毛细管等电聚焦电泳技术进展.pdf

收稿日期:2002-06-18作者简介:杨 春,博士研究生,研究方向为多维电泳.通讯联系人:张玉奎,研究员,博士生导师,E-mail:ykzhang ,Tel/Fax:[phone].基金项目:国家/9730项目:人类重大疾病蛋白组学研究(编号 001CB510202).毛细管等电聚焦电泳技术进展杨 春,姬 磊,张维冰,张玉奎(中国科学院大连化学物理研究所 国家色谱研究分析中心,辽宁 大连 116011)摘要:介绍了毛细管等电聚焦电泳(CIEF)技术的发展和现状,特别对载体两性电解质、柱内表面处理和检测技术等方面的最新进展加以系统评述,并且对 CIEF 的定性能力、峰容量、重现性及其在生命科学方面的应用前景进行了讨论。引用文献 59 篇。关键词:毛细管等电聚焦;进展;综述中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2003)02-0121-05Advances in Capillary Isoelectric Focusing ElectrophoresisYANG Chun,JI Lei,ZHANG Weibing,ZHANG Yukui(National Chromatographic R.&A.Center,Dalian Institute of Chemical Physics,The Chinese Academy of Sciences,Dalian116011,China)Abstract:The current status and latest advances in capillary isoelectric focusing electrophoresis(CIEF)are reviewed from 59 recent research articles.Evaluations and comments on carrier am-pholytes(CAs),conditioning or coatings of capillary inner surface,and detection methods are report-ed.In addition,the aspectsof qualitative analysis,peak capacity,reproducibility in CIEF,and the fu-ture applications of CIEF in life science,are described.Key words:capillary isoelectric focusing electrophoresis;advance;review 近年来毛细管等电聚焦电泳(CIEF)作为一种特殊的微分离技术得到了较大的发展1 6,尤其在蛋白质、抗体、临床样品等生命活性物质的分离分析方面已 得到越来越 广泛的应 用。CIEF 最早 由Hjert n 等6根据平板等电聚焦电泳(IEF)的原理建立。它是将带有两性基团的样品、载体两性电解质、缓冲剂和辅助添加剂的混合物注入毛细管内,当在毛细管两端加上直流电压时,载体两性电解质可以在管内形成一定范围的 pH 梯度,样品组分依据其所带电性向阴极或阳极泳动,柱内 pH 值与该组分的等电点(pI)相同时,溶质分子的净电荷为零,宏观上该组分将聚集在该点不再进一步迁移,达到使复杂样品中各组分分离的目的。CIEF 与 IEF 相比具有耗时短、样品用量少、易于自动化等诸多优点,与毛细管区带电泳、毛细管电动力学色谱等其他分离模式相比也具有峰容量大、对两性溶质的选择性好等特点。随着 CIEF 应用范围的不断拓宽,关于 CIEF 的理论研究包括计算机模拟都取得很大进步 7 10,在 CIEF 分离分析技术方面也取得了长足的发展。1 载体两性电解质 CIEF 实验使用的载体两性电解质(CAs)一般是由多胺化合物(如:四乙烯四胺、四乙烯五胺)和A-,B-不饱和羧酸(如:丙烯酸)随机聚合制得的混合物,其中包含有数以千计的不同等电点的化合物,足以满足所需要的 pH 梯度。对于要求得到更加连续、均匀的 pH 梯度的场合,如测定 pI 值,可以选择混合 CAs 11,12。目前有多种品牌的宽等电点范围(pH 3 10,2 11)或窄等电点范围(pH 6 8,9 11)的 CAs 供应,这些产品大多直接取于平板 IEF,紫外吸收较强,实验中通常只能选择 280 nm 波长进行紫外检测,导致检测灵敏度较 214 nm 处大大降低,从而限制了其应用范围。因此有人13尝试不用 CAs 的CIEF 技术,即通过电解纯水分别产生氢离子和氢氧根离子,再利用电迁移的方法把氢离子和氢氧根离子引入毛细管中形成 pH 梯度,并且向阳极池中加入酸、向阴极池中加入碱来巩固 pH 梯度,实现了在纯水中分离蛋白质。