等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定.pdf

http:/-1-等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定1 常灏，黄耀江，沈光涛 中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081）E-mail： 摘摘 要：要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合 SDS-PAGE 测定牛凝血酶的等电点。经双向电泳后，SDS 聚丙烯酰胺凝胶中出现了 4 个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶 B 链的分子量一致为 32kDa，其等电点为5.19。关键词：关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.引言引言 凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。12凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割 X-Arg-Gly 或 Gly-Arg-X 序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。3 由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。1此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法 3 种。1其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。凝血酶的等电点在 5.05.5 之间1，但物种之间是有差异的。已有报道显示，将猪血浆采用适宜的稀释度稀释后，用 1%或2%冰醋酸调 pH 至 5.05.3，可将猪凝血酶原粗制品沉淀出来。2456 在我国，牛血的来源也是比较丰富的，因此从牛血中提取凝血酶也具有一定的社会意义。欲利用等电点沉淀法得到牛凝血酶的粗制品，需预先得知其等电点。虽然已有文献报道，将牛血浆稀释 10 倍后，用 2%冰醋酸调 pH 至 5.05.3，可沉淀出牛凝血酶原7，但其等电点的准确值在文献中尚未见报道。随着系统生物学和蛋白质组学的迅速发展，作为其主要的研究手段之一的电泳，应用范围越来越广泛和普遍。等电聚焦（Isoelectric Focusing,IEF）电泳技术，凭借其高分辨率等优点，现已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。它不仅可以测定蛋白质的等电点，分离混合的蛋白质，而且与 SDS-PAGE 组成双向电泳后可大大提高分离蛋白质的能力。因此，可以采用双向电泳的方法（第一向：IEF，第二向：SDS-PAGE），测定牛凝血酶的等电点。根据凝胶过滤法的测定，牛凝血酶的相对分子质量为 37 kDa，由两条多肽链通过一个二硫键相连，A 链为 5kD，B 链为 32kD。2这样就可以在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶中确定牛凝血酶的条带，从 IEF 中得知其等电点。等电点测定后，使得采用等电点沉淀法获取牛凝血酶粗制品时纯度更高，有利于纯化操作和研究其功能，以及其它相关研究工作的进行。2.等电聚焦基本原理等电聚焦基本原理 1本课题得到学校“211 工程”基金资助。http:/-2-等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF)是 1966 年由瑞典科学家 Harry Rilbe 和 Olov Vesterbery建立的一种高分辨的蛋白质分离分析技术。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的不同在一个稳定的、连续的、线性的 pH 梯度中进行蛋白质的分离分析。蛋白质是由不同数量和比例的 L-氨基酸组成的。氨基酸侧链在不同的 pH 环境中带不同的电荷。