多重耐药基因lsa（E）实时荧光定量PCR检测方法的创新.pdf

第 57 卷第 4 期河 南 农 业 大 学 学 报Vol.57No.42023 年8 月Journal of Henan Agricultural UniversityAug.2023收稿日期:2022-11-05基金项目:国家自然科学基金项目(U1704108);河南省高校科技创新团队支持计划项目(18IRTSTHN020);中国博士后科学基金项目(2021M690924)作者简介:张博(1998),男,河南郑州人,硕士研究生,主要从事畜禽源病原菌的耐药与防控研究。通信作者:许春燕(1988),女,河南驻马店人,讲师,博士,硕士生导师。引用:张博,陈峥,李琼,等.多重耐药基因 lsa(E)实时荧光定量 PCR 检测方法的创新J.河南农业大学学报,2023,57(4):639-645.DOI:10.16445/ki.1000-2340.20230515.001多重耐药基因 lsa(E)实时荧光定量PCR 检测方法的创新张博,陈峥,李琼,刘伟成,杜聪阳,杜向党,许春燕(河南农业大学动物医学院,河南 郑州 450046)摘要:【目的】创新多重耐药基因 lsa(E)实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的检测方法,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供参考。【方法】根据 GenBank 中 lsa(E)基因的参考序列设计特异性引物,通过纯化、连接和转化等步骤,提取含有 lsa(E)基因片段的重组质粒 DNA 为标准品进行检测,绘制标准曲线,验证其特异性和重复性,从而对多重耐药基因 lsa(E)qRT-PCR 检测方法进行创新;使用该检测方法对牛场粪便、土壤、淤泥和卧料等环境样品中 lsa(E)基因的拷贝数量和相对丰度进行检测。【结果】该多重耐药基因 lsa(E)qRT-PCR 检测方法熔解曲线均为平滑单峰,特异性强;扩增效率良好(101.56%);标准曲线呈现良好的线性关系(r20.997);检测拷贝数量范围广(1.711021.71108 copiesL-1)且灵敏度高,组内组间变异系数范围为0.45%1.66%,重复性强;使用该方法检测牛场环境样品,lsa(E)基因拷贝数量范围为 2.54104 1.52108 copiesL-1,相对丰度范围为 9.3910-41.20103,而普通 PCR 方法仅能在拷贝数量大于 1106 copiesL-1的环境样品中检测到 lsa(E)基因。【结论】本研究创新了多重耐药基因 lsa(E)的 qRT-PCR 检测方法,特异性强,灵敏度高,检测范围广,且能应用于不同养殖环境样品(粪便、土壤和淤泥等)中 lsa(E)基因的定量检测,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供技术支持和理论指导。关键词:lsa(E)基因;多重耐药;实时荧光定量 PCR;拷贝数量;相对丰度中图分类号:S852.61文献标志码:A文章编号:1000-2340(2023)04-0639-07Innovation of qRT-PCR assay for detection of multiple drug resistance gene lsa(E)ZHANG Bo,CHEN Zheng,LI Qiong,LIU Weicheng,DU Congyang,DU Xiangdang,XU Chunyan(College of Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,China)Abstract:【Objective】To provide a reference for monitoring the prevalence and spread of lsa(E)gene by innovating a real-time quantitative PCR(qRT-PCR)method for the detection of multi-drug resistance gene lsa(E).【Method】Specific primers were designed according to the reference sequence of the lsa(E)gene in GenBank.The recombinant plasmid DNA containing lsa(E)gene was extracted following purification,ligation and transformation and used as the standard substance for detection.The standard curve was drawn and its specificity and repeatability were verified to establish the innova-tive method of a qRT-PCR assay for multidrug-resistant gene lsa(E).Then,the method was applied to detect the copy numbers and relative abundance of lsa(E)gene in feces,soil,sludge and padding collected from cattle farms.