角膜新生血管的发病机制.pdf

收稿日期:2004210214 修回日期:2005202217 本文编辑:方红玲作者简介:刘晓坤,女,1979年1月出生,在读硕士研究生。联系电话:03112702795123065(O);E2mail:liuxkw 作者单位:050051 河北省石家庄市,河北医科大学第三附属医院眼科Received date:Oct 14,2004Accepted date:Feb 17,2005From theDepartment of Ophthalmology,the Third Affiliated Hospi2talofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,HebeiProcince,China角膜新生血管的发病机制刘晓坤 综述 赵 平 审校Pathoge nesis of corneal neovas cu2larizationLIU Xiao2Kun,ZHAO Ping【Ke y w ords】corneal neovascularization;p at hogene2sis;vascularendot helialgrowt hfactor;fi broblastgrowt h factor【Abs t ra ct】Cornealneovascularization(CNV)is amajor p roblem af ter c hemical burns and corneal in2flam mation.Pat hologicalangiogenesiswit hint hecornea can infl uence corneal t ransp arence and inducet he damage of ocular st r uct ure and vis ual f unction,w hic h is leading cause for blindness.Wit h t he devel2op ment ofmolecular biology,many st udiesma ke itclear t hat m ultip le factors p articip ant t he for mationofCNV.Wereviewst herelations hipbetweent heCNV and t he related factors.Rec Adv Ophthalmol 2006;26(3):2302233【中图分类号】R772.2【文献标识码】A【文章编号】100325141(2006)0320230204【关键词】角膜新生血管;发病机制;血管内皮生长因子;成纤维细胞生长因子【摘要】角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成是角膜化学烧伤、角膜炎等疾病带来的一个难题,严重影响角膜的透明性,最终可导致眼部组织结构的破坏和视功能的损害,是致盲的主要原因之一。随着细胞分子生物学的发展,大量实验研究表明,许多因素参与CNV的形成过程。我们就血管内皮生长因子等主要促角膜血管生长因素及其与CNV的关系作一综述。眼科新进展 2006;26(3):2302233正常角膜透明无血管。角膜新生血管(corneal neovascu2larization,CNV)形成是角膜化学烧伤、角膜炎、角膜移植排斥反应等疾病带来的一个难题。尽管CNV的生长有利于病原微生物的清除和组织修复,但严重影响角膜的透明性,最终可导致眼部组织结构的破坏和视功能的损害,是致盲的主要原因之一,也是临床上最难治愈的疾病之一1。随着细胞分子生物学的发展,人们对其影响因素已有较多认识,目前大量实验研究表明,许多因素参与CNV的形成过程。1 血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)1.1VEGF的结构与功能 VEGF是1989年Ferrara等在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的具有肝素结合活性的同源二聚体糖蛋白,是内皮细胞特异性促有丝分裂原。主要同源二聚体有VEGF121、165、189和206,4种类型的VEGF具有相同的生物活性。其生物效应是通过其特异性受体VEGFR介导的,VEGF有两种特异性受体,flt21(VEGFR21)和KDR/flk21(VEGFR22)。已经证实VEGF是一种特异的作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子,可通过与血管内皮细胞上特异性受体相结合,对血管内皮细胞发挥强烈的促分化作用和趋化作用,促进内皮细胞增殖和迁移,从而刺激血管生成。此外,VEGF可通过旁分泌机制,增加血管通透性,使血液中的大分子物质进入细胞外基质中,形成纤维蛋白凝胶等,有利于新生血管和基质细胞生长。