当 pHpI 时，蛋白质带负电荷，在电场的作用下向正极移动；当 pH99%）、甲叉双丙烯酰胺（瑞士 Fluka）、过硫酸铵（华美生物工程公司）、TEMED（中科院上海生化所东风生化技术公司）、载体两性电解质（pH39.5，进口分装；pH57，北京科百奥生物科技有限公司）、考马斯亮蓝 R250（瑞士 Fluka 分装）、甘氨酸（产地：上海，纯度：99%），Tris Base（Promega Corporation）、SDS（sigma 分装）、琼脂糖（华美生物工程公司）、溴酚蓝（北京化工厂）。欲将干胶制作在玻璃板上，还要用到亲和硅烷和剥离硅烷。3.1.4 主要仪器和设备主要仪器和设备 DYY-12C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）、DYCP-36 型等电聚焦电泳槽（北京市六一仪器厂）、DYCZ-24D 迷你垂直型电泳槽（北京市六一仪器厂）、层析实验冷柜（或恒温循环http:/-3-器）、酸度离子计（pH211）、脱色摇床、电子称、恒温培养箱、移液器。3.1.5 溶液的配制溶液的配制 30%凝胶单体贮液：等电聚焦电泳用 C=3%的单体贮液：丙烯酰胺 14.55g，甲叉双丙烯酰胺 0.45g，重蒸水溶解，定容至 50ml（4棕色瓶中，可保存两周）。SDS-PAGE 用 C=2.6%的单体贮液：丙烯酰胺 14.61g，甲叉双丙烯酰胺 0.39g，重蒸水溶解，定容至 50ml（4棕色瓶中，可保存两周）。10%SDS 贮液：2.5gSDS 溶于 25ml 重蒸水中（配制时需水浴加热以促溶解），室温保存。20%SDS 贮液：5.0gSDS 溶于 25ml 重蒸水中（配制时需水浴加热以促溶解），室温保存。电极液：pH39.5 等电聚焦电泳电极液：阳极 1mol/L H3PO4；阴极 1mol/L NaOH。pH57 等电聚焦电极液：阳极 0.5mol/L 冰醋酸；阴极 0.5mol/L NaOH。SDS-PAGE 电极液：每次用量以 500ml 计算，称取 Tris Base 1.514g，甘氨酸 7.207g，10%SDS 贮液 5ml,定容至 500ml（pH 8.3，不用调 pH 值）。SDS-PAGE 分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液）：称取 Tris Base 18.171g，用 6 mol/L盐酸调 pH 值至 8.9 后，用重蒸水定容至 100ml（4保存）。SDS-PAGE 浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl 缓冲液）：称取 Tris Base 12.114g，用 6 mol/L盐酸调 pH 值至 6.8 后，用重蒸水定容至 100ml（4保存）。SDS-PAGE 上样缓冲液：称取 SDS 1g，甘油 5ml，巯基乙醇 2.5ml，溴酚蓝 2 滴，浓缩胶缓冲液 25ml，用重蒸水定容至 50ml（4保存）。平衡液：巯基乙醇 5ml，浓缩胶缓冲液 6.25ml，20%SDS 贮液 11.5ml，甘油 10ml，定容至 100ml。固定液：35%甲醇（V/V），10%三氯乙酸（W/V），3.5%磺基水杨酸（W/V）。染色液：35%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V），0.1%考马斯亮蓝 R250（W/V），溶解后用滤纸过滤备用。11脱色液：25%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V）。12保存液：10%甘油（V/V），25%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V）。1310%过硫酸铵：0.1g 过硫酸铵溶解于 1ml 重蒸水中，现用现配。3.2 方法和步骤方法和步骤 通过 3.09.5pH 梯度胰蛋白酶等电点的测定，建立等电聚焦电泳的方法。利用已建立的方法，经 3.09.5pH 梯度的测定，牛凝血酶等电点的范围在 57，然后在 57pH 梯度的范围准确测定牛凝血酶的等电点。因本实验中经 57pH 梯度的范围等电聚焦电泳后，牛凝血酶产生了 13 条带，故采用了双向电泳的方法（第二向：SDS-PAGE），从而以牛凝血酶相对分子质量为依据确定其条带和等电点。3.2.1 等电聚焦凝胶的配制和灌胶等电聚焦凝胶的配制和灌胶 凝胶的配制：按照表 1-1 的比例配制凝胶。本实验采用 T=5%的凝胶，每次灌胶时配制 10ml即可。