过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶_HRP_中的若干问题及高效果的标记方法.pdf

第16卷第6期生物化学与生物物理学 报1 9 84年1 1月A OTABl(X)H工M工 CAe七B工O PHYSICAS工N IC AVol.16,No.6Nov.,1984过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HRP)中的若干问题及高效果的标记方法*I 五互宋 光承陈彩云(中国预 防医学山心寄生虫病研究所,上海)摘要术文研 究 了过碘酸钠氧化HRP的某些条件。戊二醛和磷酸盐对酶有一定的影响,而低浓度甲醛和 醋酸盐缓 冲液(HAoB)则无明显影响。氧化的最适pH在5.6左右。过碘酸钠氧化酶的适宜浓度在0.0 6O,01 5肛之间。氧化时间为 1 03 0分钟,过长则影响结合物效价。讨论了加人乙二醇的必要性。醛化的 HRP在pHg左右与抗体结合作用的适宜时间为1 62 4小时,过长则影响酶与抗体的活性,过短则结合不够完全。封闭结合物上多余醛基的KBH适宜量为0.10.21 1 19/I ng酶。本法标记抗体、抗原和葡 萄球菌A蛋白的效果均较好,方法简易,标记效果取决于酶是否能与抗体和抗原相结合,以及标记过程中酶和抗体活性是否受影响。用HRP标记抗体或抗原的 方法基本上可分成2类。一类系用双功能基团的化合物使酶 与抗体随机偶 联,如戊二醛一步法习。由于酶分子 上游离氨基极少,而抗体 分子上氨基则相对地多,为 了弥补这 一缺陷,往往采用81 2个酶分子与1个抗体分子的比值进行调整。戊 二醛二 步法 的原理,主要是HR P的氨基极少,而加入的戊二醛分子数相对地 多,当戊二醛中的一 个醛基与酶分 子上 的一个氨基结合后,则余下 的一个醛基再与另 一酶分子上 的氨基作用 的可能性极少,故很少产生酶与酶间的偶联。当去除未作用的戊二醛后,已醛化的酶与抗体作用而成为结合物幻,但这 一方法标记效果也并不 理想。另一类系 用过碘酸钠氧化 酶分 子 中的含糖部分使酶本身产生 多个醛基,酶的 活性 中心未 受影 响或影响不 大,而醛化了的酶再与待标记物作 用 即可获 得 结合物。这一方法由Nakane等首创3,其特点是标 记效 果高而所得的结合物分子量较大。上述方法除标记效果较差 的戊二醛一步法外,操作 均较复杂。骆加里等(1 98劝4 J报道了HR P标记抗原 和抗体的简 易方法,并将 戊二醛二步法 与过碘酸钠法结合起来试 图获得更好的标记效果,但结果表 明,戊 二醛一过碘酸钠法不 如 甲醛一过碘酸钠法好。为 了阐明这一原 因并进 一步提高标记效果,探讨了过碘酸钠在氧化HR P时的若干条件及结合中的某些 问题,并在这一基础 上,建立了简易、稳定、高效的方法。材料和方法HRP东风生化试剂厂1976年产品,RZ一 2.7 8;S igmaV工,RZ一3.1;或用戊 二不文19 5昌年9月2 盛日收到。“本项研究得到联合国开发计划署,世界卫生组织疟 疾、血吸虫病、带病研究培训特别规划的部分文持。丝虫病 合作中J时世界银行/世界卫生组织热6期过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HRP)中的若干问题及高效果的标记方法65了醛二 步法标记 后回收 的游离酶。羊抗 兔工gG的抗体系用亲和层析法获得的冻干材料,加生理盐水溶解至1 0mg/迎1。荀萄球菌A蛋白(SPA)购 自上海生物制品研究所。用生理盐水配成smg/m 1。乙二醇一氛化钠溶液称取2 29从C l,加2.3二1乙二醇,再加水至lo oml,可 长期保存。所用的化学试剂为分析纯或化学纯 级,水为蒸馏水。