莪术醇可能通过Notch信号通路影响角质形成细胞的增殖、迁移、凋亡.pdf

东南大学学报(医学版)()():.:.():.(:)/.():.():./.():.常莉莎李丹刘会英等.远隔肢体缺血后适应对不同 和 分型脑梗死的影响.中国实用神经疾病杂志():.收稿日期 修回日期 基金项目 河北省保定市社会发展类项目()作者简介 梁博()女河北保定人副主任医师医学硕士:.引文格式 梁博李永辉孙继玮等.莪术醇可能通过 信号通路影响角质形成细胞的增殖、迁移、凋亡.东南大学学报(医学版)():.论著 莪术醇可能通过 信号通路影响角质形成细胞的增殖、迁移、凋亡梁博李永辉孙继玮许进(保定市第二医院 皮肤科河北 保定)摘要 目的:探讨莪术醇对角质形成细胞增殖、迁移、凋亡的作用及其相关的分子机制 方法:体外分离培养银屑病角质形成细胞使用浓度、莪术醇处理细胞 实验检测细胞增殖流式细胞术检测细胞凋亡蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白()、细胞淋巴瘤/白血病()、相关 蛋白()、蛋白表达水平 小室、伤口愈合实验检测细胞迁移 以 莪术醇作为对照将 莪术醇、信号通路抑制剂 加入 莪术醇处理的细胞内通过上述方法检测加入 通路抑制剂对银屑病角质形成细胞增殖、迁移和凋亡的影响 多组间比较通过单因素方差分析组内间比较使用 检验 结果:莪术醇呈剂量效应降低银屑病角质形成细胞活性、迁移率、迁移细胞数和 、蛋白表达增加凋亡率和、蛋白表达(.)与莪术醇组比较莪术醇 组细胞活性、迁移率、迁移细胞数和 、蛋白表达增加凋亡率和、蛋白表达水平降低差异有统计学意义(.)结论:莪术醇可能通过激活 信号通路抑制银屑病角质形成细胞的增殖、迁移并诱导细胞凋亡关键词 莪术醇 信号通路 角质形成细胞 增殖 迁移 凋亡中图分类号 文献标志码 文章编号():./.():.:()()/()().:(.).(.).:.银屑病是一种由 淋巴细胞介导引发的炎症性疾病与表皮角质形成细胞增殖、迁移、凋亡等有关银屑病临床常见症状为红色或粉色斑块、鳞层等病情反复发作在治疗上比较困难 近年研究显示中医治疗银屑病效果显著如甘草次酸对银屑病角质形成细胞有增殖抑制和凋亡促进的作用 莪术是姜科植物莪术、广西莪术等的根茎具有行气破血、消肿止痛的功效莪术醇是从莪术中提取的一种化合物具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等药理作用 有研究发现莪术醇提物乳膏可能通过降低白细胞介素()、干扰素()、肿瘤坏死因子()表达抑制银屑病损伤 信号通路是调节表皮细胞增殖、分化、迁移和凋亡的重要信号通路与银屑病发作有关当 信号激活时 受体胞内结构域()被释放并转移到细胞核诱导下游靶基因的激活包括 多毛增强子()和 相关转录因子()基因家族进而诱导角质形成细胞生长停滞 据报道黄岑苷可通过激活 信号通路抑制银屑病角质形成细胞增殖并促进凋亡 然而莪术醇对银屑病角质形成细胞增殖、迁移和凋亡的影响尚不清楚 鉴于此本研究通过体外分离银屑病角质形成细胞观察莪术醇是否通过调控 信号通路影响银屑病角质形成细胞的增殖、迁移、凋亡 材料与方法.细胞和试剂胎牛血清(杭州四季青生物公司)培养基(美国 公司)信号通路抑制剂(美国 公司)莪术醇(中国药品生物制品检定所)试剂盒(北 京 索 莱 宝 科 技 公 司)凋 亡 试 剂 盒东南大学学报(医学版)年 月()(上海贝博生物公司)细胞周期蛋白()抗体、细胞淋巴瘤/白血病(/)抗体、相关 蛋白(抗体)、抗体、抗体、甘油醛磷酸脱氢酶()抗体(货号、美 国 公司)、(货号、美 国 公 司)二 抗(北京中杉金桥公司)(美国 公司).方法.细胞分离、培养和鉴定 收集本院皮肤科银屑病患者的皮损组织其中正常皮肤组织取自本院骨科手术切除的皮肤(无银屑病史)并经过患者知情同意已经获得伦理委员会批准(年)伦审科第()号 按参考文献方法分离角质形成细胞将银屑病和正常皮肤组织剪碎加入.胰蛋白酶将组织消化 后再加入 胎牛血清终止消化过筛 离心 后加入特定 培养液免疫荧光染色鉴定角质形成细胞 将细胞悬液接种至盖玻片培养 加入 冷丙酮固定 置于 山羊血清中封闭 加入小鼠抗人角蛋白(/)抗体()孵育过夜 清洗 次每次 加入 标记的山羊抗小鼠()室温孵育 加入 清洗 次 每次 加入 染色 清洗 次封片 细胞培养在 、恒温培养箱内取第 代细胞进行实验.