VEGF对于体内新生血管的生成,维持血管的正常状态和完整性具有重要意义。1.2VEGF与CNVImanishi等2研究发现在正常角膜组织中有VEGF及其受体的基本表达,提示VEGF在维持角膜的正常生理功能方面起着重要作用。目前研究表明,VEGF的过度表达与CNV的发生发展密切相关。Burger报道在血管内皮细胞有丝分裂和血管芽发生时,角膜的VEGF蛋白表达量增加75倍。Philipp等3实验发现VEGF及其受体在人的炎症性角膜血管化时有着高表达。Amano等4发现在鼠CNV模型中,伴随着角膜受伤后的炎症和新生血管的出现,VEGF mRNA和蛋白水平明显增高,且VEGF中和抗体有效的抑制了CNV的形成。Lai等5实验证明特异性的下调VEGF的产生可以明显的减少角膜新生血管的发生。VEGF主要通过对内皮细胞的直接丝裂原作用,促进新生血管的形成,但其具体作用机制并不完全清楚。Joussen等6通过对具有同Flt21有竞争作用的lacZ基因的转基因小鼠的研究认为,VEGF调节新生血管可能是通过Flt21受体发挥作用的。Moromizato等7用损伤角膜缘的方法诱导角膜新生血管,发现敲除CD18基因和ICAM21基因的小鼠VEGF的表达明显降低,角膜新生血管均较对照组明显减少,从而认为CD18和ICAM21参与了VEGF对CNV的调控。可见VEGF参与角膜炎症性新生血管增殖的调控。2 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)2.1FGF的结构与功能 FGF最初是Gospodarowicz于1974年在牛脑下垂体中发现的一种促纤维母细胞生长因子,广泛存在于多种组织中。FGF的生物学活性通过作用于FGF受体而实现。目前研究最多的是酸性FGF(aFGF)和碱性FGF(bFGF)。aFGF除使内皮细胞产生胶原酶和纤溶酶原使基底膜降解外,还有强大的促有丝分裂作用,直接刺激032眼 科新进展 2006年3月 第27卷 第3期Rec A dv OphthalmolVol.27No.3March2006血管内皮细胞的增生。在FGF家族中,bFGF是较重要的成员,其生物活性比aFGF大10100倍,生物学功能主要有:促进新生血管形成,促进血管平滑肌细胞、内皮细胞增殖,参与炎症反应和损失组织修复等。2.2FGF与CNV 角膜上皮细胞、Bowman膜、Descemet膜和角膜内皮细胞中都有FGF存在,FGFR也存在于人角膜所有成分中。人和动物眼中存在着的FGF,主要由bFGF起作用。bFGF是人体内发现的最为有效的血管形成因子之一,在新生血管形成过程的多个环节中,如毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生、胶原合成等均有明显促进作用。体外研究表明bFGF与血管形成的全过程有关:(1)bFGF可刺激内皮细胞产生胶质酶和纤维蛋白溶酶原激活剂(t2PA),将纤维蛋白溶酶原转化为具有酶活性的纤维蛋白溶酶,后者又可激活胶原酶,溶解新生血管起始缘的基膜,并诱导血管内皮细胞进入三维的胶原基质形成新的毛细血管芽。将纤维蛋白溶酶原转化为具有酶活性的纤维蛋白溶酶,后者又可激活胶原酶,溶解新生血管起始缘的基膜,并诱导血管内皮细胞进入三维的胶原基质形成新的毛细血管芽;(2)bFGF可直接刺激内皮细胞增生,促进内皮细胞产生蛋白酶,调节内皮细胞表面整合素表达并促进内皮细胞迁移;(3)bFGF可诱使血管内皮长入胶原基质中,并形成与毛细血管类似的管腔。bFGF可刺激角膜形成新生血管,另外它能增加微血管通透性,并通过上调VEGF、TGF2 1等血管生长因子的表达而间接刺激血管生成,在血管形成过程中起着重要作用。Yang等8将不同剂量的bFGF(20,50,125,250,500 ng)植入角膜微袋后,角膜新生血管在植入后34 d出现,7 d达到最大长度,10 d后逐渐消退。而且CNV的面积与bFGF呈剂量依赖性。Shaw等9通过抑制PMN可以减低重组FGF22(rFGF22)引起的新生血管反应。可见PMN在rFGF22诱导的新生血管的生成中发挥着重要的作用。在角膜碱烧伤后的48 h以内,也就是新生血管诱导的潜伏期,免疫印迹实验未检出bFGF蛋白表达,免疫组化结果也显示角膜基质浸润的炎症细胞无bFGF着染。而在碱烧伤后的4896 h,也就是新生血管增殖期,bFGF表达显著,免疫组化结果也显示角膜上皮层bFGF呈强阳性着染,而且基质层浸润的炎症细胞和新生血管内皮细胞均表达bFGF。这就意味着:bFGF可能未参与碱烧伤后CNV的诱导,而是参与其增殖期的调控,对角膜炎症性新生血管增殖起到后续支持作用10。3转化生长因子2(transforming growth factor2,TGF2)3.1TGF2 的结构与功能 1978年DeLarco和Todar首先发现病毒转化的细胞能分泌一种具有使正常大鼠肾成纤维细胞表型发生转化能力的因子,并命名为TGF2。