【Result】The results showed that the melting curves of this method were 640 河南农业大学学报第 57 卷smooth and unimodal,and exhibited a strong specificity;the amplification efficiency was 101.56%;the value of r2 was 0.997,indicating a good linearity relationship of the standard curve;the detec-tion range(number of gene copies)of the assay for lsa(E)was wide with 1.71102 to 1.71108 copiesL-1 and its sensitivity was high,and both the variable coefficients of intra and inter batch re-peated tests were within 0.45%to 1.66%,with a good repeatability.For environmental samples from cattle farm,the copy number of the lsa(E)gene was from 2.54104 to 1.52108 copiesL-1 and the relative abundance was from 9.3910-4 to 1.2010-3 detected by qRT-PCR.However,the conven-tional PCR method could only detect lsa(E)in environment samples with more than 1106 copiesL-1 of the copy number of gene.【Conclusion】This study innovated a qRT-PCR assay for the detection of multidrug-resistant gene lsa(E)with high specificity,sensitivity,and wide range of application.The innovative method could be used in different environment samples(including feces,soil and sludge)collected from cattle farms,and provided a technical and theoretical guidance for monitoring the epi-demic and transmission of lsa(E)gene.Key words:lsa(E)gene;multidrug resistance;real-time quantitative PCR;copy number;relative abundance细菌耐药已成为全球公共卫生问题,严重威胁食品安全和公共健康1。多重耐药基因 lsa(E)属于能 够 编 码 ATP 结 合 盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白的基因,通过外排作用介导革兰氏阳性菌感染的代表药物(林可胺类、链阳菌素 A 类和截短侧耳素类)的抗性2。此外,lsa(E)基因还可介导阳性菌株对人类医学临床上重要的抗革兰氏阳性菌药物来法莫林(lefamulin)3和瑞他莫林(retapamulin)4的耐药性。多重耐药基因 lsa(E)由德国 STEFAN Schwarz 教授于 2012 年首次在欧洲人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-re-sistant staphylococcus aureus,MRSA)和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylo-coccus aureus,MSSA)中被检出并命名2。同年,LI等4在江苏和浙江猪场 MRSA 中检测到 lsa(E)基因,并证实该基因位于多重耐药基因簇中。随后,该基因又在多种细菌中被发现,包括粪肠球菌5、屎肠球菌5、表皮葡萄球菌6、无乳链球菌7和猪红斑丹毒丝菌8等。