杂色藻类囊体膜的色素-蛋白质复合物时，往往比重最大（离心管最下面）的带为光系统颗粒，依次为光系统等（Andersonand Barrett，1979；Caron et al.,1988）。但是笔者发现比重最大的带（F7）既没有显示光系统特征，也没有表现出光系统活性，反而是位于超速离心管较上层的 F2 带（较强的光系统活性）和 F3 带（光系统特征）显示了光系统的特性，特别是 F2 带只具有了光系统活性，没有光系统的特征。由于用蔗糖密度梯度离心法分离红藻叶绿素-蛋白质复合物并没有见任何文献图 3 F3 带（在 15%蔗糖浓度处）的差示光谱，显示该带主要为光系统Fig.3 Difference absorption spectrum of the F3 band located in the 15%of sucrose,indicating that the bandcontains the PSparticle图 4 F6 带（在 50%蔗糖浓度处）的差示光谱，显示该带主要为光系统Fig.4 Difference absorption spectrum of the F3 bandlocated in the 50%of sucrose,indicating that the bandcontains the PSparticle图 5 用蔗糖密度梯度离心分离的龙须菜叶绿素-蛋白质复合物的DCIP还原性Fig.5 The activities for reducing DCIP of thechlorophyll-protein complexes isolated by the su-crose step gradient centrifugation45421(4)报道，所以这种特性是红藻门的特征，还是江蓠属抑或是龙须菜的特征，现在还很难确定。参 考 文 献王广策,曾呈奎，1998.藻胆体结构与功能的研究概况.水生生物学报，22：372377王广策，邓田，曾呈奎，2000a.藻胆蛋白的研究（）.海洋科学，24（2）：2225王广策，邓田，曾呈奎，2000b.藻胆蛋白的研究（）.海洋科学，24（3）：1922王健，徐亚南，1992.测定 P700 和 P680 差示光谱的实验条件和材料的选定.植物生理学通讯，28：437439纪明侯，1997.海藻化学(第一版).北京：科学出版社，537匡廷云，彭德川，陈志强，1999.叶绿体类囊体膜脂及叶绿素蛋白的结构与功能.见：余叔文，汤章城主编.植物生理与分子生物学(第二版).北京:科学出版社,171187张学成，1999.龙须菜研究的新进展.见：曾呈奎主编.经济海藻种质种苗生物学.济南:山东科学技术出版社，91154张其德，娄世庆，李桐柱，1979.叶绿体膜的结构与功能.钾离子和镁离子对两种类型叶绿体膜吸收光谱及光系统功能的影响.植物学报，21:250257曾呈奎，周百成，1983.光合生物的进化.进化论选集（纪念达尔文逝世一百周年学术讨论会论文选编）.北京：科学出版社，3 4 4 3Anderson J M,Barrett J,1979.Chlorophyll-protein complexes of brown algae:P700 reaction center and light-harvesting complexes.In:Chlorophyll Organization and Energy Transfer in Photosynthesis(Ciba FoundationSymposium 61).Amsterdam,New York:Excerpta MedicaCaron L,Remy R,Berkaloff C,1988.Polypeptide composition of light-harvesting complexes from some brown algaeand diatoms.FEBS Lett,229(1):1115Glazer A N,1985.Light harvesting by phycobilisomes.Ann Rev Biophys Biophys Chem,14:4777Jeffrey S,Humphrey G,1975.New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a,b,c1 and c2 in higherplants,algae,and natural phytoplankton.Biochem Physiol 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