细胞分组 取第 代角质形成细胞调整密度 个接种 孔板中细胞融合度为 时加入浓度、的莪术醇干预细胞记为对照组、莪术醇组 以浓度为 莪术醇处理细胞记为莪术醇组将 信号通路抑制剂 和 莪术醇处理细胞记为莪术醇 组.法检测细胞增殖取各组角质形成细胞于 孔板中每组设 个复孔放入培养箱中 每组细胞培养孔内加入 试剂(浓度为 孔)后继续培养 采用酶标仪检测 波长处吸光度()重复检测 次以此评估各组细胞增殖活性.流式细胞术检测细胞凋亡收集各组角质形成细胞 漂洗 次离心后分离上清液将细胞重悬于结合缓冲液中分别加入 试剂、染液各 混匀后避光反应 上流式细胞仪检测细胞凋亡变化 实验设置 个复孔重复 次.蛋白质印迹实验检测蛋白表达收集各组细胞裂解液()提取总蛋白 法测定蛋白浓度将上样缓冲液煮沸变性 经 聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜封闭培养 加一抗 ()、()、()、()、()、()、()、()孵育过夜 缓冲液洗膜 次加入二抗()室温下孵育 将 滴在膜上显色 使用 软件分析蛋白密度值 实验设置 个复孔重复 次.小室、伤口愈合实验检测细胞迁移 小室:收集各组细胞培养 使用不含血清的培养基处理细胞并调整细胞密度为.个实验设置 个复孔分别于每孔的 上室、下室中添加 悬液、血清培养液处理细胞 甲醛固定侵入下室的细胞结晶紫染色最后倒置显微镜下观察细胞迁移数 伤口愈合实验:将各组细胞培养 使用无菌枪头沿培养板均匀划线将细胞使用不含血清培养基培养 然后拍照计算细胞迁移率重复 次.统计学处理采用 .软件进行统计分析实验结果以 表示多组间比较采用单因素方差分析组内间两两比较使用 检验 .为差异有统计学意义 结 果.免疫荧光染色鉴定角质形成细胞结果如图 所示原代分离、培养的角质形成细胞经免疫荧光染色鉴定抗角蛋白(/)阳性细胞为红色荧光选取符合实验要求的细胞进行下一步研究.不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞增殖的影响 与对照相比、莪术醇干预后细胞活性和 蛋白表达水平均降低差异有统计学意义(.)见图.不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞凋亡的影响 与对照相比、莪术醇干预后细胞凋亡率和、梁博等.莪术醇可能通过 信号通路影响角质形成细胞的增殖、迁移、凋亡.正常光镜下角质形成细胞形态.倒置荧光显微镜下角质形成细胞 染色结果 标记细胞核显示为蓝色荧光.倒置荧光显微镜下角质形成细胞/抗体染色结果/染色显示为红色荧光.和 的合并结果图 倒置荧光显微镜观察培养细胞角蛋白的表达(免疫荧光染色)()与对照组比较.细胞活性.蛋白质印迹实验结果.蛋白表达结果图 莪术醇对银屑病角质形成细胞增殖的影响 蛋白表达水平均增加 蛋白表达水平降低差异有统计学意义(.)见图.不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞迁移的影响 与对照相比、莪术醇干预后细东南大学学报(医学版)年 月()与对照组比较.细胞凋亡图.凋亡相关蛋白表达图 不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞凋亡的影响 胞迁移率降低迁移细胞数减少差异有统计学意义(.)见图、表.不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞 信号通路相关蛋白表达的影响 与对照相比、莪术醇干预后细胞 、蛋白表达水平均升高差异有统计学意义(莪术醇 组 莪术醇组()各组凋亡率及、蛋白表达水平比较对照组 莪术醇 组 莪术醇组(.)见图、表 梁博等.莪术醇可能通过 信号通路影响角质形成细胞的增殖、迁移、凋亡.划痕图.迁移图(结晶紫染色)图 不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞迁移的影响 表 不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞迁移的影响()()组 别样本量迁移率/迁移细胞数/个对照组.莪术醇组.莪术醇组.莪术醇组.值.值.与对照组比较.