标记效 果的考核 方法即一般所用的ELI SA法,先以1:200 0的血吸虫虫 卵抗原包被4 0井的聚苯乙稀板,继以1:2 00稀释的正常兔和血吸虫病病兔血清分别加入各 井中,再将各批所得的各种结合物以1:6400开始作倍比稀释,与各种不 同稀 释 度 的 结 合物作用,最后以邻苯二胺一HoO。系统显色3 0分 钟后终止 反 应。用EL工SA一Re ade r(Dyna te ch)测定各井的 光密度(O D)值,当O D达1、2时即作为该结合物的终点。终点在1:6 40 0的稀释度时,定为1十,在1:1 28 00时定为2十。依次类推,即终 点每提高一 个倍比稀释度 即增加一个“十”酶标记血吸虫 虫卵抗原结合物的考核方法基本同上。但包被物是兔抗虫卵抗原 的抗体(2 0灿g/ml),再与不 同稀释 度的结合物作用,然后 显色,读取OD。一般标记方法取HRP1 0mg/ml浓度的溶液1份,加0.0 6MNa IO4水溶液1份,于4 oC氧化3 0分钟后加入含有2 2外N a01的0.4M乙二醇溶液1份,室温氧化3 0分钟,加冰冷无水乙醇1 2份混合,1500rpm离心10分钟,倾去上层液并倒置 试管于滤纸上,加4份蒸馏水溶解沉淀(即醛化酶),几以每I ngHRP加2mg抗体的比例,加入抗体溶液,再以pH9.6的0.SM碳酸盐缓冲液调节pH至9左右,于4 oC放置1 6、2 4小时,加1 0mg/ml的KBH4水溶液0.1、0.2份,放置2小时左右,加NaH少04溶液使pH至中性。结果一、戊二醛和甲醛 对 可aI04氧化HR P的影响smgHRP(回收酶)加 水o.Zml,等分为5管,每管4 0泌,第1管加pHg,6的0.1万碳酸缓冲液如户1和2 5%戊二醛2 0 沁(PH为8左右),第2管加O.ZMpH7.6的磷酸缓冲液(PB)40”l和3%甲醛2 0肋1(pH为7左右),第3管加水4 0协1和2石多 戊二醛2 0和1(pHS),第4管加水40补l和3多甲醛2 0”1(pHS),第5管加水60拜1(pHS),均成10mg/ml的酶浓度,以后各步均按一般标记法进 行。实验共 进行2次,各管结合物的效价分 别 为23+、5十、3十、6、7十和7+。二、不同pH对 NaI04氧化 HR P的影 响将回收酶分别溶于0.2万 醋酸,0.2MpH3.6、4.6、5,6的H入cB和水中,使 均 成1 0二g/ml的浓度,其余均按一般标记法进行。考 核 各 结 合 物效果为:pH5.6水(pH5.0)PR4.6PH3,60.ZM 醋酸。为了进 一步测定不同pH和磷酸盐对嘛104氧 化HR P的 影 响,并同时比较在生 物化 学与生 物物理学报16卷Na 1O;浓 度降低时的氧化效果,进行了如下实验:将酶溶于不 同缓冲液中,使成10mg/ml的 浓度,每1一种酶溶液 又各等分为2,加等量0.06万Na IO溶 液 者为A组,加等 量o0 3MNa IO溶液者为B组。两组于4 oC氧化3 0分钟,以后各步均按一般标记 法进行,并纪录实验中的显色情况 和pH,结果见表 l o表l冈川04于不同p日缓冲 液中 氧化日Rp的情况实实验阶段段组别别测定和和溶解酶的0.2叮 溶液及反应结果果观观观观察内容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容容N N N N N N N N NaH*P(4 4 4HAcBPHS.6 6 6汪Ac BpH4.6 6 6HAcBPH3.6 6 6水水熔熔解酶后的溶液液液PH H H45 5 55.