变性剂致胶原变性的机制和检测.pdf

西 部 皮 革第2 9卷收稿日期:2 0 0 7-0 5-0 8基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划(N C E T-0 6-0 7 8 8)第一作者简介:魏克冰(1 9 8 5年8-),男,汉族,河北人,研究方向:生物医用材料。*通讯联系人变性剂致胶原变性的机制和检测魏克冰,张陵,陈靖,穆畅道*(四川大学化工学院制药与生物工程系,四川 成都6 1 0 2 0 7)摘要:综述了变性剂引起胶原变性的机制及其检测方法的最新研究进展。关键词:变性剂;胶原;变性机制中图分类号:T S 5 1 2文献标识码:A文章编号:1 6 7 1-1 6 0 2(2 0 0 7)0 8-0 0 1 6-0 4Me c h a n i s ma n dE x a mi n a t i o no f C o l l a g e nD e n a t u r i n gR e s u l t e db yD e n a t u r a n tWE I K e-b i n g,Z H A N GL i n g,C H E NJ i n g,M UC h a n g-d a o*(C o l l e g e o f C h e m i c a l E n g i n e e r i n g,S i c h u a nU n i v e r s i t y,C h e n g d u6 1 0 0 6 5)A b s t r a c t:T h em e c h a n i s mo f c o l l a g e nd e n a t u r i n gw a s s u m m a r i z e d,a n dt h ed e v e l o p m e n t o f m e a s u r e m e n tm e t h o df o r d e n a t u r a t i o nw a s i n t r o d u c e d.K e yw o r d s:d e n a t u r a n t;c o l l a g e n;d e n a t u r i n g m e c h a n i s m1引言自然界可再生的资源有两类,一类是碳水化合物,其中包括纤维素、木质素、淀粉、胶质等;另一类是蛋白质,其中最重要的是胶原,胶原约占动物总蛋白量的3 0%。胶原蛋白是从骨、生皮、肌腱及其它动物结缔组织的胶原中提取出来的蛋白质,目前主要是由猪皮、牛皮、猪骨和牛骨中提取出来的。胶原蛋白由于特殊的结构和性能,在日用化工、医学和营养品等领域有着广阔的应用前景 1-3,因而引起国内外有关学者的极大关注。2胶原的结构现在科学界通常认为胶原的细胞外合成顺序依次为:多肽链三股螺旋的胶原分子前胶原原纤维。原胶原的精细结构总体有以下3个要点:(1)每个原胶原分子由三条肽链组成,并且肽链具有重复的氨基酸序列(G l y-X x x-Y y y)n,通常为G l y-P r o-H y p;(2)每条链都是左手螺旋,不是螺旋,每个旋转的部位有3个氨基酸残基,螺距为0.9 4n m,每条肽链大约有1 0 0 0个氨基酸残基;(3)三条螺旋的肽链盘绕成一个右手超螺旋。胶原螺旋的稳定性有赖于分子间和分子内各种作用的协同效应,包括肽键、氢键、脯氨酸(阻止了N-C键的旋转)、羟脯氨酸(与水发生桥连作用)和甘氨酸。其中(G l y-X-Y)结构的重复有助于三股螺旋的稳定 4,5。3胶原的变性机制目前关于胶原变性三股螺旋的研究很少,但胶原是一种蛋白质,我们可以从蛋白质的变性机制中得到一些有关信息。蛋白质分子较易受外界因素影响而发生构象变2 9卷第8期2 0 0 7年8月西部皮革WE S T L E A H T E RV o l.2 9N o.8A u g.2 0 0 71 6第8期化,导致活性丧失,物理、化学性质发生异常变化,这一过程称为蛋白质变性。1 9 3 1年吴宪 6 首先提出了蛋白质变性的概念,指出蛋白质变性不是蛋白质分子化学结构变化而是其空间结构的变化所导致的,这一观点已为生物化学界所普遍接受。蛋白质变性过程中,维系其空间结构的次级键被破坏,原有的空间结构解体,整个分子的形状由天然蛋白紧密的球形结构伸展为松散的无特定空间结构的链状分子。可以用作变性剂的化学物质有多种,不同的变性剂对蛋白质变性所产生的变性效果及作用机理一般不同。常用的变性剂主要有两种:(1)尿素(U r e a);(2)盐酸胍(G u H C l)。对变性剂产生的蛋白质变性问题,由于过去对在分子水平上蛋白质分子如何与变性剂分子相互作用而产生变性的机理还未搞清楚,所以从理论方面对蛋白质与变性剂在分子水平上的相互作用机理的讨论很少涉及,绝大多数方法是采用由实验结果出发的半经验公式进行分析 7-1 0。从实验结果可以推测,不同的变性剂由于分子结构不同,变性机理也不同 8。由于用不同的半经验公式得到的结果不同,对这些方法的合理性和可靠性还存在很大争议 9。