成熟的TGF2 有5种异构体,即TGF2 15,其中TGF2 13存在于哺乳动物中。TGF2 以自分泌、旁分泌和内分泌的方式,通过细胞表面的复杂的受体信号传导途径调控细胞的增殖、分化和凋亡,在个体发育、免疫及炎症过程中发挥重要作用。3.2TGF2 与CNV 在正常人角膜上皮、基质和内皮中均有TGF2 1的低水平表达,维持角膜上皮的存在,调节基质代谢使基质维持与其功能相适应的形态。Melrose等11研究发现,TGF2 1可刺激血管生成和上皮化,刺激成纤维细胞的增殖分化。Spirin等研究表明:TGF2 2可通过提高A2平滑肌肌动蛋白的表达,促进血管壁的成熟。在多种类型的角膜病变中均可检测出TGF2 的异常。Cursiefen等13通过免疫组化在人类化学性烧伤,角膜炎等四种角膜疾病后发生新生血管的角膜中均能检测到TGF2 的高表达。可见TGF2 对于角膜新生血管的形成有一定的促进作用。4 白细胞介素(interleukin,IL)4.1IL的结构与功能 IL是一组主要由单个核细胞产生的细胞因子,主要作用于淋巴细胞、巨噬细胞和其他细胞。IL必须与其特异性受体结合才能发挥其在细胞的激活、增殖和分化中的调节作用。目前白介素家族成员已包括IL21IL221。IL21家族主要包括IL21、IL21、IL21受体(IL21 recep2tor,IL21R)和IL21受体拮抗剂(IL21 receptor antigonist,IL21Ra)等。IL21具有广泛的免疫调节、致热和介导炎症的作用。IL21Ra是IL21的天然抑制剂,可以与IL21R产生竞争性的结合,从而消除IL21的作用。IL28是Yoshimura1987年首次从脂多糖(LPS)及植物血凝素(PHA)刺激的人血单核细胞血清中纯化出的一种对中性粒细胞有趋化作用的蛋白质。可激活中性粒细胞释放各种炎性介质。IL28的作用与其部位有关,血管外的IL28促进组织损伤,而血管内IL28则对组织起保护作用。4.2IL与CNV 正常情况下,角膜中存在IL21和IL21R,也存在IL21Ra,与其他细胞因子一起维持着角膜微环境的平衡。IL21有促新生血管形成的作用。许多研究证实,IL21是早期CNV关键的介导因子。Dana等14以未包埋的缝线建立CNV模型,发现缝线2 h后角膜内IL21和IL21的含量明显增加,24 h后达到高峰,7 d后恢复到基础水平。而且局部应用IL21Ra对早期的炎症性新生血管有明显的抑制作用。Yoshida等15实验发现IL21在鼠角膜诱导新生血管模型中,IL21蛋白和mRNA水平在角膜化学烧伤后12 h明显增加,且这种烧伤诱导的CNV可以部分的通过结膜下注射IL21抗体而抑制。Zhu等16实验发现IL21Ra通过抑制血管内皮细胞上的ICAM21的表达来发挥其作用。IL21还能调节细胞外基质(ECM)的降解,而ECM结构的改变是所有早期血管形成的关键步骤。另外,IL21能上调氮氧化物和其他反应性氧化中间产物,这些产物可以促进由bFGF和VEGF介导的血管形成。Strieter等最早研究了IL28在角膜新生血管中的作用,用兔角膜板层内植入模型发现,生理浓度的人重组IL28(rIL28)可引起CNV,连续荧光血管照影计算机辅助分析显示,给予240 ng的rIL28可使兔角膜在14 d内出现CNV。提示IL28具有促血管生成的活性。5基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)5.1MMPs的结构与功能 MMPs是一组降解细胞外基质成分的Zn2+依赖的内源性蛋白水解酶,主要由成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及角膜上皮细胞等合成与分泌。迄今为止,在MMPs家族中至少已发现26个成员17。MMPs一般以酶原的形式分泌,需活化后才具有降解活性,其主要功能有:降解细胞外基质膜有效成分、调节粘着、作用于细胞外组分其他蛋白成分而启动潜在的生物学功能、直接或间接参与胚胎发育、组织模型再塑及创伤修复等正常生理过程。在正常组织中,MMPs的水平较低并且活性受其天然抑制物 金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors ofmetalloproteinases,TIMPs)抑制。132眼 科新进展 2006年3月 第27卷 第3期Rec A dv OphthalmolVol.27No.3March20065.2MMPs与CNV 正常人角膜组织中仅能检测到MMP22的表达,而传代培养的人角膜基质细胞可表达MMP22和MMP29。MMP22和MMP29均可影响新生血管生长,在简化的细胞培养的模型中发现,没有这些MMPs的作用,新生血管化就不能发生18。Kvanta等19实验发现CNV时MMP22表达增加。