讨 论银屑病是一种免疫性皮肤疾病发病机制较为复杂受多种原因的影响包括遗传、环境和免疫等因素 近年的研究显示中药及其活性成分在银屑病的治疗中效果显著:例如紫草素可改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症反应白芍总苷可通过恢复机体 细胞免疫功能对治疗老年中重度斑块状银屑病患者疗效显著 莪术醇是中药莪术挥发油活性成分具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理活性据报道莪术醇可呈浓度依赖性抑制卵巢癌细胞增殖和转移并诱导细胞凋亡可能与抑制磷脂酰肌醇激酶()/丝氨酸苏氨酸激酶()信号通路有关 莪术醇能够抑制子宫内膜异位症大鼠炎症反应 另有研究显示莪术醇可通过抑制细胞外信号调节激酶()信号通路促进瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡并抑制细胞增殖和迁移 此外莪术醇可通过抑制信号转导及转录激活因子()信号通路抑制 诱导的人永生化角质形成细胞()增殖并促进细胞凋亡是治疗银屑病的潜在药物 本研究为了探究莪术醇对银屑病角质形成细胞的作用以银屑病角质形成细胞为研究对东南大学学报(医学版)年 月()图 不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞 信号通路相关蛋白表达的影响 表 不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞 信号通路相关蛋白表达的影响()()组 别样本量 对照组.莪术醇组.莪术醇组.莪术醇组.值.值.与对照组比较.象观察莪术醇对银屑病角质形成细胞增殖、迁移、凋亡的作用 本研究对比分析了不同浓度莪术醇对银屑病角质形成细胞的影响发现莪术醇处理后细胞活性、迁移率降低迁移细胞数减少凋亡率增加细胞凋亡相关蛋白的表达也发生明显改变并呈浓度依赖性提示莪术醇可抑制银屑病角质形成细胞的增殖和迁移诱导细胞凋亡 角质形成细胞过度增殖、迁移和凋亡受到信号通路或细胞因子的影响 有研究结果显示信号通路激活对抑制角质形成细胞增殖、迁移和促进凋亡有关 信号通路主要由受体、配体和 结合蛋白 组成 受体与配体结合后最后与 结合蛋白 形成转录复合体促进下游 基因激活 银屑病皮肤的特征是角质形成细胞过度增殖和异常分化 等观察到与正常表皮相比银屑病表皮中、和 表达减少这些 分子的减少可能导致角蛋白()和 的异常表达从而导致银屑病皮损中表皮的异常分化且 表达减少可通过诱导 基因表达导致角质形成细胞过度增殖 王建锋等发现黄芩苷可通过激活 信号通路降低银屑病角质形成细胞增殖活力并促进凋亡 本研究结果显示莪术醇可增加银屑病角质形成细胞中 、蛋白表达提示莪术醇可能调控 信号通路 将 信号通路抑制剂 加入 莪术醇处理银屑病角质形成细胞结果显示细胞活性、迁移率、迁移细胞数增加凋亡率及细胞凋亡相关蛋白表达发生变化说明莪术醇可能通过激活 信号通路影响银屑病角质形成细胞发展综上所述莪术醇可能通过激活 信号通路发挥抑制银屑病角质形成细胞增殖、迁移诱导细胞凋亡的作用参考文献 .:.():.:.()():.:.():.郑瑀心闵敏朱子羽等.甘草次酸对银屑病患者角质形成细胞增殖、凋亡及 表达的影响.中华皮肤科杂志():.聂添情孟祥伟应宇晨等.莪术醇及其衍生物的抗肿瘤活性研究进展.中草药():.李福长李晋奇.莪术醇提物乳膏防治银屑病及其作用机理研究.中药药理与临床():.():.梁博等.莪术醇可能通过 信号通路影响角质形成细胞的增殖、迁移、凋亡.细胞凋亡图.增殖、凋亡相关蛋白表达.划痕图.迁移图(结晶紫染色)图 莪术醇可能通过 信号通路调控银屑病角质形成细胞的增殖、凋亡、迁移 东南大学学报(医学版)年 月()表 莪术醇可能通过 信号通路调控银屑病角质形成细胞的增殖、凋亡、迁移()()组 别细胞活性/凋亡率/迁移率/迁移细胞数/个对照组.莪术醇组.莪术醇 组.值.值.与对照组比较.与莪术醇组比较.王建锋张虹亚刘涛峰等.黄芩苷通过激活 信号通路抑制银屑病角质形成细胞的活力.细胞与分子免疫学杂志():.梁男男常文娟张开明.银屑病皮损间充质干细胞对人角质形成细胞增殖及凋亡的影响.实用皮肤病学杂志():.():.():.郭译濛周明明郭晋荣等.紫草素通过 信号通路改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症反应.中国免疫学杂志():.吴先伟邓秀娥汪舰笛等.白芍总苷对老年中重度斑块状银屑病患者 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