表 1-1 等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶的配制 溶液成分 体积 30%凝胶贮液/ml 1.7 重蒸水/ml 7.675 两性电解质/ml 0.625 TEMED/L 10 10%过硫酸铵/L 25 表 1-2 SDS-PAGE 凝胶的配制 溶液成分 分离胶 浓缩胶 T 值 7.5%5%30%凝胶贮液/ml2.5 0.83 重蒸水/ml 4.8 3.4 分离胶缓冲液/ml2.5 浓缩胶缓冲液/ml 0.63 10%SDS/L 100 50 TEMED/L 50 25 10%过硫酸铵/L50 25 总体积/ml 10 5 http:/-4-灌胶：将玻璃板洗净晾干。若电泳后需制成干胶，则在长玻璃上涂抹一层亲和硅烷，短玻璃上涂抹一层剥离硅烷，以使凝胶贴于长玻璃上，而与短玻璃分离。若无需制干胶，则不用涂抹亲和硅烷和剥离硅烷。将两条 1mm 厚的制胶隔条夹于两块玻璃中间，置于两边，用夹子夹紧后，即成灌胶模具。将灌胶模具水平放置，小心、迅速地将混匀的胶灌到模具内。若有气泡，可用带有长针头的注射器将气体吸出。为避免产生气泡，在灌胶的同时可轻轻敲击玻璃，促使胶匀速向前流动。灌好胶后，水平置于 3040的恒温培养箱中 1h 左右，使其聚合。待凝胶聚合后，小心将两块玻璃板打开，若已涂抹亲和硅烷和剥离硅烷，则凝胶会贴在涂有亲和硅烷的玻璃板上，而与涂有剥离硅烷的玻璃板分离。若没有涂抹这两种硅烷，凝胶会自然地帖附在其中一块玻璃板上。3.2.2 第一向电泳等电聚焦第一向电泳等电聚焦 电泳前的准备：本实验中采用的方法是在层析冷柜中进行等点聚焦电泳。电泳前，将电泳仪和电泳槽置于冷柜中预冷。将 3 层滤纸裁剪成 1cm 宽的纸条，长度与凝胶的宽度一致，作为电极条。将擦镜纸叠成 8 层厚，然后剪成 5mm5mm 的纸片，并用重蒸水浸湿，备用。预聚焦：将电泳槽调水平后，用水将带有凝胶的玻璃板与冷却板贴紧，二者之间不要留有气泡，以固定玻璃板。将电极条浸湿电极液后，铺展于凝胶的两端，然后将电极丝压在电极条上，盖上电泳槽的盖子。待冷柜中的温度降至 28时，开始预聚焦，以使载体两性电解质形成 pH 梯度。电极液的选择：pH3.09.5 阳极用 1mol/L H3PO4，阴极用 1mol/L NaOH；pH57 阳极用 0.5mol/L 冰醋酸，阴极用 0.5mol/L NaOH。预聚焦的电压应根据凝胶的宽度和厚度进行调整，控制在电流不超过 2mA/cm。本实验中的凝胶多为 1mm 厚、6cm 左右宽，一般采用 6080V 的电压，电流在 12mA 左右比较适宜。预聚焦 3040min 后，待电流降至 34mA 时，即可停止预聚焦。点样：用镊子将剪好的纸片小心地贴在凝胶的表面上。未知等电点样品的纸片可放在凝胶的中间或任意位置；等电点靠近酸性端的样品的纸片，放在凝胶的碱性端；等电点靠近碱性端的样品的纸片，放在凝胶的酸性端。用移液器吸取 10L 的样品点在纸片的边缘位置，使纸片自然吸附样品。点样完成后，继续电泳，并将电压在预聚焦电压的基础上升高 80100V，但电流不应超过预聚焦开始时的电流。去加样纸，继续电泳：自点样开始，大约 30min 后，停止电泳，去掉加样纸。此时，凝胶中会出现 pI Marker中含有的甲基红条带，说明大部分的样品已进入凝胶中，并已开始迁移。继续电泳，每间隔30min1h，且电流有所下降时，将电压升高 100V 左右，稳压电泳。每次升压后，随着电泳的进行，电流会逐渐减小，直到电流最后降至 0mA，或保持 12mA 不变时，即可停止电泳。对于本实验中采用的 DYCP-36 型等电聚焦电泳槽，电泳 56h，电流即降至 0mA。胰蛋白酶和牛凝血酶的等电聚焦电泳过程及参数见附录表 3-1，表 3-2。3.2.3 等电聚焦电泳后的检测等电聚焦电泳后的检测 pH梯度的检测：从凝胶板上顺电场方向切下一条约 5mm 宽的胶条，并测量其长度。再从胶条的碱性端向酸性端切成 5mm 等距离的小块，顺序放入每个孔已加好 1ml 重蒸水的 24 孔细胞培养板中。浸泡 1h 后，用酸度离子计测每个孔中的 pH 值，并记录。固定：http:/-5-将凝胶放入固定液中，固定 4h 以上，可过夜（换一次固定液）。染色：去掉固定液，用脱色液漂洗一次。将染色液倒入培养皿中，染色 1h。脱色：倒掉染色液，将脱色液倒入培养皿中，置于脱色摇床上脱至背景无色（需换 35 次脱色液）。测量并记录经固定、染色、脱色后凝胶长度的变化。测量条带和凝胶的保存：测量 pI Marker 和样品各条带距阴极的距离，并记录。将脱色后的凝胶放在装有保存液的培养皿中短期保存。若要长期保存凝胶，可将凝胶制成干胶。