采用动态 pH 梯度 13 15、无2003 年 3 月March 2003色谱Chinese Journal of ChromatographyVol.21 No.2121 125CAs 的 CIEF 方法具有简单、经济的特点,但形成的pH 梯度极不稳定,操作难度相对较大。Fang 等14使用了一种称作热致 pH 梯度(thermally generatedpH gradient)的方法,即在台锥形毛细管两端加上电压,由于管径的不同,相同的电流可以在毛细管内不同位置产生不同的温度,沿管轴形成温度梯度,从而导致 pH 梯度的实现,使 pH 梯度的范围与毛细管锥度成一定比例关系。另外,动态 pH 梯度也可以通过在毛细管中引入不同浓度的酸、碱并使之在管内动态地混合而形成 16 18。固定 pH 梯度(immobilized pH gradient,IPG)技术在二维凝胶电泳中已经得到普遍使用 19。IPG 的使用导致溶液粘度上升,能够极大地降低溶质的扩散,可以获得 01001 pH 单位的分辨率20,而目前 CIEF 仅能实现 0101 pH 单位水平的分辨率。但是 IPG 仅能实现窄范围的 pH 值梯度,并且这种方法难以在 CIEF 中实现。2 毛细管管壁处理 毛细管管壁的吸附作用和由管壁双电层产生的电渗流(EOF)是影响 CIEF 分离的重要因素。电渗流过大会导致样品快速通过毛细管,难以实现聚焦;而管壁的吸附作用使峰宽加大,分辨率降低,甚至滞留样品,影响分离和检测。因此,通常需要对使用的毛细管管壁进行处理。对毛细管管壁进行处理包括动态涂层和静态涂层两种方法。静态涂层是对毛细管管壁进行处理的传统方法,主要包括物理涂层和化学涂层两种,此外还有物理-化学法等。不同方法的涂层稳定性差别较大,其中化学涂层的稳定性相对更高。动态涂层是在溶液中加入聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、纤维素衍生物等亲水性高聚物,使其动态吸附在毛细管壁上,部分遮盖住 SiO-,降低 EOF,从而使聚焦过程得以进行。动态涂层不能完全消除EOF,残余的 EOF 可以用于移动样品区带,使聚焦和样品移动同时进行。精心选择的动态涂层在某些情况下也可以得到非常理想的分离结果。例如采用含 312%418%CAs(Ampholine 3-10)、0106%0118%甲基纤维素(MC-1500)、018%N,N,Nc,Nc-四甲基乙二胺(TEMED)及 1%2%的牛磺酸(taurine)缓冲溶液分离人血清白蛋白(human serumalbumin)和 人 表 皮 生 长 因 子(human epidermalgrowth factor),结果表明该方法不仅可用于分离酸性、中性、碱性蛋白质,也可通过引入 pI 内标测定组分的 pI 值21。动态涂层的优点是简单、方便,毛细管可以长期反复使用,但同时也存在稳定性相对较差、极端 pH 情况容易导致峰展宽等缺陷。目前,CIEF 中更普遍采用涂层毛细管的方法。毛细管的涂层分为硅氧键型(SiOCR)和硅碳键 型(SiCSiRRcRd)两 大 类。聚 丙 烯 酰胺 22,23涂层是最常用的 CIEF 毛细管涂层之一,已经广泛用于氨基酸、多肽、蛋白质和各种酶类的分析分离。由于聚丙烯酰胺中的酰胺基在碱性溶液中易于水解,在高 pH 条件下的稳定性较差,导致管内涂层不均匀,限制了毛细管的使用寿命。聚乙烯醇(PVA)24涂层通过在毛细管内壁键合上聚醋酸乙烯并进一步水解制得,可以在较宽的 pH 范围内稳定使用,在分析糖蛋白过程中具有比聚丙烯酰胺涂层更好 的重现 性。含氟烃 涂层22(fluorocarboncoating)也较稳定,常规 CIEF 条件下可以使用上百次。纤维素类涂层也较常用,将内径为 100 Lm 且涂布羟丙基甲基纤维素的毛细管用于 CIEF 实验中测定酵母细胞,细胞浓度低于 3 个/LL 时可得到极好的重现性,峰容量可达400020(文献原文表述)。其他诸如聚硅氧烷、聚氧乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、甲壳素类、麦芽糖(maltose)涂层都有报道 25 27,但是对它们的使用相对较少。3 检测技术 CIEF 常用的检测方法包括紫外吸收法、质谱法、荧光法、电化学法和化学发光法等。具体实验中根据实际需要采用全柱扫描检测、在线柱间检测和柱尾检测的模式。其中在线柱间检测是 CIEF 最常采用的,它是在一定的操作条件下,使聚集后的区带通过检测窗口,并直接采用光学检测器进行检测。当采用联用技术进行检测时,通常需要采用柱尾检测的方法,使柱尾流出的组分通过电化学检测器或将其引入质谱仪。