丝状真菌基因工程进展.pdf

氨基酸和生物资源2 0 0 9，3 1(1)：2 5 2 8A m n oA c i d s&B i o t i cR e s o u r c e s丝状真菌基因工程进展杨丰科，姜萍+，李思东，王守满(青岛科技大学化工学院山东青岛2 6 6 0 4 2)摘要：丝状真菌被广泛应用于生物工程来生产化学药品、药物制剂及酶。为了提高其生产能力，基因工程战略是一种较好的途径。为了使丝状真菌更好的用于工业生产，近年来出现许多新的转化技术。然而，由于缺乏有效的基因工程战略，许多真菌在生产新的、有商业价值的代谢产物上都存在着不足。在此总结了几种最新介导和控制基因表达的方法，并讨论了各自的优、缺点。此外，对丝状真菌今后的发展进行了展望。关键词：丝状真菌；基因工程；转化技术中图分类号：Q 7 8文献标识码：A文章编号：1 0 0 6 8 3 7 6(2 0 0 9)0 1 0 0 2 5 0 41简介丝状真菌能够在简单、廉价的培养基上生长。由于它们能生成有较好经济效益的代谢产物，所以日益受到人们的关注，迫切需要将它们开发成工业化的生产菌株。目前，丝状真菌作为细胞工厂已经用来生产一系列产品：从简单的有机酸到复杂的次级代谢产物。工业上由丝状真菌生产化合物的例子如表l 所示：表l工业上由丝状真菌生产的重要化合物由于丝状真菌有异常高的表达和分泌蛋白能力，使它们在生产酶上成为必不可少的菌株。目前，收稿日期：2 0 0 8 1 0 2 7作者简介：杨丰科，男(1 9 6 2 一)硕士，教授，专业制药工程+通讯作者基金来源：本实验受到山东省自然科学基金(Q 2 0 0 6 8 0 2)、兰州大学功能有机分子国家重点实验室开放基金(2 0 0 7 0 8)资助。天然或重组酶主要由黑曲霉素、木聚糖酶等生产，并且许多菌株目前正处于研究中。另外，丝状真菌具有惊人的产次级代谢产物能力，目前许多次级代谢产物已经实行工业化生产，成为重要的I 临床药物。如含有B 一内酰胺基团的抗生素，包括青霉素、头孢菌素是首先得益于丝状真菌分子技术进步的药物。对B 一内酰胺抗生素生物合成分子遗传学的进一步了解，有助于我们更合理地对其进行改进，并设计出新的生物合成工程化路径。此外，丝状真菌还能生产生物活性化合物如环胞素A(免疫抑制剂)、洛伐它丁(降胆固醇浓度制剂)、紫杉醇(抗癌剂)、灰黄霉素(抗真菌剂)等一系列对人类身体健康有益的化合物旧3J。尽管在此不能一一罗列所有工业上利用真菌生产的化合物，但也足以看出丝状真菌的代谢多样性及在生物技术上作为细胞工厂的重要性。将来，在分子水平上对生产菌株进行改进，将是真菌生物技术的一个重要里程碑。不管天然生产菌株还是重组的代谢生产菌株，基因工程和代谢工程法都是提高菌株生产能力的有力工具。然而，这一设想的实现必须建立在对丝状真菌的基因表达调控不断提高的基础E。2 基因工程转化的D N A 技术为了提高丝状真菌的生产能力及避免副产物的生成，基因工程可以说是一个非常有效的工具。然而，在实行工程化之前，将我们感兴趣的基因导人受体细胞这一操作比较困难。另外，对于许多真菌来说，很多因素影响同源染色体重组或非常规重组模式和频率。这些因素不仅包括宿主本身，还包括所使用的转化技术。因此，在设计一种工程战略之前，万方数据2 6 杨丰科等：丝状真菌基因工程进展必须找到适合的转化技术。自第一次成功地对酿酒酵母进行原生质体介导(P M T)转化以来川，用原生质体进行转化就被应用于若干其他的丝状真菌，但是转化频率不是很高n 引。为了提高丝状真菌的转化，在过去的几年中已研发出几种转化方法如电穿孔术、红外线放散转化、基囚枪介导转化法、土壤农杆菌噬菌体介导转化(A T M T)等。下面就将这些转化方法的主要优点和缺点简单讨论一下(如表2 所示)。表2 丝状真菌4 种常见基因转化方法然而对于有些真菌来说，这4 种技术并不是完全适用，有些真菌因为对不同方法存在抗性，所以有必要对它们进行优化【8J。但总体来讲，原生质体转化(A T M T)是应用最好的一种一J。如利用A T M T 转化技术，T D N A 的转化效率是传统方法的1 0 0 1 0 0 0 倍0 I。另外，D eG r o o t 等人用农杆菌介导法(P M T)转化构巢曲霉，与常规C a C l：P E G 原生质体法相比，转化效率提高了约6 0 0 倍。然而，也有报道表明，A T M T 在转化黑曲霉时并不成功，甚至都没产生转化子2 。所以，到目前为止，在预测某种转化方法是否可行时还没有一般规律。有意思的是，当用A T M T 法将D N A 导入泡盛曲霉、大斗菇、尖镰孢菌以及乳牛肝菌这些丝状真菌中时，大部分进行单克隆整合。然而，当换用农杆菌介导转化(P M T)法时，就会发现优先进行双克隆整合。由此可见，对于D N A 的转化，选用何种转化技术对设计代谢工程战略有相当大的影响。例如，当需要定向整合或使基因沉默时，A T M T 是很好的选择。相比之下，当多重副本基因在染色体组上随机插入时，最好选择P M T。报道表明，在黑曲霉和里氏木霉中利用上述战略，能够较好的提高蛋白质的产量m 15 l。除此之外还有一种新型的转化方法限制酶介导的整合(R E M I)。R E M I 是插人突变基础上的一种改进方法。在这一方法中，含有转化质粒单一识别位点的限制性酶被加到转化体系中。在丝状真菌中使用R E M I 方法，已经证明可以使转化频率和单拷贝整合事件明显提高，如在S a c c h a r o m s v e sc e r e v i s i a e 的转化体系中，使用R E M I 方法可以将转化率提高7 倍。