蛋白质双向电泳图像分析!.pdf

!技术与方法蛋白质双向电泳图像分析!贾宇峰!）林秋霞!）郭尧君）#郭鹞#）刘少君!）#（!）军事医学科学院基础医学研究所神经生物学研究室，北京!$%&$；）中国科学院生物物理研究所，北京!$!$!；#）第四军医大学预防医学系放射医学教研室，西安!$#）摘要随着人类基因组计划的接近完成，蛋白质组（()*+,*-,）研究成为新的热点.其中高分辨率的双向电泳（+/*012-,342*356 7,6,6,8+)*(9*),424，0:;）技术使对组织或细胞的整个蛋白质组的综合分析成为可能.近年来这一技术有了很大的改进和提高，特别是图像分析系统，算法更为先进，功能日益强大，操作也更简便，为大规模研究提供了良好的工具.使用新一代的:图像分析系统，对离体培养的雪旺氏细胞的蛋白质样品双向电泳结果进行了初步分析，探讨了在图像扫描、点检测、背景消除、匹配、结果报告和数据分析各步中的技术问题，并报告了进行:图像分析的体会.关键词双向电泳，蛋白质组，图像分析，软件，雪旺氏细胞学科分类号）、第二向?:?聚丙烯酰胺凝胶电泳（?:?0AB;）、:图像分析到基质辅助激光解析电离0飞行时间质谱仪（CAD:=0EF0C?）或液相色谱0串联质谱连用（DG0C?HC?）分析，整个技术过程环环相扣，更加复杂.在各个环节中，图像分析既要对上游各步的结果做出定性和定量的评价，将一个直观的蛋白质二维图谱数字化，还要为下一步的分析提供依据.特别是在表达蛋白质组学研究中，需要用图像分析软件通过正常和异常细胞、组织等电泳图谱间的匹配，找出差异蛋白质点：哪些点消失了？哪些点是新出现的？哪些点是相同蛋白，而表达水平有差异等等.将这些目标点切下，通过氨基酸组成分析、I 端测序或质谱分析，确定是何种蛋白质，再结合图像分析数据和与内部和外部数据库比较的结果，做出结论.由此可见，:图像分析在蛋白质组研究中是不可或缺的.正当人类基因组计划即将完成之时，越来越多的实验室开始涉足后基因组（(*4+07,3*-,）领域，蛋白质组研究正在升温.在一些科研机构和生物技术公司的努力下，0:;技术不断出现突破性进展，:凝胶的分辨率也越来越高.在这种情况下，简单的图像比较是远远不能满足研究需要的，图像采集系统和分析软件必须能够检测到最小的差别和获取最多的信息!.随着 0:;技术和计算机技术的发展，:图像分析系统的性能有了很大的提高，高分辨率高速度的扫描仪如=-57,?8533,)、?EFJC 48533,)和 C*1,6B?0!$=-57237:,342+*-,+,)等，再加上新一代功能强大的软件如=-57,C54+,):、:K,4+、C,6532,!#，L等，为大规模分析做好了准备.我们的实验室正在利用 0:;技术开展神经生物学方面的蛋白质组研究工作，已经建立了全套 0:;系统，并且应用图像扫描系统和:图像分析软件对提取的雪旺氏细胞蛋白质样品电泳结果进行了初步分析研究.#国家自然科学基金资助项目（#MM%$!&）.#通讯联系人.刘少君 E,6：$!$0NNM#!#$L，;0-526：62K4OP328.Q-2.58.83郭尧君 E,6：$!$0NL%&N，;0-526：R5*OK3.7PN#.3,+收稿日期：$0$L0L，接受日期：$0$N0$NL生物化学与生物物理进展!#$%&#()*+%&#,)-.%$!；/0（）万方数据!材料与方法!#$%&本文中!#$使用蛋白质样品提取自原代培养的雪 旺 氏 细 胞，上 样 量%&!（()*+,-)+法.，/012*3/45&紫外可见分光光度仪定量）；第一向6$7使用 633-81910:;5?&线性 6AB 预制凝胶条（购 自 C3:)DE*3 AE*)3*21*(1-F:2E 602G），在6AB=E-)!电泳仪（CA(公司）上完成，第二向 H#HACB$使用自制 H#H 凝胶（!.&33 I%&33 I&J.33，!K 5L）M，N，在-:,:)凝胶自动染色仪（CA(公司）银染%；染色完成后玻璃纸覆盖，室温下放置数天干胶G!#软件与硬件63*:*DF:)!#$91F:5J&（图像分析软件）和P*8H2*0（扫 描 控 制 和 分 析 前 处 理 软 件）是 由R-0910:*)#S0*312D PF+G 开发，购自 CA(公司G工作站为联想奔月!&电脑，（A:0F1O3 66 5.&T UA/，MV）I YM&+=1（4），购自 CA(公司G!图像采集与分析使 用 P*8D2*0 控 制 63*:H2*00:)扫 描 图 像，63*:*DF:)!#$91F:5J&分析G#结果与讨论#!分析过程#!图像扫描：在 P*8H2*0 中，执行扫描G 大多数情况下，5&#A6（+-F=:)102E）比较合适，但对于过大或过小的凝胶，就应该根据实际情况调()*+!,-./01 23)*)/.4*04)5.*0（.）./1)5.