等电点的测定：等电点标准蛋白测定法：以各条带距阴极端的距离为横坐标，各条带所代表的等电点为纵坐标绘制 pH 梯度曲线，再根据所测样品条带在凝胶中的位置，从图中查出其 pI。浸泡法：以各个小胶块在凝胶上的位置为横坐标，测定的 pH 值为纵坐标绘制 pH 梯度曲线，再根据所测样品条带在凝胶中的位置，从图中查出其 pI。但在使用此法时要注意：经过固定、染色、脱色长时间的浸泡后，凝胶的大小会有变化，与切胶条时的大小不同，这时应用下面的公式进行校正。X=(L/L0)X X:脱色后凝胶块所代表的长度；X:固定前凝胶块的长度；L:脱色后凝胶的长度；L0:固定前凝胶的长度。本实验采用此法测定 pH 梯度。表面微电极测定法：电泳后立即用表面微电极直接放在凝胶表面，每隔 5mm 距离，测定胶板的 pH 值，绘制 pH 梯度曲线。3.2.4 第二向电泳第二向电泳SDS-PAGE 凝胶的配制：按照表 1-2 的比例配制凝胶。本实验采用 C=2.6%的单体贮液。灌胶：凝胶的厚度应为 1.5mm，以便于从第一向电泳切下的胶条向第二向电泳的转移。在灌完分离胶和浓缩胶后，都要在胶面上小心地覆盖一层水，以促进凝胶的聚合并使胶面聚合平齐。浓缩胶的高度约为 7mm，距短玻璃约 1cm，上面要留出足够的空间摆放欲转移的第一向电泳的胶条。两向间的转移：将做完 IEF（pH57）后的凝板沿电场方向切下宽约 78mm 的一窄条，在凝胶的碱性端切去一小块，以示标记。将此胶条置于平衡液中 30min1h。然后，将胶条旋转 90 度，有样品的一面朝外，碱性端与 SDS-PAG 的一端贴紧，小心使整个胶条贴于浓缩胶上，两块胶的界面上应无气泡产生。在本实验中，因牛凝血酶在酸性端没有条带，故可将酸性端切去 7mm 放分子量 Marker。在胶条酸性端的旁边，浓缩胶面上，放置 5mm5mm 的用重蒸水浸湿的 8 层擦镜纸，将分子量标准蛋白点在上面。最后，用含有溴酚蓝的 0.1%琼脂糖凝胶将转移好的胶条密封好。SDS-PAGE：在溴酚蓝前沿进入分离胶之前，以 80V 稳压电泳，电流会从约 40mA 逐渐降至约 30mA。溴酚蓝前沿进入分离胶的时间约为 50min1h。待溴酚蓝前沿进入分离胶后，以 130V 稳压电泳至溴酚蓝前沿距胶的底端 1cm，停止电泳，电泳时间共 2h15min 左右。电泳后的检测：固定、染色、脱色的方法及溶液的配方与第一向等电聚焦电泳的相同。对第二向电泳凝胶上的斑点进行纵向和横向的测量，并记录数据，根据各斑点的相对分子质量，确定牛凝血酶的条带和等电点。http:/-6-4.实验结果和分析实验结果和分析 4.1 实验结果实验结果 4.1.1 胰蛋白酶等电点的测定（胰蛋白酶等电点的测定（pH39.5）等电聚焦电泳结果见附录图 3-1。因等电点标准中有些含量少的蛋白质在凝胶中显示的条带不清晰，不易确定各条带所代表的等电点，使得等电点标准蛋白测定法测定不够准确，故本实验采用浸泡法测定样品的等电点。根据表 2-1 绘制图 2-1，胰蛋白酶条带距阴极的距离为 0.60cm，从图 2-1 查得其等电点为 9.2。与等电点标准中胰蛋白酶原 pI=9.3 相差 0.1 个单位，说明等电聚焦方法已基本建立。表 2-1 浸泡法测定 pH 值（胰蛋白酶等电点的测定）凝胶块编号 1 2 3 4 5 6 7 固定前距阴极距离/cm0.250.751.251.752.252.753.25 校正后的距离 0.24 0.72 1.19 1.67 2.15 2.62 3.10 pH 值 8.818.728.608.408.027.827.46 凝胶块编号 8 9 10 11 12 13 14 固定前距阴极距离/cm3.754.254.755.255.756.256.75 校正后的距离/cm 3.58 4.05 4.53 5.01 5.48 5.96 6.44 pH 值 6.946.445.724.293.713.433.03 注：固定前凝胶长 6.5cm，脱色后凝胶长 6.2cm。切胶块时有误差，因此 6.5cm 长的胶条切了 14 块。图 2-1 测定胰蛋白酶 pI 的 pH 梯度曲线 4.1.2 牛凝血牛凝血酶等电点的初步测定（酶等电点的初步测定（pH57）因 pH310 的等电点标准蛋白中上只有四条带（pI=6.85,pI=6.55,pI=5.85,pI=5.20）在pH57 的范围内，用此法测定等电点过于粗略，而且不适用于牛凝血酶多条带等电点的测定，故本实验也只选用浸泡法测定等电点。