他们指出：不同的限制性内切酶介导片段整合到酵母基因组中的能力是不同的，仅有几种限制酶可以提高转化频率m3。3 基因工程转化的的R N A 技术使代谢途径保持缄默并不仅限于D N A 技术，基于R N A 的技术同样可以做到。三种R N A 技术反义R N A、锤头(状)核酶、R N A 干扰是真核细胞中有效的使基因沉默的工具1 7。这些工具在下述情况下尤其有效：当基因定向方法失败；目的基因在染色体上以多拷贝的形式出现；等位基因能够弥补缺失基因。已有报道用反义酶致使丝状真菌中的基因沉默9|。当显示同源性的羧肽酶基因反义结构通过P M T 转入米根霉的基因组中时，这种反义结构以复拷贝的形式随机整合到宿主染色体上，从而导致了蛋白质活性降低了3 0。当更稳定、更高水平的人类溶菌酶检测出后，这种反义酶结构大大提高了米根霉作为宿主生产蛋白质的能力引。考虑到将特定基因完全删除会导致真菌的死亡，所以将反义酶稍微弱化再利用也是一条比较好的思路。催化性R N A 分子又称为R N A 构成酶，也能使基冈沉默。锤头(状)核酶是人们所熟知的最小的R N A 酶。对底物识别臂进行设计能使之与任何选定的R N A 互补，从而确保核酶与目标的结合。当底物R N A 接近N U X 三联体时，立刻发生断裂。(N 代表任何一个碱基，x 可以是A、U 或C)9。核万方数据氨基酸和生物资源2 7 酶的基因转录后沉默作用适用于细菌、酵母、植物以及哺乳动物系统J。最近，关于锤头状核酶控制丝状真菌基因表达的机理M u e l l e r 等已研究出。但是仍然存在一些限制条件。首先，由于G u s 表达基因被完全删除，所以在m R N A5 I X 域内的目标位点优先被识别。但是当核酶定位在3 区域时，目的基因的表达率下降到2 0 5 0。其次，通过电子定位预测的目标位点很难保证在生物体内被识别、剪切，所以难以用电子定位的方法预测体内实际的核酶结合位点2 1|。另外，干扰R N A 在转录后过程中也能导致基因沉默。R N A i 是在转录后水平上干扰基因表达，其实质是双链R N A 介导的特异性抑制与之同源基因的表达并产生相应的功能缺陷表型，也称为转录后基因沉默。具体过程为：在真菌宿主细胞中，与目的基因有同源子的双链R N A 开始表达，并通过2 1 2 5 b p 长的小片段R N A 干扰分子引发与它同源的R N A 降解旧。对R N A i 基因表达的特殊抑制十分适合某些丝状真菌如聚多曲霉、烟曲霉、米曲霉、稻平脐蠕孢、刺盘孢瓶状病毒、裂褶菌等。目前，用于丝状真菌R N A i 的载体已商品化。如I n v i t r o g e n 公司利用G a t e w a y 体外重组技术高通量克隆丝状真菌R N A i的靶标序列。此系统中，通过定点重组技术将靶标序列的P C R 扩增产物定点插入含有内含子的R N A i盒中2 3 1。4 重组基因的靶向性将基因定向插入强化转录的基因组位点能够提高目标蛋白转化率，由此可使某些代谢过程发挥极至。在酿酒酵母中，长约3 0 5 0 b p 的极小同源片段就能够保证高的同源苇组产率。除此，几百甚至几千个碱基对对于丝状真菌的同源再组是必不可少的m 。但是，由于同源重组的频率较低(通常在03 0)E Z 5 ，丝状真菌中的基因定向受到一定程度的影响，同时带有明显的物种依赖性，且重组极大依赖于定向基因位点的转录状态悼6 27|。所以，需要分析大量的转录子，以鉴定出正确的一个，这就必然耗费大量的时间，增加了人力、物力。克服这个缺点的一种方法是选用不含非同源末端的菌株。在真核生物中，将D N A 片段插入基因中是由双链断裂修复机制调控的过程。同源重组和非同源末端连接这两种主要的方式共同调控双链的断裂和修复瑚J。同源重组是同源序列间的反应，从而导致定向整合。非同源末端连接调节的D N A 链连接因为没有同源子，所以会发生随机整合。同源重组依赖于R a d 5 2 启动子，非同源末端连接依赖于k u蛋白二聚体及D N A 连接酶I V X r c c 4 聚合物。根据守门人模式，这两种方式相互竞争。当R a d 5 2 启动子末端与引入的D N A 结合时，就按着同源重组方式进行，反之，就按非同源末端连接方式进行。但是总体来说，除了酿酒酵母，在丝状真菌及其它的多细胞生物体中，非同源末端连接相比同源重组更具优势。最近研究表明，将丝状真菌中导致非同源末端连接的成分删除后可以有效的降低D N A 片段的随机组合率。例如，删除A n i g e r K u 7 0 同源子极大提高了同源组合率，与未处理的黑曲霉相比由原来的7 上升到8 0 多。同样，在其他真菌体系中，删除K u 7 0、K u 8 0、或“9 4 同系物的突变体有较高的同源重组率2 9 埘。5 结论与展望随着真菌的遗传学和生物学的发展，利用分子技术不断优化真菌菌株以适用于工业生产逐步引起人们的关注。虽然已经建立了一系列真菌转化方法，然而由于缺少基因工程战略，某些真菌进行商业化生产还存在不足。目前，随着人们对基因工程认识的提高，今后那些尚未进行过基因操作的真菌将逐步被开发，由此可生产许多新的生物产品。另外，全基因组转录、蛋白组学及代谢重建大大扩展了我们对丝状真菌细胞过程的认识。这样传统的仅仅用于处理个别基因或蛋白质的生物技术将扩展到整个细胞内组分，从而更好地理解它们之间的相互作用。这种系统学概念将大大改进工业发酵过程并提高丝状真菌在生物技术领域中的应用价值。