有蛋白质变性实验表明 1 0,蛋白质分子在高浓度(8m o l/L)的尿素溶液或高浓度(6m o l/L)的盐酸胍溶液中将处于完全伸展的构象态。尿素分子和盐酸胍分子均为极性分子。尿素分子结构反映出,它和其它分子形成氢键时,四个氢原子可作为质子供体,一个氧原子可作为质子受体,而盐酸胍分子与其它分子以氢键形式结合时,有四个基团可作为质子供体。实验结果表明蛋白质分子与尿素分子或盐酸胍分子之间以形成氢键方式相结合。总的来说有关尿素和盐酸胍使蛋白质变性的机理,主要有以下3种观点 1 1:(1)尿素和盐酸胍分子直接与蛋白质的官能团结合;(2)通过改变水的结构,间接引起蛋白质疏水基团周围水氢键结构的变化;(3)以上两种作用同时存在。We t l a n f e r等 1 2 通过实验研究认为应该排除第一种机理的可能性;而V a n z i等 1 3 利用随机网络模(r a n d o mn e t w o r km o d e l,R N M)对变性机理进行了模拟,并对水合作用相关的热容值进行了计算,认为第二种机理不足以造成蛋白质的变性;Q i n等 1 4 在2 5用量热法研究尿素使蛋白质变性时,认为可能是第三种机理。而通过对提出的多种变性剂使蛋白质变性的机理模型的分析归纳,这些模型可分为间接作用和直接作用两大类。间接作用模型(又称溶剂替换模型)认为尿素在蛋白质第一水化层富集并能够结合到蛋白表面的空穴中,这不仅破坏了蛋白质分子周围有序排列的水分子,而且削弱了蛋白质分子内疏水相互作用,导致蛋白质变性。而直接机理(又称为结合模型)则认为尿素与蛋白质内部的氨基酸残基形成氢键,其与非极性氨基酸形成氢键会将水分子排开从而削弱蛋白质分子内疏水相互作用。而尿素与极性氨基酸残基形成氢键要强于水分子,这些因素均导致蛋白质分子溶胀变性 1 5,1 6。这些模型部分地得到热力学,实验和分子模拟 1 7,1 8 的支持,但也还存在着争议。4胶原变性的测定4.1黏度胶原应用在很大程度上依赖于其流变学特性,黏度作为流变学性质的一个重要指标,它的变化在一定程度上可以反应出蛋白质分子物理化学特性和结构的变化 1 9。所以可以通过测定胶原黏度的变化,来测定胶原变性的程度,它是一种间接的测量方法。有实验表明粘度的改变温度是变性温度的一半,且胶原黏度的降低取决于所添加的变性剂的种类和浓度。胶原蛋白分子量越大,溶液胶体性质越明显,分子扩散越慢,溶液黏度越大,加入变性剂以后,分子间次级键作用力变化显著,黏度相应变化。影响蛋白质流体粘度性质的因素主要有:溶解度、蛋白质浓度、温度、p H值、盐和剪切速率等 2 0。因而除非严格按照国家标准操作,否则不同状态下测得的粘度值,相互之间比较没有太大的实际意义,但是对于相同条件的试验来说,黏度还是具有检测水解程度的价值。如U s h a等 2 1 研究了尿素和n-丙醇对鼠尾腱胶原蛋白黏度变化,确定了其对变性温度的影响。下面介绍两种常用的黏度测定方法。4.1.1毛细管黏度计液体在毛细管黏度计(C a p i l l a r y V i s c o s i m e t e r,C V)内因重力作用的流动,当毛细管半径较细,溶剂流出时间大于1 0 0s时,可以忽略动能液体流出速度的影响,粘度正比于流出时间和密度。常用的毛细管粘度计有两种:乌氏黏度计和奥氏黏度计,它们的装置大致相同。乌氏黏度计与奥氏黏度计的结构不同,在乌氏黏度计的毛细管下端有一弯曲的玻璃侧管C与大气相通,使毛细管下端的压强始终为大气压。因此,只要测出液面从m刻痕下降到n刻痕所经过的时间魏克冰,等:变性剂致胶原变性的机制和检测皮化材料1 7西 部 皮 革第2 9卷 t,无论是标准液还是待测溶液,它们流经毛细管的体积总是相等,h的变化也相同。注入黏度计内的标准液和待测液的体积也不要求一定相等,所以使用乌氏黏度计比奥氏黏度计更方便 2 2。S a i等 2 3 利用奥氏毛细管粘度计研究了温度和浓度对虎皮蛙皮胶原蛋白的黏度影响,并通过黏度变化确定了胶原蛋白的变性温度。4.1.2旋转黏度计 2 4 旋转黏度计(R o t a t i n gV i s c o s i m e t e r,R V)是一种测量各种牛顿型液体的绝对黏度和非牛顿型液体的表观黏度的精密仪器。其原理为:使圆筒或球在流体中旋转,或者流体作同心状旋转流动而物体静止时,这些物体均受到流体的粘性力矩的作用。若旋转速度等条件相同,黏度越大力矩也越大,故测量力矩就可知道流体的黏度了。所以可以通过此方法测定出胶原黏度的变化,进而得出来胶原变性的程度。4.2拉曼光谱拉曼光谱(R a m a na c t i o ns p e c t r u m,R A S)谱线的变化能提供胶原蛋白结构改变的微观信息。拉曼具有需要样品量小、对样品无损坏、实时监测等优点,因此拉曼光谱在测量生物材料的变性特性方面比其他检测手段更方便、准确、有效,近年来越来越受到研究者的重视。董瑞新等 2 5 利用激光显微共聚焦拉曼光谱从分子水平研究了胶原蛋白的特性,在不同温度下对型胶原蛋白进行了拉曼光谱测定。