*0.6703 8927 1070-7)2/（:）NV!&；#;（!）生物化学与生物物理进展05+=)29?8+万方数据节!#值$不过相对于凝胶而言，缩小的图像会导致图像质量的损失或无法分辨；而放大的图像则会由于多余的象素而出现内插值（%&()*+,-(./-,0(1），甚至会出现象素效应（*%2(,-%+&），影响测定$因此扫描时图像与凝胶大小最好是 343$本文分析采用 566!#扫描的图像（图 3-）$应该强调的是，强度校正（%&(&1%7 8-,%9)-%+&）是很重要的，特别是要使用图像做光密度测定时，一般是分析凝胶图像的第一步$强度校正可把以任意单位测得的强度值与实际的光密度（+*%8-,.(&1%7）或散射密度（.%:01(.(&1%7）值匹配$这可以解决图像扫描设备的非线性应答问题，即图像中的象素值和实际光密度之间无线性关系$由于光密度仪能够直接提供图像的校正数据，用此种设备扫描时通常不需要校正;$另外，也可用扫描软件校正图像$校正一般使用已知光密度的灰度尺（1(*-=(?-1()!除有图像翻转功能外，不提供任何其他图像调整工具，因此提交分析的基本是扫描后的原始图像，一些杂质点和明显的瑕疵也会被误认为是蛋白质点，这些将在下面的手工编辑和背景消除中得到纠正$初步检测结果，包括蛋白质点的编号、面积、量、以及峰值用表格的形式列出，图像上所有检测到的点都可用同形色块覆盖、轮廓线圈围、十字线或标记等显示（图 39）$自动检测完成后，仍有一些点未被识别出，还有一些是“假点”，另有一些因距离过近被识别成一个点，需要手工添加、删除或分割$#-=(?-1()!中提供了一些很好用的编辑工具：画点、删除点、提高峰值、边缘增加、分割点、选择点等（图）$%&!()*+,-.)/01203*4%,%1&（-）!（9）1A+()=(.1*+1，（8）!（.）1A+1.)-=(?-1()!原则上在检测前不对图像作任何处理（除了图像翻转），而是在点检测完成后消减背景，共有五种方式：手工消减、边界最低强度消减、边界平均象素值消减、非点模式消减，后三种均是完全自动的，如果上述四种方式均不能满足要求，也可以直接编辑某个点的背景水平$!#6匹配：上文已经提到，匹配是!图像分析中很重要的一步$在#-=(?-1()!B,%(中，这也是一个交互式的过程$匹配时首先要创建参考凝胶，参考凝胶可以是要分析比较的一组凝胶中的一张，也可以是几张凝胶合并而成的平均胶$用户可以通过改变向量框（/(8+)9+2）和搜索框（1(-)8A9+2）的大小来操纵匹配$由于电泳过程中的一些影响因素的作用，即使是同一样品两次电泳图像之间也存在移位或扭曲$在这种情况下，可以调整上述两个参数得到较好的匹配效果（图 5）$!#7结果报告：在图像分析的过程中，会产生大量的数据$数据的存储和输出是很重要的$#-=(?-1()!在整个分析过程中，无论是图像窗口还是测量窗口的内容变化，随时都可以拷贝到剪贴板和文件，其中数据列表还可拷贝到 B28(,文档$检测结果还可生成凝胶报告或蛋白质点报告，包括图像和列表，并可存储为):文件$另外，软件还可将分析数据自动创建成网页，点击参考胶任何一个蛋白质点就可以访问相关数据$!#83!和!校正：可通过已知分子质量的标准蛋白确定凝胶上蛋白质点的大致的分子质量（!)），等电点（*）可通过在第一向加入的等电聚焦标准蛋白（一系列分子质量相同而等电点不同的蛋白）$;C生物化学与生物物理进展9:.&;%.+*/;%.=-663；!?（）万方数据!校正首先要创建一个蛋白质列表，这些蛋白质的特性，主要是分子质量和等电点都是已知的，并将这些蛋白质与凝胶上的点关联起来（即该种蛋白质在凝胶上形成的点），软件据此进行校正#!#$%&()*#+,(-,./*0*1/#+2.：)3+400+1 1,，(524-(#（*），（5）*(-（+），.3,.-/+1+()-.02*6/1+/+1+(5+#+2*(-)3+2,+1 1,.3,.)3*)/7*)53+-.2*8+#+2$（*）*(-（9）*1+1#(*2 7*#+.；（5）*(-（-）*1+-+)+5)+-7*#+.；（+）*(-（/）*1+7*)53+-7*#+.$%&()*+),-+.*)/*&.&*&-&01)(,-()(2&034%&01)(0,-5,4(&0 4 06&00.63/4(2，4-5(2&3&(&*7,-5,4(&0 4/4(2/4-64338/45&98 60&*#:2&934;4*)1),-(0()4-6-/4(2&5 01)()-*&.&*&-&+&3#:;数据库，这些数据库中存储着不同来源的和不同形式的蛋白质信息#!分析软件基于分析所产生的蛋白质点的数据，再通过数据库中的查询，可以做出更全面的分析#软件现提供?,)940&、,00!A4+&等 B 个数据库的查询#:;:问题与展望:;:;（!）