参考文献 1 P u n tP J，v a nB i e z e nN，e t a l F i l a m e n t o u sf u n g ia sc e l lf a c t o r i e sf o rh e t e r o l o g o u sp r o t e i np r o d u c t i o n J T r e n d sB i o t e c h n o l，2 0 0 2，加：2 0 0 2 0 6 2 B r a k h a g eA A，C a r u s oM L B i o t e c h n i c a lg e n e t i c so fa n t i b i o t i cb i o s y n t h e s i s，G e n e t i c sa n dB i o t e c h n o l o g y，E s s e rK：T h eM y c o t aI I。2 0 0 4，3 1 7 3 5 3 3 L e a t h e r sT D B i o t e e h n o l o g i c a lp r o d u c t i o na n da p p l i c a t i o n so fp u l l u l a n J A p p lM i c r o b i o lB i o t e c h n o l2 0 0 3，6 2：4 6 8 4 7 3 4 H i n n e nA，H i c k sJ B，F i n kG R T r a n s f o r m a t i o no fy e a s t P r o cN a t lA c a dS c iUSA，1 9 7 8，7 5：1 9 2 9 1 9 3 3 5 F i n c h a mJ R T r a n s f o r m a t i o ni nf u n g i M i c r o b i o lR e v，1 9 8 9，5 3：1 4 8 1 7 0 6 R u i z D i e zB S t r a t e g i e sf o rt h et r a n s f o r m a t i o no fi l i a-万方数据2 8 杨丰科等：丝状真菌基因工程进展m e n t o u sf u n g i J A p p lM i c r o b i o l，2 0 0 2，9 2：1 8 9 1 9 5 7 M a c K e n z i eD A，J e e n e sD J，A r c h e rD B F i l a m e n t o u sf u n g ia se x p r e s s i o ns y s t e m sf u rh e t e r o l o g o u sp r o t e i n s G e n e t-i c sa n dB i o t e c h n o l o g y，E s s e rK：T h eM y c o t aI I，2 0 0 4，2 8 9 3 1 5 8 M e y e rV，M O i l e rD，S t r o w i gT，S t a h lU C o m p a r i s o no fd i f f e r e n tt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d sf u rA s p e r g i l l u sg i g a n t e u s J C u r tG e n e t2 0 0 3，4 3：3 7 1 3 7 7 9 M i c h i e l s eC B，H o o y k a a sP J，e t a l A g r o b a c t e r i u m m e d i a t-e dt r a n s f o r m a t i o na sat o o lf u rf u n c t i o n a lg e n o m i c si n f u n g i J C u r tG e n e t，2 0 0 5 b，4 8：l 1 7 1 0 王政逸，王秋华，等根癌土壤杆菌介导的丝状真菌转化菌物系统，2 0 0 3，2 2(2)：3 3 9 3 4 4 1 1 D eG r o o tM J A，B u n d o c kP，H o o y k a a sP J J A g r o b a c t e r i u mt u m e f e i e n s m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o no ff i l a m e n t o u sf u n g i J N a t u r eB i o t e c h n o l，1 9 9 8，1 6：8 3 9 8 4 2 1 2 M i c h i e l s eC B，H o o y k a a sP J，v a i ld e nH o n d e lC A，e t a l A g r o B a c t e r i u M m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 踮at o o lf u rf u n c t i o n a lg e n o m i c si nf u n s i J C u r tG e n e t，2 0 0 5 b，4 8：1 1 7 1 3 V e r d o e sJ C，P u