经 pH 梯度为 39.5 等电聚焦的分析，虽然牛凝血酶出现了多个条带，但都位于 pH57 的范围中（等电聚焦电泳结果见附录图 3-2），于是选用 pH 梯度为 57 范围的凝胶测定其等电点。窄 pH 梯度比宽 pH 梯度等电聚焦分辨率高，所以牛凝血酶聚焦后条带也增加了，有 13 条之多。对这 13 个条带各自等电点的分析见表 2-3 和图 2-3。第一向 IEF 的分析：等电聚焦电泳结果见附表 3-3，根据表 2-2 绘制图 2-2。胰蛋白酶2.53.54.55.56.57.58.59.50.001.002.003.004.005.006.007.00距阴极距离/cmpH值http:/-7-表 2-2 浸泡法测定 pH 值（牛凝血酶等电点的测定）凝胶块编号 1 2 3 4 5 6 7 固定前距阴极距离/cm0.250.751.251.752.252.753.25 校正后的距离 0.28 0.84 1.39 1.95 2.51 3.06 3.62 pH 值 7.677.146.586.115.885.715.60 凝胶块编号 8 9 10 11 12 13 固定前距阴极距离/cm3.754.254.755.255.756.25校正后的距离/cm 4.18 4.74 5.29 5.85 6.41 6.96 pH 值 5.455.094.724.483.983.96注：固定前凝胶长 7.0cm，脱色后凝胶长 7.8cm。切胶块时有误差，因此 7.0cm 长的胶条切了 13 块。图 2-2 测定牛凝血酶 pI 的 pH 梯度曲线 表 2-3 各条带距阴极的距离和等电点 条带编号 1 2 3 4 5 6 7 阴极的距离/cm 1.301.501.703.003.104.004.10等电点 6.776.666.565.885.835.375.32条带是否清晰 是 是 是 否 否 是 是 条带编号 8 9 10 11 12 13 阴极的距离/cm 4.304.404.55 4.804.905.05等电点 5.215.165.09 4.964.904.83条带是否清晰 是 是 最清晰否 否 否 图 2-3 各条带在 pH 梯度曲线上的位置 3.544.555.566.577.580.001.002.003.004.005.006.007.00距阴极的距离/cmpH值3.544.555.566.577.580.001.002.003.004.005.006.007.00距阴极的距离/cmpH值http:/-8-第二向 SDS-PAGE 的分析：根据牛凝血酶的相对分子质量，在 SDS-PAGE 中确定牛凝血酶的斑点，再依据第一向的 IEF，来确定其等电点。双向电泳结果见附表图 3-4。低分子量蛋白在凝胶中只出现了两条带，但根据 Rf值是可以做出判断的。第一条带为31.0kDa（进口 Marker 为 30.0kDa），第二条带为 43.0kDa（进口 Marker 为 45.0kDa）。对凝胶中四个清晰斑点的分析见表 2-4，它们在 pH 梯度曲线中的位置见图 2-4，在 Mr-Rf曲线中的位置见图 2-5 和图 2-6。从图 2-5 和图 2-6 可以看出，不论是以国产的 Marker，还是以进口的 Marker 作为标准，所测得的分子量的标准是一样的。表 2-4 四个斑点的双向电泳比较 斑点编号 距阴极距离/cm等电点迁移距离/cmRf值Mr（kDa）1 3.80 5.50 2.5 0.8326.0 2 4.35 5.19 2.3 0.7732.0 3 4.35 5.19 2.6 0.8624.0 4 5.00 4.88 2.1 0.7038.0 注：溴酚蓝前沿为 3.0cm。图 2-4 四个斑点在 pH 梯度曲线中的位置 图 2-5 四个斑点在 Mr-Rf曲线中的位置（以国产 Marker 为标准）SDS-PAGE 显示，在距 IEF 阴极端 2.3cm 处，有一组条带，这是因为此位置恰好是第一向电泳 IEF 时点样的位置，是残留的样品造成的。在这组条带中也包括上面提到的四个斑点，说明这四斑点中一定存在牛凝血酶的成分。2,3413.544.555.566.577.5801234567距阴极的距离/cmpH值23410.020.040.060.080.0100.000.20.40.60.81RfMr（kDa）http:/-9-图 2-6 四个斑点在 Mr-Rf 曲线中的位置（以进口 Marker 为标准）四个斑点中，根据相对分子质量确定，编号为 2 的条带可能是牛凝血酶的 B 链（32kDa），由于其 A 链（5kDa）分子量低，在凝胶板上看不到。