生物化学与生物物理进展?1#$53+7$036.$万方数据!#自动化：但是我们也应该看到，一张凝胶上大约总有一些点未被检测到，另外一些检测到的却是“假点”等等，这些都必须手工调整，非常耗时间费精力!另外，手工匹配也需要大量时间，而且会导致错配发生!因此，#$%分析软件的自动化程度还需提高，应向高分辨率、高灵敏度、智能化的方向发展!参考文献&()*+,-./，0)123 4!4+,52,1.63)-*)(5,1)5.,-!%7265+,#89,+23.3，&:，!$：;?,77.-3 4 0，0(97?，,A-,-B 2 0!C1)A2)-)7D3.3,E$A273：6,-3.*2+)5.,-3)-*.-#3.A953!?277/,7 F.,7，&:=GHHI8827 J$，4)7)A.4/，K)7592+$，!#$!/27)-.2!：)59.+*#A2-2+)5.,-3,E5L)+28)6M)A2E,+)-)7D3.3,E5L,#*.12-3.,-)727265+,89,+23.3.1)A23：!N2)5(+23)-*(32+.-52+E)62!%7265+,89,+23.3，&:，&（&O）：H，&（&O）：HO=:=&G;TU+AI，F,A(59T，VW2+1).2+?，!#$!XL,#*.12-3.,-)727265+,89,+23.3,E 8+,52.-3.-)-.11,W.7.Q2*8Y =&A+)*.2-5!%7265+,89,+23.3，&:G，&)：&O&;=&O&:G郭尧君!蛋白质电泳实验技术!北京：科学出版社!&:!&T(,0!%82+.12-5)7 X269-.(23,E 4+,52.-%7265+,89,+23.3!F2._.-A：R6.2-62 4+233，&:!&*+,-./0,12/34565 78*97:;6.,25672/3?7A+7,565!0CI(#N2-A&），C.(#a.)&），TSV),#0(-）!，TSV),H），CS R9),#0(-&）!（&）%&()!*+,#(-.!/(-#$0-(!&-!，1-#/!23*+.($(#43.!/(-#$0-(!&-!，,!(5(&6&GO，?9.-)；）%&()!*+,(*783(-，98!:8(&!1-#/!23*+0-(!&-!，,!(5(&6&，?9.-)；H）;!7#42!&*+&(?!4(3，(#&H，?9.-)）1B5?/?4+,52,12+232)+69 9)3 W26,12)-2L 9,5 38,5.-592 8,35#A2-,12 2+)!Y.A9#+23,7(5.,-5L,#*.12-3.,-)7 A2727265+,89,+23.3（#$%），L9.69 8+,Z.*23 592 1,35 6,18+292-3.Z2)-)7D3.3 3D3521,E 592 L9,72 8+,52,12，L)3 9.A97D.18+,Z2*.-+262-5 D2)+3!K.59 592*2Z27,812-5,E 6,18(52+5269-.(23，592 8,L2+E(7)-*(32+#E+.2-*7D.1)A2)-)7D3.33D35213)882)+2*5,9278 9.A9#59+,(A98(5，7)+A2#36)72 8+,52,1.6 35(*.23!S3.-A-2L A2-2+)5.,-5L,#*.12-3.,-)7.1)A2)-)7D3.3 3,E5L)+2，C1)A2/)352+$%7.52，592$A273,E 8+,52.-3 25+)652*E+,1 6(75(+2*R69L)-3 62773 L2+2 8+,62332*!X92)-)7D3.3 8+,62*(+2，.-67(*.-A.1)A2)6(.+212-5，38,5*25265.,-，1)569，W)6MA+,(-*3(W5+)65.,-，8%b.+6)7.W+)5.,-，)-)7D3.3+23(753+28,+5)-*)5)W)32(2+D，L2+2+28,+52*)-*.36(332*!C,4 97D55L,#*.12-3.,-)7 A27 27265+,89,+23.3，8+,52,12，.1)A2 8+,6233，3,E5L)+2，R69L)-3 6277!X9.3 L,+M L)3 3(88,+52*WD)A+)-5 E+,1)5.,-)7)5(+2 R6.2-62 N,(-*)5.,-,E?9.-)（H:G&O）!?,+238,-*.-A)(59,+!.(R 0，X27：G;#&#;:HH，%#1).7：7.(3_c-.6!W1.!)6!6-T(,0，X27：&#;GGGO;，%#1).7：D),_(-!Ac;H!-25J262.Z2*：I8+.7，O生物化学与生物物理进展E70F G67+,.F G67A+45F&；!（）万方数据