3.1 全柱扫描检测 CIEF 中 使用 全 柱 扫 描检 测 具 有 诸多 优点 13,28 33:由于检测过程中样品区带不移动,因而能够极大地缩短分析时间、提高分辨率,并且可以实时监测聚焦过程,经一次实验即可找出最佳聚焦时间。通过对多次扫描数据的平均还能够提高信噪比(S/N)。最简单的全柱扫描检测装置是利用机械装置平稳移动毛细管、通过单点检测器实现。由于省略了迁移过程而使聚焦时间缩短,一般整个分析过程仅需 2 min29。全柱扫描检测经常使用通用折射率梯度成像检测器(URIGID)。其方法原理是 30:激光束(He-Ne633 nm 或者二极管 670 nm)经校准后分解为多束,聚焦在毛细管柱上,穿过样品带和管壁,经过两层管#122#色谱第 21 卷壁和样品的折射之后仍按原来的方向射出;利用电荷耦合器件(CCD)或者光电二极管将该光束信号记录下来,其信号强度正比于折射率梯度而非折射率本身。折射率检测的灵敏度较低,双光束设计 31可改善灵敏度和检测限。任何折射率与缓冲溶液有差别的组分都可以使用这种检测方法。折射率梯度成像检测受载体吸收的影响较大,但检测限依然可达10-8 10-7mol/L,采用小分子载体两性电解质有利于提高检测灵敏度。吸光光度、荧光等检测手段也适宜于 CIEF 全柱扫描检测。吸光光度法可以在 415 nm 下检测有色蛋白质(例如细胞色素 C)、在 280 nm 下检测其他蛋白质。激光诱导荧光检测是目前最灵敏的方法之一34,即使只收集到 10%的发射荧光信号,浓度检测限也可达到10-11mol/L,物质的量检测限可达415 10-17mol,其缺点是荧光标记后的样品可能具有不同的 pI,或者产生不止一个标记物。全柱检测使用的柱长一般相对较短,通常为 4 10 cm,这使得进样量和峰容量受到限制。3.2 质谱检测 质谱(MS)是被研究得最多的 CIEF 联用技术。MS 使用软电离方法已经能够处理很高分子质量的生物大分子,分子质量的测定精度可以达到 1 u 的水平;通过对 MS 数据的分析处理还可以获得生物大分子的结构信息。CIEF 与 MS 联用研究的关键是接口技术。采用包层液接口35 38(SFJ)的 CIEF/MS 联用技术可以达到10-7mol/L的检测限。但是 SFJ常将过多的带电粒子引入流出物中,而 MS 仪器具有特定的离子俘获能力,太多的蛋白质同时进入将导致其线性范围降低。微透析类接口的使用已经相当常见,有文献报道39使用一种特殊的接口技术,可以克服 SFJ 的这个缺点,同时可以使用水溶液流动相,并且样品用量较少。这种接口采用外径 250 Lm 的聚亚砜半透膜管,用来套接分离毛细管和一支短的锥形小毛细管,后者接 MS 电喷雾接口。实验当中将无机盐和低分子质量的两性载体渗出管外,而被分析组分如马肌红素(horse heart myoglobin)、碳酸脱氢酶 I(carbonic anhydrase I)、B-球蛋白 A(B-lac-toglobulin A)等则沿着毛细管到达 MS 仪器。MS 的另一改进是傅里叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance,FTICR)技术。采用这种技术的电喷雾离子源质谱(ESI-FTICR-MS)能够同时实现超高分辨率、高精度和高灵敏度的测定,检测组分的分子质量可达 106u。在此条件下可以直接检测分子质量相差 1 u 的人血红素 A 和 C(Hb A 和 Hb C)40。诱导耦合等离子体质谱(ICP-MS)与 CIEF 联用可以用于测定多种小分子化合物 41,例如不同价态的有机化合物或无机化合物。3.3 其他检测方法 紫外-可见检测方法虽然对于蛋白质等的检测灵敏度相对较低,但通过浓缩技术可以达到检测灵敏度 015 mg/L(pH 3 10)、峰容量 720(柱长 65cm)、信噪比大于 3、基线分离分辨率为 0101 pH42。采用轴向照射方法显然可以极大地增加光程长度,例如在低折射率的聚四氟乙烯管中加入含高折射率有机物如甘油的混合样,使得激发光束被限制在管中传播。用此方法分析两种天然荧光蛋白(R-藻红蛋白和绿荧光蛋白),检测浓度可达 10-13mol/L,对 R-藻红蛋白的检出限达 10-19mol43。化学发光检测灵敏度比光谱、荧光法高 102 106倍,并且设备简单,操作容易。例如采用鲁米诺-H2O2体系44柱后检测细胞色素 C,灵敏度达10-9mol/L,峰高-浓度线性范围为10-6 10-9mol/L。此外,一些特殊的检测方法也被用于 CIEF 检测,例如 C-射线检测器能够在 511 10-14到 2155 10-12g/L之间获得非常好的线性45。