由此可以基本确定，牛凝血酶的等电点为 5.19。然而这个实验值与理论值相差较多（理论值参见附录），用于计算的牛凝血酶氨基酸序列有出入，可能是造成差距的主要原因之一。4.2 对实验结果和一些问题的进一步分析对实验结果和一些问题的进一步分析 4.2.1 凝胶脱色后与固定大小的变化：凝胶脱色后与固定大小的变化：用浸泡法测 pH 值时，若切胶迅速，浸泡后可能会变大，若切凝胶条的时间过长，会导致凝胶变干，浸泡后也不能恢复原状，甚至会比固定前还小。4.2.2 产生拓展的产生拓展的 pH 梯度的原因：梯度的原因：在 57pH 梯度测定牛凝血酶的等电点时，经浸泡法测定，实际形成的 pH 梯度（3.967.67）比两性电解质能形成的理论值（57）有所拓展。这可能与电极液的选择和电极条所浸湿电极液的多少有关，也与两性电解质的质量有密切关系，还与电泳过程有关，如聚焦时间不够长，电泳参数还有待进一步摸索等。4.2.3 对测定对测定 pH 梯度方法的评价：梯度方法的评价：在本实验中，用浸泡法比采用已知等电点标准蛋白测定法的可靠性要高。因为时间和条件所限，本实验中等电聚焦的电压不够高，而且时间也不够长，这都会影响等电点标准蛋白的迁移，会造成其接近等电点时就停止迁移的现象。如果直接用来测定等电点，势必会影响检测的准确度。而采用浸泡法和表面微电极测定法，会避免此问题，但 pH 计也存在误差，且间隔 5mm 的距离，精度略显不够。三种方法应互相补充，以得到较满意的测定值。4.2.4 对低分子量对低分子量 Marker 的讨论：的讨论：单独做 Marker 的 SDS-PAGE 时，有条带的丢失，仍可根据各条带的 Rf值判断其相对分子质量。在 T=7.5%的凝胶中有 5 条带，丢失 1 条，这可能是因为凝胶板过短分离效果不好，分子量最低的蛋白与溴酚蓝混合在一起，导致条带丢失，也可能与凝胶的浓度有关；T=12%的凝胶中有 3 条带，丢失 3 条，这可能是因为浓度大、孔径小，阻碍了大分子蛋白质的迁移。因此，适宜的 T 值可能应在 7.5 至 12 之间。做第二向电泳时分子量 Marker 只出现了 2 条带，可能与加样的方法有关，用纸片来加样的方法是否可行，还需要进一步的探讨。此外，在琼脂糖中加入的溴酚蓝浓度过大，也可能对条带的显示有所影响。4.2.5 牛凝血酶出现多条带的可能原因：牛凝血酶出现多条带的可能原因：酶制剂本身纯化得不好或者蛋白分子被解聚，或被氧化。在生物技术公司分装 sigma 的牛凝血酶或实验者操作时有污染。但这种可能性不大，因02040608010000.20.40.60.81RfMr（kDa）http:/-10-为每次电泳后都出现相同的条带。另外，在有的资料中，还有这样一种说法：有的蛋白质在采用一些方法纯化后，再做等电聚焦电泳，会出现很多条带。目前，对此现象的解释尚无定论。有专家认为，这与蛋白质的空间结构有关。此外，可能还与酶的不同程度的磷酸化作用、甲基化作用或乙酰化作用有关。4.2.6 解决酶不纯的其它方法：解决酶不纯的其它方法：除采用双向电泳的方法外，可以利用凝胶过滤、壳聚糖微珠作为载体的亲和层析等方法将牛凝血酶提纯后再做等电聚焦。另外，如果有牛凝血酶的单克隆抗体，还可以采用 Western Blotting 及相关的免疫检测方法来鉴定牛凝血酶的条带。此外，从聚丙烯酰胺凝胶的一向电泳（IEF 或 SDS-PAGE）中回收蛋白质斑点后，再做第二向电泳（SDS-PAGE 或 IEF）也是一种方法，而且与前两种相比，可能是最便于实行的方法，只是对蛋白质区带定位和回收的技术要求比较高。4.3 操作经验和注意事项：操作经验和注意事项：因 0.4mm 厚的薄层聚丙烯酰胺凝胶很薄，在灌制时即使是轻微的不平整，也会造成胶面不平齐，容易使电泳条带偏斜，而且在电泳的过程中容易变干。而 1mm 厚的凝胶的质量受灌胶影响很小，且电泳时不易干胶，又不影响分辨率，因此本实验中均采用 1mm 厚的聚丙烯酰胺凝胶做等电聚焦。实验证实，层析冷柜的冷却效果很好，且经过长时间的电泳后凝胶也不易干燥。电极条不要被过多的电极液所浸透，在电泳过程中若发现电极条变干，应及时滴加电极液。不论用于点样的纸片是放在阴极端还是阳极端，都应该距离阴极或阳极 1cm 以上。固定是为了去除载体两性电解质，浸泡过夜可更好地降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。http:/-11-参考文献参考文献 1 宋宏新,马永征,李敏康.凝血酶分离纯化方法的研究进展.