往往1.2 2 23.0 0 05,1 1 1液液液液色色橙橙橙橙橙橙橙橙橙橙加加入NaIO4溶液氧化化A A A液色色黄灰绿绿橙灰绿绿灰绿绿灰绿绿灰绿绿1 1 1030分钟后的溶液液B B B液色色黄橙橙微橙灰绿绿淡橙灰绿绿微橙灰绿绿橙灰绿绿刀刀 日乙二醇一NaC I溶液后后八八pH H H生.1 1 15.2 2 23.9 9 92.6 6 64.9 9 9氧氧化1 03 0分钟的溶液液B B B液色色橙 黄黄橙橙橙稍 淡淡淡橙橙橙橙P P P P P P PH H H4.1 1 15.2 2 24.1 1 12.7 7 751 1 1液液液液色色橙黄黄橙橙橙稍淡淡淡橙橙登登加加水溶解乙醇沉淀物后后A A APH H H5.4 4 45.1 1 15.1 1 14.8 8 85.1 1 1的的溶液液B B B液色色近无色色橙橙橙稍淡淡淡橙橙橙橙P P P P P P PH H H54 4 454 4 454 4 45.0 0 05.1 1 1液液液液色色近无色色橙橙橙稍淡淡淡橙橙橙橙结结合物物A A A效价价幸幸67 十十5+45+6+B B B B B B B效价价价7+5十十5+6十十为了确定最适pH,将酶分 别 溶于O.ZMpH6.O的rB、0.2MpH5.6的HAeB、O.ZM醋酸钠(NaAe)及水,测得的pH分 别为:5.6、6.6、6.6及5.0。再加等量0.0 6万的N叔O;水溶液氧化,其余条件同一般标记法。测得的各结合物效价分别为:3+、78+、78 十及7+。说明除用PB作溶剂效果较差外,其余 三者 差别不 大。三、NaIO,氧化的 适宜 浓度将1 0mg/ml浓度 的酶的水溶液 加 等量 的0.1 2万、0.0 6万、o.o3M、o.0 1M及0.o o1MN缸O;溶液。其效价分别为7+、7斗一、7十、5+及1+。四、NaIO;氧化的适 宜时间将酶分别溶于水 或O.ZMpHS.6的HAcB或0.肠万NaAc中,各加等量O.0 6MNa 1O4,分别氧化10、15、30分钟或1小时。凡 氧化1030分钟者,除以水作溶剂 的为7十外,其余均 为8+。氧化1小时者结合物效价均相对地降低。五、抗体与 醛化酶 结合的适宜时 间以及用 KBH封闭的t将抗体和醛化酶混合后调节pR至9左右,分别于4 作用5、1 6、24和4 8小时,然后加入KBH;溶液。多 次实验结果表.明,均以作 用1 62 4小时,每mg酶 加0.1或O.ZmgKBH4为好,用此量 时不仅未见气泡产生,而且效价较高。若增至o.3mg则效果均降低2 5界左右,同时管 壁上可出现气泡,特别在中和后,气泡产生较为明显。六、根据上 述标 记抗体时所获得的适宜 条件,制定了如下的标记步 骤6期过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HR P)中的若干问题及高效果的标记方法65 31.醛 化酶溶液的制备称取smgHRP加0.501pH5.6的0.2MHAoB(亦可用O.OSMN aAc或水),溶解后,加入0.0 6 M过碘酸钠溶液o.sml,4 oC氧化巧或3 0分钟。加乙二醇一NaC I溶 液0.5ml,室 温作用30分钟,加冰冷的无水乙醇6.0二1混 匀,150 0rpm离 心10分钟左右,尽 量倾尽 上液(必要时可 用8 0多 冷乙醇洗涤沉淀一次)加水2.6ml溶解沉淀,即得醛化酶溶液,其浓度 约为lmg醛 化酶/0.sml o2.醛化酶与待标记物的 结合(RZ2,75的酶)根据 待标记物的类别 可按不 同比例加入上 述的醛化酶溶液。若为含2mg抗体的溶液,则加入0.5ml醛化酶为宜;若为含Zmg蛋白的血吸虫成虫或虫 卵抗原,亦加o.sml醛化酶溶液;若待标记 的是SPA,则 每mg S PA加上 述醛化酶溶液0.5ml或1ml;若为未曾标记过 的某些 蛋 白抗原,可 将上 述醛化酶分成若千份,分别加入不同的抗原 量,制成不 同比例的结合物再考核其效果,以效果好的比值作为以后标记的参考。当醛化酶与待标记物混合后,即加O.SMpHg.6的碳酸盐缓冲液 调节pH至9左右(用pH试纸测试),于犷O过夜,以每mg醛化酶 加入1 0mg/ml的KBH溶液1 0”1(即0.109);若结合物溶液过稀,亦可考虑加入2 0琳。放置2小时左右,加入NaHZPO4溶液使pH至中性,加等量甘 油混合后 于一10 oC左右保存备用。