4 聚焦过程中的条件优化4.1 进样和迁移 CIEF 中对进样的要求通常不如毛细管区带电泳(CZE)中那么严格。CZE 中一般要求进样量低于毛细管体积的 1%左右,才能获得比较好的分离效果;而 CIEF 操作中完全可以将整个毛细管柱灌满,因而可以处理比 CZE 更多的样品。CIEF 中将样品导入毛细管可采用流体动力学和电泳两种模式。流体动力学模式又可以分为压力和真空两种方法。电泳进样由于组分电泳速度的差别可能导致不同组分的进样量不匹配。除非使用全柱检测方法,否则聚焦完成后必须移动样品使之通过检测窗口来实施检测。迁移样品的方法包括电渗流 46、压力/真空 11,47、化学驱动。化学驱动法通过在阴极或阳极池中加入酸、碱、盐(通常是 NaCl)44来改变 pH 梯度分布使样品流出,不过这种方法对末端组分效果较差,改进的办法是用两性电解质代替 NaCl。在采用阴极迁移方式时,pI 值比较低的两性电解质能够改善酸性组分的迁移;而 pI 值适中的两性电解质可以改善酸性和中性组分的迁移。在不切断电源的情况下利用一定的真空度迁移分离区带 25,这种方法既能够保持流形基本不变,也不破坏 pH 梯度,又使迁移速度加快,#123#第 2 期杨 春等:毛细管等电聚焦电泳技术进展可取得很好的迁移效果。4.2 添加剂 组分聚焦在等电点处时其净电荷为零,分子间原本存在的静电排斥消失,再加上 CIEF 特有的浓缩作用,生物大分子特别是蛋白质极易相互聚集,进而产生沉淀(蛋白质沉淀后往往给出非常尖锐的峰或者峰形带毛刺)。另外,疏水性强的组分如膜蛋白在水溶液中溶解度很小,因此需要一些添加剂如尿素、乙二醇、表面活性剂、蔗糖、山梨醇糖等防止沉淀或起增溶的作用23,44,48。此外,在溶液中加入甲基纤维素还可以随时填补涂层的流失。使用在线检测的方法可能会遇到聚焦组分超出检测窗口,处于检测死区的情况,通过向溶液中添加T EMED 可以解决这个问题。添加 TEMED 可以扩展 pH 范围 49,从而在阴极端建立一个 pH 平台,将组分往低 pH 区域/推挤0,使全部组分都聚焦在检测窗口的一侧,在迁移过程中都能通过检测点。4.3 脱盐处理 一定浓度的盐溶液有利于保持蛋白质稳定的天然构象,疏水性蛋白和一些抗体中也需要有一定浓度的盐才能形成稳定溶液。但是在 CIEF 中盐的浓度过高会影响 pH 梯度、增加聚焦时的电流强度、使焦耳热加大,导致分离效率下降,因此通常需要对实际样品进行脱盐处理48 51。蛋白质的脱盐处理可以在聚焦前实施,包括透析49,51和过滤等方法;也可在线使用透析法或电压梯度法52脱盐。电压梯度法是在一定时间内使毛细管两端的电压从 0 逐渐上升到一个比实际聚焦电压低的值,根据盐离子淌度大于蛋白质的特点,使其快速移出毛细管,当盐浓度降到适宜的范围时再进行 CIEF 操作。仔细设计升高电压的程序,人血液、脑脊髓液等样品可以直接上柱分析,无需预先处理。4.4 其他影响因素 柱长、操作电压、聚焦和迁移时间等都会对分离结果产生影响。短柱(可短到 112 cm 53)与全柱检测方法结合,可以极大的加快分析速度。长柱能获得较大的峰容量,但是色谱柱太长又会带来操作上的困难。通常使用的柱长是 10 80 cm。高电压是 CIEF 高分辨率的基础,但是过高的电压将会导致焦耳热过大,使溶液粘度降低,组分扩散加剧,降低分离效率。一般操作电压选择 2001000 V/cm。聚焦时间必须足够,应避免聚焦尚未完成即开始迁移。但是聚焦时间也并非越长越好,因为在毛细管中停留太久,将会增加分子的扩散距离和产生沉淀的机会。常用聚焦时间为 3 30 min。通常认为,聚焦结束时电流强度应降低到初始值的 10%以下,但有报道称电流强度下降到初始值的 68%时进行迁移 48,结果并无多大区别,而聚焦时间却可大大降低,原因可能是迁移的同时聚焦仍在进行。5 小结 CIEF 是一种简便、快速、高效的分离分析方法,特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质、酶类和抗体等的分离分析,能够满足组分定量、杂质检出、质量控制、临床诊断等方面的要求。随着生命科学的发展,特别是人类基因组计划(HGP)全面完成之后所谓/后基因组0时代的来临,对复杂生命体系的准确表征和分析就显得日益紧迫,其中蛋白质组研究是一个极其重要的部分。不同细胞、组织和器官在常态或病态以及不同的外界条件下的蛋白质种类、浓度和活性是不一样的。目前研究蛋白质组最常用的方法是二维平板凝胶电泳(2D-PAGE)和质谱技术,但是2D-PAGE 技术有耗时长、劳动强度高、耗样量大的缺点。由于 CIEF 是按照等电点的不同分离蛋白质,而 MS 能够确定蛋白质的分子质量,因此有人认为 CIEF-MS 联用能给出与 2D-PAGE 类似的结果 54。