赵巍等20研究表明,MMP22活性的升高主要发生于烧伤后34 d,即新生血管形成期,角膜上皮层呈强阳性着染,而且基质层和新生血管内皮细胞、角膜内皮层均表达MMP22。Kvanta等19用氪激光光凝器诱导鼠角膜产生新生血管,并检测出MMP22 mRNA表达增加,其增加在某种程度上局限于浸润的炎症细胞(主要是PMN),这表明炎性细胞诱导产生的MMP22可通过降解血管基底膜和细胞外基质而参与新生血管的形成,以使新生血管形成并可能进入基质。已有人发现MMP29在新生血管膜的周边血管外基质中显著增多,也许提示了MMP29在新生血管化过程中有其特殊作用21。Rigal2Sastourne等22实验表明在烧伤后新生血管化的角膜上MMP29有明显的高表达,在烧伤24 h即达到高峰,以后逐渐下降,至1周时已降回到其基本水平。主要位于受损的角膜上皮、基质纤维细胞、浸润的炎症细胞和新生的血管内皮细胞。Lee等23证实MMP29对于由HSV感染而导致的新生血管的生成有促进作用,且组织金属蛋白酶抑制剂TIMP21可使新生血管减少,进一步支持了MMP29在新生血管生成中的作用。Heiligenhaus等24研究认为羊膜移植抑制CNV是通过降低MMP22和MMP29的表达及其活性而实现的。6 一氧化氮(nitric oxide,NO)6.1NO的结构与功能 NO作为重要的信使分子和效应分子是在20世纪80年代后期才被发现和证实的。目前已知在体内许多组织细胞内均可以产生NO,如血管内皮细胞、平滑肌细胞及吞噬细胞等。体内NO是有L2精氨酸经一氧化氮合酶(NO synthase,NOS)催化而生成的。NO在体内半衰期极短,不产生积累,活体直接检测困难。NO是一种结构简单但具有多种生物学效应的自由基分子,它参与体内一系列生理和病理条件的生物过程,能调节血管紧张度、血管通透性、调节微循环血流、血小板粘附和聚集、神经信号传导、宿主防御反应等。6.2NO与CNV应用分子生物学技术研究证明,NOS在眼内含量丰富,角膜上皮和内皮均含有NOS。多数学者认为,NO能促进新生血管的形成。Sennlaub等研究发现:在角膜碱烧伤后CNV形成时iNOSmRNA被诱发至一高水平并在整个疾病过程中保持较高水平,烧伤区炎症渗出细胞表达iNOS蛋白。国内有人在角膜碱烧伤后CNV模型中酶法检测角膜组织NO含量结果为:碱烧伤组大鼠角膜NO含量与同期对照组大鼠相比明显升高,差异有显著性(P 0.05),第4 d和第7 d达最高峰(P 0.01)。角膜组织HE染色可观察到大量炎症细胞浸润。这些结果说明在这种疾病中,角膜组织中NO含量升高,浸润于角膜内的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞可能是角膜组织中NO生成的主要来源25。L2NAME为非选择性NOS抑制剂。Kon等26实验证明L2NAME可延缓角膜化学烧伤后CNV的生长。NO致血管形成作用的机制还不甚清楚,但是,研究表明其促血管形成作用与VEGF和P物质有关,与野生型P53基因及其蛋白的表达也有关。已知VEGF是通过酪氨酸激酶通路进行信号传导的,应用蛋白激酶C抑制剂抑制了酪氨酸激酶信号通路后,血清中NO产物水平也显著下降,说明酪氨酸激酶及其有关信号通路参与了NO介导的病理生理事件。Ziche研究表明P物质可以显著增加NOS活性,NOS抑制剂可以抑制P物质所致的内皮细胞增殖和移行。说明NO也参与了P物质致内皮细胞增殖的信号通路。NOS与p53之间存在负反馈通路。NO调节p53的构象使之失活,有利于炎症组织细胞获得再生能力,包括血管内皮细胞,因此有利于血管生成。总之,NO确实与血管形成有关,但其机制及其信号通路还未完全阐明。7 其他近年来的研究发现血小板源性生长因子PDGF主要通过直接促血管形成生长因子的介导作用间接促进新生血管的形成。有许多实验发现PDGF并不能刺激单独培养的血管内皮细胞增生,PDGF刺激内皮细胞合成bFGF增加可能是新生血管形成机制之一。有实验发现少于1 mg的重组表皮生长因子hEGF不能诱发CNV,但在某些物质,例如微量bFGF发出新生血管生长信号后,角膜缘血管活化,hEGF可促进新生血管形成。关于肿瘤坏死因子TNF在新生血管形成中的作用一直存在争议,有报道低剂量TNF会引起角膜新生血管,而高剂量的TNF则表现出抑制角膜新生血管的作用。前列腺素既能直接引起血管生成,又能通过诱导VEGF和bFGF间接促进血管生成。此外,二十烷类物质如12(R)HETrE可由角膜上皮细胞产生,在上皮细胞受损时释放,从而引起表浅CNV和角膜血管翳。8 结语综上所述,角膜新生血管形成是一个复杂的血管生成因子之间相互作用和调节的过程。因此进一步深入研究各因子及其相互之间的关系在角膜新生血管的形成和调控中的作用,对阐明角膜新生血管的发病机制和探讨防治措施有重要意义。参考文献1 腾 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