若需 冻 干,则不加NaH少O溶液和 甘油,改为装入透析 袋,于生理盐水 中透析2 4小时左右,换液3次,离心,取结合物上清液,每ml加1 00mg蔗糖,小 量分装于安瓶,进行冻干,封口后 冰箱贮藏七、酶 与抗体 的结合将酶溶液与抗体按重量比值1:1、1:2、1:3和1:4混 合,所得的结合物溶液加等量饱喂.入B CD和 硫酸按 溶液,4 oCI小时后,离心,1:1的结合物上层 液呈 淡橙色而在1:2时,则几 乎无色。在效果考核上,1:2结合物要比1:1结合物至 少增加1个“+”,而1:3和1:4的结合物不 用KBH封闭,效果也很好。八、酶标记SPA适 宜 的比值酶与SPA以2:l(重 量)的比值结合为宜。其结合物按1:6400 0稀释 时,对病兔血清的OD值可达2,以1:1结合时效价稍低,以1:2、1:3或1:4结合时,则效果依次明显 降低。在测试病人血清时,结果也相似。我们将上述1:2和1:3的结合物分别使其 与醛化酶再次 反应使平均比值改成1:1和2:1,其标记效果 即明显提高至相 同比值一次标记 时的效果,提示当酶标记量不足时,可再次与醛化酶 反应(图1)。九、对血吸虫虫卵和 成虫抗 原的标 记每mg醛 化酶与02ml或12ml(mg/ml)浓度的虫卵或成虫抗原结合,均可获得满意的结果。A.C一、5 43泛二艺薄:、R S一,一一卜一,一、-一一一l一自l一3 2l一1 6l一8I一、1一2结合物的稀释度水1000图1HRP与SPA以不同重量比结合的结合物对血吸虫病病兔血清的EL 18 A考核效果B,和C 分别为B和C结合物再次与醛化酶结 合后形成的结合物。NR S为正常兔血清的结果,上述不同浓度的各种结合物都在该线附近波动,最 高的OD值不超过0.5生物化 学与生物物理学报16卷用ELI日 A法测定,当稀释度为1:8 00 0和1:16000时,OD值仍在12之间,与1ml抗原给合者OD值稍高,但若以每时结合物中的酶浓度计算,则两者相近。这种标记抗原在命释8以刃倍时其OD仍在1以上。当与4血或6ml抗原结合时,用于E LISA测定未见其有独特的优点,但用于对流免痊电泳则可用较高的结合物浓度,具有染色后底色不深和沉淀色带清晰的特点。十、采用不同封闭荆对结合物电荷的改变取0.2血醛化酶溶液(相当于101醛量)图2结合物的电泳图自上而下,依次为:虫卵抗原+份丙氨酸,虫卵杭原十KBH封闭(对照),虫卵抗凉+乙二按,成虫抗原+份丙氨酸,成虫抗原+EB H.封闭,成虫抗原+乙二胺与2血成虫或虫卵抗原(相当于Zmg蛋白量)作用6小时左右,再加入lmg月一丙氨 酸或乙二胺使其与杭原对醛化酶作竞争给合,约1 8小时,最后加KB卫几,并以双aR.ro 中和。用E L拍人测定结合物效价的结果表 明,加入户丙氨酸或乙二胺者,其结合物分别稀释至1/8 0 00和1/40 00时,OD值即降至12,而不加的对 照组则稀释至工/320 00时可达相同的结果。以这些结合物稀释至1/10 0进行琼脂电泳 的结果如图 乳讨论过碘酸钠氧化HRP可受多种因素的影响,在已试的条件下,不仅戊二醛、磷酸盐等可影响氧化结果,而且pH亦为一重要因素。pH似在6,6时最好,:由于酶系带弱酸性的物质,其水溶液的pH在5左右,仅稍次于溶于pH5.6的HAcB中的效果。但在pH4.6的HAcB中,效果即受影响,并随pH的降低而降低。当用0.ZM醋酸钠溶解时,由于酶的存在,其pH降至6.6左 右,氧化效果仍然很好。因此pH在56,6间均为较适宜的范围。这些结果,说明了骆加里等t 1的戊二醛,过碘酸钠法不如甲醛一过碘酸钠法的原 因,主要在于 戊二醛可明显影响NaIo 对酶的氧化而甲醛则无明显影响。一般认为,pH偏碱可影响Na IO氧化的效果,推想这也是因素之一。