他们的实验结果表明:随温度的升高,多数谱线向低波数移动;同时还给出了拉曼谱线强度随温度的变化关系,得到了0、4 0、6 8、9 0四个变性峰,其中4 0、6 8的峰与差示扫描量热法(D S C)和二次谐波法(S H G)的测量结果一致,0的峰为冰冻相变,9 0的变性峰为胶原的二级结构被破坏所致,当温度达到1 5 0时,谱线强度显著降低,大部分谱线消失,胶原的一级结构遭到破坏;胶原纤维在低温区具有较好的复性特性。4.3傅立叶变换红外光谱法傅立叶变换红外光谱法(F o u r i e r t r a n s f o r mi n-f r a r e ds p e c t r o s c o p y,F T-I R)可以提供与蛋白质变性有关的信息。红外光谱的形成是以分子的振动为基础,这些振动(化学键的伸缩、弯曲、旋转等)能定位到分子中特殊的键和基团。与生物化学有关的键和基团主要包括C=O、-C O O H、O-H、S-H等,但是,许多振动模型并不是由单一键和基团的振动形成,而是由许多邻近键的叠加而形成。蛋白质的红外吸收光谱主要是由一系列酰胺模型的吸收区组成,即酰胺区、酰胺区、酰胺区、酰胺A、酰胺B等。目前利用F T-I R对蛋白质二级结构的研究运用较多的方法有两种 2 6:一是借助重水、采用去卷积和二阶导数的酰胺I区归属方法,它能给出-螺旋、-折叠及无规则卷曲等多种结构信息;二是直接采用去卷积和二阶导数的酰胺区归属方法。李二凤等 2 7 就利用F T-I R对提取的猪皮胶原结构进行了鉴定,检测到的伸缩和弯曲振动峰的波数符合胶原酰胺区、区、区、A区等的吸收峰情况,推测提取的为胶原蛋白。4.4差示扫描量热法 2 8 差示扫描量热法(D i f f e r e n t i a l S c a n n i n g C a l o r i m e-t r y,D S C)可提供与蛋白质热变性有关的大量信息,如:蛋白质空间构象的变化、热稳定性、热变性的原因,热变性动力学,热稳定性与生理活性的关系等,近年来广泛运用于生物大分子的研究。D S C可根据图谱中的吸放热过程提供有关结构稳定性的信息,测定蛋白质构型变化的热效应。热转变包括:熔融、重结晶、分解裂解、释放气体与热容变化、热焓变化等。D S C可分析同一物质不同样品的差异以及辅料对物质热性质的影响。通常将D S C与其他分析手段联用,如与傅利叶变换红外F T-I R,圆二色谱法C D,X-r a y衍射法联用可以更准确地反映蛋白质的二级结构变化等方面的信息。4.5圆二色光谱法圆二色光谱(C i r c u l a r d i c h r o i s m,C D)可以表征蛋白质的三股螺旋结构。在蛋白质或多肽中,主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时,光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同,产生吸收差值,由于这种吸收差的存在,造成了偏振光矢量的振幅差,圆偏振光变成了椭圆偏振光,这就是蛋白质的圆二色性。将吸收值对波长作图就得到圆二色光谱。蛋白质的C D光谱一般分为两个波长范围 2 9,即1 7 8 2 5 0n m为远紫外区C D光谱,2 5 0 3 2 0n m为近紫外区C D光谱。远紫外区C D光谱反映肽键的圆二色性。在蛋白质或多肽的规则二级结构中,肽键是高度有规律排列的,排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。因此,具有不同二级结构的蛋白质或多皮化材料1 8第8期肽所产生C D谱带的位置、吸收的强弱都不相同。U s h a等 2 4 以2 0n m/m i n的速度对蛋白质溶液扫描5次,得到C D图谱。C D显示了胶原在2 2 0n m有一个正峰,2 0 0n m有一个负峰的三股螺旋的特征光谱。摩尔椭圆率会随尿素的浓度减少,直到一个特定浓度后,其又会增加。随着胶原变性程度的增加,其正峰和负峰的峰值的绝对值都会减小。5结语胶原作为一种在自然界含量很高,又有广泛作用的蛋白质,而备受人们的关注。要保持蛋白质活性,其空间结构是极其重要的,对于胶原蛋白来说,保持其三股螺旋结构是保持其空间结构的关键。但变性剂使胶原蛋白变性的机制还只是基于各种试验归纳,还没有上升到理论的高度,还有待继续的研究。研究变性剂使胶原蛋白变性的机制对于防止胶原变性、使胶原得到更好的应用有着重要的意义。参考文献:1 王碧,林炜,马春辉,等.皮革废弃物资源回用胶原蛋白的利用基础、现状及前景 J .皮革化工,2 0 0 1,1 8(3):6-9 1.2 巩方玲,黄明智.明胶表面活性的研究 J .