随着接口技术的不断完善,CIEF-MS 越来越广泛地应用于蛋白质组学的研究42,54 56。有人利用 CIEF-FT ICR-MS 技术处理同位素标记57,58的大肠杆菌细胞提取液,进样约 300 ng,一次 CIEF-FT ICR-MS 分析可揭示 400 1000个蛋白质(相对分子质量 Mr2 000 100 000)59。CIEF 是目前处理蛋白质分辨率最高的 CE 技术之一。随着研究工作的不断深入,CIEF 与其他分离、分析技术组成二维及多维分离体系,将在生命科学领域中发挥更大的作用。参考文献:1 Wu Xingzheng,Wu Jiaqi,Pawliszyn J.LCGC North Am,2001,19(5):526 2 Zhang Lihua,Zhang Weibing,Zhang Yukui,Baba Y.ChineseJournal of Chromatography,2003,21(1):32张丽华,张维冰,张玉奎,马场嘉信.色谱,2003,21(1):32 3 Mazzeo J R,Krull I S.Bio Techniq,1991,10(5):638 4 Issaq H J.Electrophoresis,2000,21(10):1 921 5 Manabe T.Electrophoresis,2000,21(6):1 116 6 Hjert n S,Zhu Mingde.J Chromatogr,1985,346:265 7 Thormann W,Molteni S,Stoffel E,Mosher R A,Chmelik J.Anal Methods Instrum,1993,1(3):177 8 Steinmann L,Mosher R A,Thormann W.J Chromatogr A,1996,756(1+2):219 9 Mao Qinglu,Pawliszyn J,Thormann W.Anal Chem,2000,72(21):5 493 10 Caslavska J,T hormann W.J Microcol Sep,2001,13(2):69#124#色谱第 21 卷 11 Shimura K,Zhi W,Matsumoto H,Kasai K.Anal Chem,2000,72(19):4 747 12 T ran N T,Daali Y,Cherkaoui S,Taverna M,Neeser J R,Veuthey J L.J Chromatogr A,2001,929(1-2):151 13 Huang T iemin,Wu Xingzheng,Pawliszyn J.Anal Chem,2000,72(19):4 758 14 Fang Xiaohong,Adams M,Pawliszyn J.Analyst,1999,124(3):335 15 Britz-McKibbin P,Bebault G M,Chen D D.Anal Chem,2000,72(8):1 729 16 Sastacek V,Foret F,Bocek P.J Chromatogr,1989,480:271 17 Gebauer P,Deml M,Pospichal J,Bocek P.Electrophoresis,1990,11:724 18 T suda T.Anal Chem,1992,64:386 19 Wenisch E,de Besi P,Righetti P G.Electrophoresis,1993,14(7):583 20 Shen Yufeng,Berger S J,Smith R D.Anal Chem,2000,72(19):4 603 21 Liu Xiaoda,Wang Quanli,Ma Liren.Chinese Journal of Chro-matography,1997,15(5):400刘晓达,王全立,马立人.色谱,1997,15(5):400 22 T ang Qing,Harrata A K,Lee Cheng S.Anal Chem,1997,69(16):3 177 23 Wu Jiaqi,Li Shuncheng,Watson A.J Chromatogr A,1998,817(1+2):163 24 T ran N T,Taverna M,Chevalier M,Ferrier D.J ChromatogrA,2000,866(1):121 25 T ang Sheng,Nesta D P,Maneri L R,Anumula K R.J PharmBiomed Anal,1999,19(3-4):569 26 Shen Yufeng,Smith R D.J Microcolumn