目前,lsa(E)基因相继在世界各地被 报 道,包 括 亚 洲、欧 洲、南 美 洲 和 北 美 洲等2,7,9-12。此外,lsa(E)基因可以通过质粒在不同细菌之间传播4-6,这加速了其散播的速率和广度,对畜禽养殖业和人类健康带来威胁。在耐药基因的相关研究中,普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法或多重 PCR 检测方法只能对其进行定性检测,检测对象限定为纯培养菌株的基因组,并在检测之后还需要 进 行 测 序 验 证。谷 立 慧 等13使 用 普 通PCR 方法与测序技术相结合对猪源金黄色葡萄球菌 lsa(E)基因的流行情况进行调查,需要先使用 PCR 对纯培养物进行扩增,然后对扩增产物进行测序验证。随着耐药基因和耐药菌株作为新型污染物概念的出现,实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和宏基因组学等非培养的检测方法已被用于表征各种环境介质中耐药 基 因 的 污 染 水 平。然 而,宏 基 因 组 成 本高,仍未被广泛应用。而荧光定量 PCR 敏感 性高14,特异性和重复性好15,成本低廉,可以被广泛应用于微生物诊断检测的研究中。目前,常见的检 测 方 法 并 不 能 满 足 畜 禽 养 殖 环 境 中 lsa(E)基因 定量 检 测 的 需 求,而 关 于 lsa(E)基 因qRT-PCR 检测方法尚未报道。基于此,本研究创新了 lsa(E)基因的 qRT-PCR 检测方法,并使用该方法检测牛养殖环境中 lsa(E)基因的拷贝数量和相对丰度,为畜禽养殖环境中 lsa(E)基因的快速精准检测提供了理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1材料河南农业大学病原菌耐药与新兽药创制实验室分离保存的 1 株携带 lsa(E)基因的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)a90 为阳性对照菌株,以其基因组作为阳性对照模板。2021 年 9 月在河南省中牟县 2 个牛养殖场采集牛场粪便(NNF1NNF3,RCF1RCF3,NBF1 NBF3,RDF1 RDF3)、卧料(NNW1 NNW3,NBW1 NBW3)、土壤(RDT1 RDT3)和淤泥(RDY1 RDY3)共 24 份环境样品。1.1.2主要试剂 细菌基因组 DNA 提取试剂盒,天第 4 期张博,等:多重耐药基因 lsa(E)实时荧光定量 PCR 检测方法的创新641 根生化科技有限公司;HiPure Soil DNA Mini Kit,广州美基生物科技有限公司;QIAGEN Plasmid Mini Kit,德 国 QIAGEN 公 司;PowerUPTM SYBRTM Green Master Mix(2),北京赛默飞世尔科技(中国)有限公司;胶回收纯化试剂盒,北京天根生化科技有限公司;One step ZTOPO-Blunt/TA 零背景快速克隆试剂盒,北京庄盟国际生物基因科技有限公司;DH5 感受态细胞,北京天根生化科技有限公司。1.1.3主要仪器qRT-PCR 仪(CFX96),美国Bio-Rad 公司;PCR 仪(T100 Thermal Cycler),美国Bio-Rad 公司;凝胶成像系统(Tanon 1600),上海天能科技有限公司;电泳仪(HE-120),上海天能科技有限 公 司;超 微 量 分 光 光 度 计(NanoDrop ND-2000),美 国 Thermo 公 司;荧 光 定 量 仪(Qubit 4.0),美国 Thermo 公司。1.2试验方法1.2.1引物的设计与合成通过 NCBI 查找并下载 lsa(E)基因的参考序列,用软件 Oligo7 进行 qRT-PCR 特异性引物设计,lsa(E)基因 qRT-PCR 引物(基因序列号 67412470)F:ACCAAAATAAACCCCTTCTT-GCGTT,R:CCTGCTTATTGATGAACCTACAAACCA,片段长度为 93 bp;T 载体引物(M13 引物),F:TGTA-AAACGACGGCCAGT,R:CAGGAAACAGCTATGACC,片段长度为 237 bp;lsa(E)基因普通 PCR 引物16:F:TGTCAAATGGTGAGCAAACG,R:TGTAAAACGGCT-TCCTGATG,片段长度为 496 bp;16S rRNA 基因引物参考已发表文献17进行合成,F:CGGTGAATACGT-TCTCGG,R:GGATACCTTGTTACGACTT,片段长度为143 bp。1.2.2阳性标准质粒的制备将保存的 lsa(E)基因阳性肠球菌 a90 扩大培养,参照 DNA 提取试剂盒说明书提取 DNA,以其为模板进行 PCR 扩增lsa(E)基因,反应体系为:模板 2 L,上、下游引物各 1 L,Premix Ex taq DNA 聚合酶 10 L,ddH2O 6 L,总体积为 20 L。