明胶科学与技术,2 0 0 0,2 0(3):1 2 3-1 2 9 1.3 C a b e z a LF,T a y l o r M M,B r o w n EM,e t a l.P o t e n t i a l a p p l i c a t i o n sf o rg e l a t i ni s o l a t e df r o m c h r o m i u m-c o n t a i n i n gs o l i dt a n n e r yw a s t e r:m i c r o e n-c a p s u l a t i o n J .J A L C A,1 9 9 9,9 4(5):1 8 2-1 8 9.4 B e r gRA,P r o c k o pDJ.T h et h e r m a l t r a n s l a t i o no f an o n-h y-d r o x y l a t e df o r mo f c o l l a g e n J .E v i d e n c e f o r a r o l e f o r h y-d r o x-p r o l i n e i ns t a b i l i z i n g t h e t r i p l e-h e l i x o f c o l l a g e n.B i o c h e m.B i o-p h y s.R e s.C o m m u n,1 9 7 3,5 2:1 1 5-1 2 0.5 H e i d e m a n nE,R o t hW.S y t h e s i sa n di n v e s t i g a t i o no fc o l l a g e nm o d e l p e p t i d e,A d v J .P d y m.S d,1 9 8 2,4 3:1 4 3-2 0 3.6 邹承鲁.蛋白质的变性是一个分子逐步伸展的过程 J .生物化学杂志,1 9 9 3,(增刊):4-5.7 T a n f o r dC.P r o t e i nd e n a t u r a t i o n:P a r t A.C h a r a c t e r i z a t i o no f t h ed e n a t u r e ds t a t e;P a r t B.T h et r a n s i t i o nf r o m n a t i v et od e n a-t u r e ds t a t e J .A d v P r o t e i nC h e m,1 9 6 8,2 3:1 2 1-2 8 2.8 C a n t o r CR,S c h i m m e l PR.B i o p h y s i c a l C h e m i s t r y.P a r t C.T h eb e h a v i o r o f b i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e s M .S a nF r a n c i s c o:WHF r e e m a na n dC o m p a n y,U S A,1 9 8 0.1 0 7 8-1 1 0 5.9 P a c e CN,S h i r l e y BA,T h o m s o nJ A.M e a s u r i n g t h e c o n f o r m a-t i o n a l s t a b i l i t y o f a p r o t e i n A .I nP r o t e i nS t r u c t u r e a p r a c t i c a la p p r o a c h M .O x f o r d:O x f o r dU n i v e r s i t y P r e s s,1 9 9 0.3 1 1-3 3 0.1 0 L a p a n j eS.P h y s i c o c h e m i c a la s p e c t so fp r o t e i nd e n a t u r a t i o n M .N e wY o r k:J o h n Wi l e y&S o n s,1 9 7 8.2 7 2-2 9 6.1 1 卢雁,徐全清,李向荣.氨基酸与蛋白质体系热容研究.化学进展,2 0 0 4,1 6(3):3 6 5-3 6 9.1 2 We t l a u f e rDB,M a l i kSK,S t o l l e rL,e ta l.J.A m.C h e m.S o c.1 9 6 4,8 6:5 0 8-5 1 4.1 3 V a n z i F,M a d a m B,S h a r p K.J.A m.C h e m.S o c.,1 9 9 8,1 2 0:1 0 7 4 8-1 0 7 5 3.1 4 Q i nZ,R o t t i n g h a u s H,S u s a nM,e t a l.P r o t e i n s:S t r u c t.F u n c t.G e n e t.1 9 9 8,3 1(2):1 0 7-1 1 5.1 5 Wa l l q v i s t A,C o v e l l DG,T h i r u m a l a i D.H y d r o p h o b i ci n t e r a c-t i o n