食品研究与开发,2004、25(6):65-67.2 徐长法,王兰仙,刘德富,马晓岚.猪凝血酶的分离纯化与鉴定.北京联合大学学报,1994、8(1):44-49.3 王海亭,修朝阳,丁彩凤,王贵武,董宏伟.凝血酶的亲和层析纯化技术.青岛化工学院学报,2003、23(3):225-228.4 李敏康,周文静.猪血凝血酶的分离与纯化.陕西科技大学学报,2003,21(4):40-42.5 肖丽霞,史永昶,马中良,姜涌明.猪凝血酶的分离纯化及部分性质研究.江苏农业研究,1999、20(3):63-66.6 马中良,史永昶,姜涌明,李艳利,赵国俊.猪凝血酶的分离纯化和部分性质研究.江苏农学院学报,1998、19(4):8992.7 张宏,谭竹钧.壳聚糖微珠作为亲和层析载体的制备及其用于分离牛凝血酶的研究.内蒙古大学学报（自然科学版）,2003、34(1):37-41.8 郭尧君.薄层等电聚焦技术.生物物理学报,1988、4(4):389-391.9 郭尧君.蛋白质电泳实验技术.(第二版).科学出版社,2005:122-191.10 何忠效,张树政,郭尧君.等电聚焦.科学出版社,1985:69-113.11 王重庆,李云兰,李德昌等.高级生物化学实验教程.北京大学出版社,1994:54-60.12 陈雅蕙 等.生物化学实验原理和方法.北京大学出版社,2005:127-157,262-267.13 周先碗,胡晓倩.生物化学仪器分析与实验技术.化学工业出版社,2003:183-192.14 陆健.蛋白质纯化技术及应用.化学工业出版社,2005:184-194.15 汪家政,范明.蛋白质技术手册.科学出版社,2000:124-134.16 吴冠芸,潘华珍,吴翬.生物化学与分子生物学实验常用数据手册.科学出版社,1999:199.17 钱小红,贺福初.蛋白质组学:理论与方法.科学出版社,2003:72-79.18 夏其昌,曾嵘 等.蛋白质化学与蛋白质组学.科学出版社,2004:74-91.19 B.D.哈密斯,D.利克伍德 著.刘毓秀,程桂芳 译.科学出版社,1986:45-47.133-134,138-140.20 杨寿钧.聚丙烯酰胺凝胶薄层等电聚焦.微生物学通报,1982、(4):186-191.21 Righett P G.Isoelectric Focusing:Theory,Methodology and Applications.Elsevier Biomedical Press.1983:7-10,245-254.The Methodology of IEF and Primarily Identify the Isoelectric Point of Bovine Thrombin Chang Hao，Huang YaoJiang，Shen GuangTao College of Biological and Environmental Science,The Central University of Nationalities,Beijing（100081）Abstract As a new quick result partial astringent and implemental enzyme,thrombin is used in clinical and biological research quite widely.Bovine plasma is one of the important thrombin resources.pI sedimentation is the first and pivotal procedure when abstract bovine thrombin form plasma.After identify the isoelectric point of bovine thrombin,the preliminary manufacture of thrombin will be more rarefied.The purpose of the experiment is to establish the methodology and procedure of carrier amphlytes pH gradient isoelectrofocusing(IEF)electrophoresis according identify the isoelectric point(pI)of trypsin and apply the method