n tP J，v a nd e nH a n d e lC A M o l e c u l a rg e n e t i cs t r a i ni m p r o v e m e n tf o rt h eo v e r p r o d u c t i o no ff u n-g a lp r o t e i n sb yf i l a m e n t o u sf u n g i J A p p lM i c r o b i o lB i o t e c h n 0 1 1 9 9 5，4 3：1 9 5 2 0 5 1 4 L e eD G，N i s h i m u r a M a s u d aI，N a k a m u r aA，H i d a k aM，M a s a k i H，U o z u m iT O v e r p r o d u c t i o no fa l p h a s h 一c o s i d a s ei nA s p e r g i l l u sn i g e rt r a n s f o r m e dw i t ht h ec l o n e dg e n ea s I A J JG e nA p p lM i c r o b i o l，1 9 9 8，4 4：1 7 7 1 8 1 1 5 A s k o l i nS，N a k a r i S e t a l aT，T e n k a n e nM O v e r p r o-d u c t i o n，p u r i f i c a t i o n，a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o ft h eT r i-c h o d e r m ar e e s e ih y d r o p h o b i nH F B I“J A p p lM i e r o b i o lB i o t e c h n o l，2 0 0 1，5 7：1 2 4 1 3 0 1 6 s c h i e s t lRH，P e t e ST D I n t e g r a t i o no fD N Af r a g m e n t sb y i l le g i t i m i t er e c o m b i n a t i o ni ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i-a e P r o cn a i lA c a sS c iU S A。1 9 9 1，8 8：7 5 8 5 7 5 8 9 1 7 M o i l e rD，S t a h lU R N A：ap o w e r f u lt o o lf u rr e c o m b i n a-t i o na n dr e g u l a t e de x p r e s s i o no fg e n e s I n：E s s e rK。e d-i t o r P r o g r e s si nB o t a n y，2 0 0 4，6 6：3 l 4 5 18 Z h e n gX F，K o b a y a s h iY，T a k e u c h iM C o n s t r u c t i o no fal o w-S e f i n ey p e c a r b o x y p e p t i d a s e-p r o d u c i n gm u t a n to fA s p e r g i l l u so r y z a eb yt h ee x p r e s s i o no fa n t i s e n s eR N Aa n di t su s ef i t 8ah o s tf o rh e t e r o l o g o u sp r o t e i ns e c r e t i o n J A p p lM i c r o b i o lB i o t e c h n o l，1 9 9 8，4 9：3 9 4 4 193S h i m a y a m aT，N i s h i k a w aS，T a i r aK G e n e r a l i t yo ft h eN U Xr u l e：k i n e t i ca n a l y s i so ft h er e s u l t so fs y s t e m a t i cm u t a t i o n si nt h et f i n u c l e o t i d ea tt h ec l e a v a g es i t eo fh a m m e r h e a dr i b o z y m e s J B i o c h e m i s t r y，1 9 9 5，3 4：3 6 4 9 3 4 5 4 2 0 B u s s i e r eF，L e d uS，G i r a r dM，e t a l D e v e l o p m e n t o fa ne f f i c i e n tc i s t r a n s c i sr i b o z y m ec a s s e t t et oi n a c t i v a t ep l a n tg e n e s“J P l a n tB i o t e c h n o l，2 0 0 3，1：4 2 3 4 3 5 2 1 