s i n a q u e o u s u r e a s o l u t i o n s w i t hi m p l i c a t i o n s f o r t h e m e c h-a n i s m o fp r o t e i nd e n a t u r a t i o n J .J o u r n a lo ft h eA m e r i c a nC h e m i c a l S o c i e t y,1 9 9 8,1 2 0(2):4 2 7-4 2 8.1 6 Z h a n g ZY,Z h uYJ,S h i YY.M o l e c u l a r d y n a m i c s s i m u l a t i o n so f u r e a a n dt h e r m a l i n d u c e dd e n a t u r a t i o no f p e p t i d ea n a l o g u e J .B i o p h y s i c a l C h e m i s t r y,2 0 0 1,8 9(2 P 3):1 4 5-1 6 2.1 7 C a f l i s c hA,K a r p l u sM.S t r u c t u r a ld e t a i l so fu r e ab i n d i n gt ob a r n a s e:am o l e c u l a rd y n a m i c sa n a l y s i s J .S t r u c t u r e,1 9 9 9,7(5):4 7 7-4 8 8.1 8 C a b a l l e r o H e r r e r a A,N o r d s t r a n dK,B e r n d t KD,e t a l.E f f e c t o fu r e a o np e p t i d ec o n f o r m a t i o ni nw a t e r:m o l e c u l a rd y n a m i c sa n de x p e r i m e n t a lc h a r a c t e r i z a t i o n J .B i o p h y s i c a lJ o u r n a l,2 0 0 5,8 9(2):8 4 2-8 5 7.1 9 罗永康,潘道东,沈慧星,等.蛋白质浓度、p H、离子强度对鲢鱼肌原纤维蛋白粘度的影响 J .食品与发酵工业,2 0 0 4,3 0(7):5 2-5 4.2 0 黄友如,华欲飞,裘爱泳.醇洗豆粕对大豆分离蛋白溶液粘度影响 J .粮食与油脂,2 0 0 5(4):1 8-2 1.2 1 U s h a R.R a m a s a m i T.T h e e f f e c t s o f u r e a a n dn-p r o p a n o l c o l l a-g e nd e n a t u r a t i o n:u s i n gD S C,c i r c u l a rd i c r o i s m a n dv i s c o s i t y J .T h e r m o c h i m i c a A c t a,2 0 0 4,4 0 9:2 0 1-2 0 6.2 2 章新友,周旭清,章青.对两种黏度计测量原理的分析与改进.实验室研究与探索,2 0 0 6(7):7 5 6.2 3 S a i KP,B a b uM.S t u d i e so nR a n at i g e r i n as k i nc o l l a g e n J .C o m p a r a t i v eB i o c h e m i s t r ya n dP h y s i o l o g yP a r t B,2 0 0 1,1 2 8:8 1-9 0.2 4 吴德志,须栋梁,吴耀楚.粘度的测定原理 J .实验技术经验,2 0 0 2(6):4 3.2 5 董瑞新,闫循领,江山,等.胶原蛋白温度效应的R a m a n光谱研究 J .光谱学与光谱分析,2 0 0 4,2 4(1 1):1 3 6 7-1 3 6 9.2 6 王建华,卫亚丽,文宗河,等.蛋白质结构的F T-I R研究进展 J .化学通报,2 0 0 4,7:4 8 2-4 8 6.2 7 李二凤,何小维,罗志刚.胶原蛋白的提取工艺研究 J .食品研究与开发,2 0 0 6,2 7(3):6 4-6 5.2 8 易薇,胡一桥.差示扫描量热法在蛋白质热变性研究中的应用 J .中国药学杂志.2 0 0 4,3 9(6):4 0 1-4 0 3.2 9 沈星灿,梁宏,何锡文,等.圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展 J .分析化学评述与进展,2 0 0 4,3 2(3):3 8 8-3 9 4.皮化材料魏克冰,等:变性剂致胶原变性的机制和检测1 9