Sep,2000,12(3):135 27 Wu Jiaqi,Pawliszyn J.J Chromatogr B,1994,657(2):327 28 Fang Xiaohong,Tragas C,Wu Jiaqi,Mao Qinglu,Pawliszyn J.Electrophoresis,1998,19(13):2 290 29 Wu Jiaqi,Pawliszyn J.J Liq Chromatogr,1993,16(9-10):1 891 30 Wu Jiaqi,Pawliszyn J.Anal Chim Acta,1995,299(3):337 31 Wu Jiaqi,Pawliszyn J.Anal Chem,1994,66(6):867 32 Mao Qinglu,Pawliszyn J.J Biochem Biophys Methods,1999,39(1-2):93 33 Wu Jiaqi,Pawliszyn J.J Chromatogr B,1994,657(2):327 34 Wu Xingzheng,Wu Jiaqi,Pawliszyn J.Electrophoresis,1995,16(8):1 474 35 Yang Liyu,Lee Cheng S,Hofstadler S A,Smith R D.AnalChem,1998,70(23):4 945 36 Chartogne A,Gaspari M,Jespersen S,Buscher B,Verheij E,Van der Heijden R,T jaden U,Van der Greef J.Rapid CommunMass Spectrom,2002,16(3):201 37 Zhang Chaoxuan,Xiang Fan,Pasa-T olic L,Anderson G A,Veenstra T D,Smith R D.Anal Chem,2000,72(7):1 462 38 Lamoree M H,Van Der Hoeven R A M,T jaden U R,Van DerGreef J.J Mass Spectrom,1998,33(5):453 39 Chartogne A,T jaden U R,Van der Greef J.Rapid CommunMass Spectrom,2000,14(14):1 269 40 Yang Liyu,Lee Cheng S,Hofstadler S A,Pasa-Tolic L,SmithR D.Anal Chem,1998,70(15):3 235 41 Michalke B,Schramel P.J Chromatogr A,1998,807(1):71 42 Shen Yufeng,Berger S J,Anderson G A,Smith R D.AnalChem,2000,72(9):2 154 43 Huang T iemin,Pawliszyn J.Analyst,2000,125(7):1 231 44 Hashimoto M,Tsukagoshi K,Nakajima R,Kondo K.J Chro-matogr A,1999,852(2):597 45 Altria K D,Simpson C F,Bharij A K,Theobald A E.Elec-trophoresis,1990,11(9):732 46 Hofmann O,Che Diping,Cruickshank K A,Mueller U R.AnalChem,1999,71(3):678 47 Hashimoto M,Tsukagoshi K,Nakajima R,Kondo K.AnalSci,1999,15(12):1 281 48 Cifuentes A,Moreno-Arribas M V,de Frutos M,Diez-Masa JC.J Chromatogr A,1999,830(2):453 49 Manabe T,Miyamoto H,Inoue K,Nakatsu M,Arai M.Elec-trophoresis,1999,20(18):3 677 50 Wu Jiaqi,T ragas C,Watson A,Pawliszyn J.Anal Chim Acta,1999,383(1-2):67 51 Tragas C,Pawliszyn J.Electrophoresis,2000,21(1):227 52 Clarke N J,Tomlinson A J,Schomburg G,Naylor 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