M o i l e rD，S t a h lU，M e y e rV A p p l i c a t i o no fh a m m e r-h e a dr i b o z y m e si nf i l a m e n t o u sf u n g i J M i c r o b i o lM e t h o d s，2 0 0 6，6 5：5 8 5 5 9 5 2 2 N a k a y a s h i k iH，H a n a d aS，N g u y e nB Q，K a d o t a n iN，T o s aY，M a y a m aS R N As i l e n c i n gi l l sat o o lf o re x p l o r i n gg e n ef u n c t i o ni na s c o m y c e t ef u n s i“J F u n g a l G e n e tB i o l，2 0 0 5，4 2：2 7 5 2 8 3 2 3 曹月青，何正波，等丝状真菌基因功能研究的方法 J 水应用与环境生物学报，2 0 0 7，1 3(2)：2 8 4 2 8 8 2 4 H u aS B，Q i uM，C h a nE，e t a l M i n i m u ml e n g t ho fs e 一q u e n c eh o m o l o g yr e q u i r e df o ri nv i v oc l o n i n gb yh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni ny e a s t J P l a s m i d，1 9 9 7，3 8：9 19 6 2 5 A s c hD K，K i n s e yJ A R e l a t i o n s h i po fv e c t o ri n s e r ts i z et oh o m o l o g o u si n t e g r a t i o nd u r i n gt r a n s f o r m a t i o no fN e u r o s p o r ac r a s s aw i t ht h ec l o n e da m(G D H)g e n e J M o lG e nG e n e t，1 9 9 0，2 2 1：3 7 4 3 2 6 K w o n C h u n gK J，G o l d m a nW E，K l e i nB，e t a l F a t eo ft r a n s f o r m i n gD N Ai np a t h o g e n i cf u n g i J M e dM y c o l，1 9 9 8，3 6(1)：3 8 4 4 2 7 B i r dD，B r a d s h a wR G e n et a r g e t i n gi sl o c u sd e p e n d e n ti nt h ef i l a m e n t o u sf u n g u sA s p e r g i l l u sn i d u l a n s“J M o lG e nG e n e t，1 9 9 7，2 5 5：2 1 9 2 2 5 2 8 D u d a s o v aZ，D u d a sA，C h o v a n e cM N o n h o m o l o g o u se n d j o i n i n gf a c t o r so fS a 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c k i n go fe f f i c i e n tg e n ee n g i n e e r i n gs t r a t e g y，t h e r ei ss t i l lo b s t a c l e st op r o d u c en e wa n dc o m m e r c i a l l yi n t e r e s t i n gm e t a b o l i t e s T h i sr e v i e ws u m m a r i z e st h ev a r i e t yo fo p t i o n st h a th a v er e c e n t l yb e c o m ea v a i l a b l et oi n t r o d u c ea n dc o n t r o lg e n ee x p r e s s i o ni nf i l a m e n t o u sf u n g ia n dd i s c u s s e st h e i ra d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e s T h ed e v e l o p m e n to ft h er e s e r c ho n6 l a m e n t o u sf u n g ii nt h ef u t u r ei sa l s od i s c u s s e d K e yw o r d s：f i l a m e n t o u sf u n g i；g e n ee n g i n e e r i n g；t r a n s f o r m a t i o n万方数据