biding SDS-PAGE to identify the isoelectric point of bovine thrombin.The result of 2D electrophoresis is that four spots whose molecular weight and isoelectric point can be identified emerged in the SDS-polyacrylamide gel clearly,and among them,a spot equivalent to chain B of bovine thrombin in molecular weight(32kDa)is the one we wanted.Therefore,the isoelectric point of bovine thrombin is 5.19.Keywords:Bovine Thrombin，Isoelectric Point，Isoelectric Focusing，SDS-PAGE 作者介绍作者介绍：黄耀江，博士，主要研究方向为生物化学与分子生物学。http:/-12-附附 录录 表 3-1 等电聚焦测定胰蛋白酶等电点的电泳过程及参数变化 操作 起始电压(V)起 始 电 流(mA)持续时间(h:min)结 束时 的电流(mA)聚焦总时间(h:min)预聚焦 60 11 0:33 4 0:33 点样升压 120 11 0:34 4 1:07 去加样纸并升压 250 6 0:27 3 1:34 升压 350 4 1:08 2 2:12 升压 450 2 0:48 0 3:00 升压 550 0 0:47 0 3:47 升压 650 0 1:00 0 4:47 升压 750 0 0:25 0 5:02 注：凝胶厚度为 1mm，大小为 6.5cm（长）4.4cm（宽）。表 3-2 等电聚焦测定牛凝血酶等电点的电泳过程及参数变化 操作 起始电压(V)起 始 电 流(mA)持续时间(h:min)结 束时 的电流(mA)聚焦总时间(h:min)预聚焦 80 11 0:30 3 0:30 点样升压 160 7 0:45 2 1:15 去加样纸并升压 260 2 0:45 1 2:00 升压 360 2 0:30 2 2:30 升压 460 2 0:30 2 3:00 升压 560 2 1:00 2 4:00 升压 660 2 1:10 1 5:10 升压 800 1 1:00 0 6:10 注：凝胶厚度为 1mm，大小为 7.0cm（长）5.5cm（宽）。表 3-3 Amersham Biosciences 等电点标准蛋白质的组成及等电点 蛋白质名称 等电点 胰蛋白酶原（Trypsinogen）9.30 扁豆外源凝集素碱性带（Lentil lectin-basic band）8.65 扁豆外源凝集素中性带（Lentil lectin-middle band）8.45 扁豆外源凝集素酸性带（Lentil lectin-acidic band）8.15 马肌红蛋白碱性带（Horse myoglobin-basic band）7.35 马肌红蛋白酸性带（Horse myoglobin-acidic band）6.85 人碳酸酐酶 B（Human carbonic anhydrase B）6.55 牛碳酸酐酶 B（Bovine carbonic anhydrase B）5.85-乳球蛋白 A（-Lactoglobulin A）5.20 胰蛋白酶抑制剂（Soybean trypsin inhibitor）4.55 淀粉糖苷酶（Amyloglucosidase）3.50 表 3-4 中科院上海生化所低分子量标准蛋白质的组成、Mr（kDa）及在本实验中的 Rf 蛋白质名称 Mr（kDa）Rf 兔磷酸化酶 B（Rabbit Phosphorylase B）97.4 0.23 牛血清白蛋白（Bovines Serum Albumin）66.2 0.34 兔肌动蛋白（Rabbit Actin）43.0 0.51 牛碳酸酐酶（Bovine Carbonic Anhydrase）31.0 0.75 胰蛋白酶抑制剂（Trypsin Inhibitor）20.1 0.98 鸡蛋清溶菌酶（Hen Egg White Lysozyme）14.4 条带丢失 注：溴酚蓝迁移距离为 4.1cm。表 3-5Amersham Biosciences 低分子量标准蛋白质的组成 Mr（kDa）