由于戊二醛使酶醛化时的pH以偏碱为好,而N缸04的氧化则在偏酸条件下 为宜,又因过碘酸钠法远优于戊二醛法,而戊二醛一过碘酸钠法所用的条件则不利于过碘酸钠法,故未能显出戊二醛法所应起的作用。由于酶分子中含有铁叶琳,故氧化过程中颜色的改变应引起注意。在酶溶液 中加入过碘酸钠,立即出现灰绿色,特别在0.肠万过碘酸钠浓度时尤为明显。加入乙二醇 后1 0分钟左右,在pH5.6且AeB和水中氧化者已逐渐恢复至原来的橙色。但在pH4.6和3.6中氧化的,仅变成淡橙色,似提示铁外琳在氧化过程 中虽有所变化,但能复原。氧化条件较为剧烈或时间过长(如氧化1小时),就不 易复原。看 来pH较低能损害酶的活性中心,并非酶本身的醛化不足和同杭体结合的效果较差所致。酸或磷酸盐 中的氧化也表现6期过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HR P)中的若千问题及高效果的标记方法6 55了这种情 况。似乎在pH5.6中 的氧化较为温和,不 影响 铁叶琳但能产生 足够的醛 基,故获得了较好的结果。加乙二醇是必要的,因过碘酸氧化乙二醇极为迅速,这样就相对地终止 了对酶 的继续氧化。一般认为乙二醇在数分 钟内即能被氧化成乙二醛,而产生的乙二醛也系双功 能的醛基。在偏酸的情况下,酶蛋 白上的氨基与醛基的结合效果较差,不易使酶 聚合。若乙二醛分子远多 于酶分子上已产生的醛基,则可能起到戊二醛同样的作用,即有部分乙二醛的醛基与酶分子上 的氨基结合,使酶醛化,也可能使HR P中无糖或含糖量极低的 同工酶标 记。过碘酸钠的氧化 时间在4 oC15分钟已能满足要求,超过30分钟即可使酶活力下降,如氧化1小时则结合物效价降低,而氧化时的浓度在0.0 60.O15M间均能获得很好的结 果。酶与抗体结合时的重量比值以1:2为宜(分子数比约为2:1),若改为1:1,效果反而降低。用50界 饱和度硫酸按沉淀,上液带有橙色,提示酶未能全部结合。用1:2或1:3或1:4时,上液接近无色,似提示酶近于全部与抗体结 合。值得注意的是用1:4时,不 用KBH封闭处理,效果也很好,看来存在 少量未标记 的抗体不会严重影 响结合物的效果。另一 方面酶过多地与抗体结合,由于立体构型的位阻,影响抗体与相应抗原的结合。这一不 利 因素同少量未标记抗体与结合物竞争的不 利因素相比,似乎显 得更为 重要。在标记抗原或其他材料时,由于其分子量多 为未知,可先将醛化酶 与不同量的 待标记物混合,结合完毕后加以测定以选取 最适的 结合比例。结合物的分 子量大小可能在组 织化学和 细胞化学上极为重要,据Bo ors ma和S七r eef k e rk(1976)泪称,过碘酸钠法所得结合物的MW为4xl护,看 来 似乎有 聚合作用存在,因为工g G的MW为16xl护,HRP为0.4xl护,故理论值与实验值相 差一倍。我们 用所制订的 方法标记抗体或抗原的结果,表明此法稳定可靠,效果较好,方法简易,值得推荐。从所用不 同封闭剂改变结合物的 电泳迁移率的结果中,可 见以乙二胺 作封闭剂,可使结合物的正 电荷增加。但在E LI SA测定中可看出乙二胺封闭后 的结合物 的效 价有所 降低。可能乙二胺与醛化酶的 结合能力较 抗原 中的蛋 白组分 为强,以致部分醛化 酶上 的醛基被乙二胺所竞 争结合,抗原不能充分地被标记。月一丙氨酸亦有类似情况。这与醛 化酶与抗 体结 合5 6小时后 即进行KBH;封闭处理,其结合物效价降低 的情况 也是一致 的。也说明 了结合时 间必 须达到1 624小时,才能取得较高的标记效果参考文献Av ramea s,5.CouPlingofenzyme otoPr oteinowithg iuta:aldohydo.Usoofthee onjugatos劲rth。detoetio nofantigo n s a ndantibod 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