反应程序为:94 预变性 5 min;94 30 s,58 30 s,72 15 s,进行 30 个循环;72 延伸 10 min;4 保存备用。通过常规方法,将目的片段 lsa(E)基因与 T载体连接,构建重组质粒。测序验证之后将重组质粒电转化入大肠杆菌 DH5 中,提取质粒后使用Qubit 4.0 荧光定量仪检测质粒 DNA 质量浓度,NanoDrop ND-2000 超微量分光光度计确定 质粒DNA 纯度,-20 保存备用。1.2.3lsa(E)基因 qRT-PCR 方法设计使用 Qu-bit 4.0 对重组质粒定量后,根据下式计算质粒拷贝数量18。将重组质粒质量浓度稀释至 30 40 mgL-1,之后进行 10 倍的倍比稀释,获得重组质粒的 10 个稀释点,即 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10;每 个 点 设 置 3 个 平行19,另设超纯水(ddH2O)组作为阴性对照,按照式(1)计算拷贝数量。CN=(LC)/(NM109)(1)式中:CN 为拷贝数量/(CopiesL-1);L 为阿伏伽德罗常数/(6.021023 mol-1);C 为重组质粒质量浓度,36.8 mgL-1;N 为重组质粒的总长度,1 958 bp;M 为每对碱基的平均摩尔质量,660 gmol-1。反应体系为:SYBRTM Green Master Mix(2)10 L,lsa(E)基因的上、下游引物各 0.8 L,ddH2O 6.4 L,DNA 模板 2 L。反应程序如下:(50 ,2 min)+(95 ,3 min)+(95 ,30 s+58 ,30 s+72 ,10 s)40;熔解曲线的反应条件是(95 ,30 s)+(60 ,30 s)+(72 ,30 s)。反应后整理相关数据,以标准品拷贝数量的对数值为横坐标,qRT-PCR 得到的 Ct 值为纵坐标,绘制 lsa(E)基因的标准曲线。1.2.4qRT-PCR 方法的重复性试验qRT-PCR反应选择同一批 3 个不同质量浓度的标准品进行批内重复试验;用不同批次的 3 个质量浓度的标准品为模板,在不同时间内进行批间重复试验,运用变异系数数值,即标准差与平均值的比值,计算批内批间变异系数。1.2.5牛场环境样品中 lsa(E)基因拷贝数量和相对丰度的检测 使用 HiPure Soil DNA Mini Kit 试剂盒对 24 份环境样品的宏基因组进行提取。以提取的宏基因组为模板,使用 1.2.1 中 lsa(E)基因和 16S rRNA基因的 qRT-PCR 引物,按照 1.2.3 的反应体系和反应程序检测 lsa(E)基因和 16S rRNA 拷贝数量,并计算lsa(E)基因的相对丰度。相对丰度=lsa(E)基因拷贝数量/16S rRNA 拷贝数量。1.2.6普通 PCR 对牛场环境样品中 lsa(E)基因的检测 以 1.2.5 中提取牛场环境样品的宏基因组为模板,使用 1.2.1 中 lsa(E)基因普通 PCR 引物,对1.2.5 中 24 份环境样本中 lsa(E)基因进行检测。1.2.7数据统计与分析 试验数据采用 Excel 2019进行数据处理和相关分析,用平均值标准差表示。2结果与分析2.1lsa(E)基因的 PCR 扩增使用 1.2.1 中 lsa(E)基因引物进行 PCR 扩增。如图 1 所示,阳性孔中只有 1 条明亮的条带,642 河南农业大学学报第 57 卷无杂带,条带大小与设计大小一致,为 93 bp,阴性对照未出现条带,说明本试验设计的引物特异性良好,无引物二聚体出现。1.2 000 bp DNA maker;2.lsa(E)基因片段;3.阴性对照。1.2 000 bp DNA maker;2.lsa(E)gene segment;3.Negative control.图 1lsa(E)基因片段扩增Fig.1Amplification of lsa(E)gene fragment2.2lsa(E)基因的克隆和重组质粒的制备利用 1.2.2 中 lsa(E)基因引物和 M13 引物对挑取的转化子进行 PCR 验证,确定重组质粒是否构建和转化成功。结果如图 2 所示,在电转化子中,lsa(E)基因扩增的片段长度为 93 bp,引物 M13扩增的片段长度为 237 bp,说明 lsa(E)基因片段与 T 载体连接成功并转化入大肠杆菌 DH5。利用紫外分光光度计检测该重组质粒的质量浓度,结果为 36.8 mgL-1。该质粒作为阳性标准品,根据1.2.3 中 的 公 式 计 算 其 拷 贝 数 量,计 算 结 果 为1.711010 copiesL-1。1.2 000 bp DNA maker;2.lsa(E)基因片段;3.质粒引物 M13 扩增验证;4.阴性对照。1.2 000 bp DNA maker;2.lsa(E)gene segment;3.Verification of amplifying plasmid primer M13;4.Negative control。图 2lsa(E)基因阳性转化子验证Fig.2Verification of lsa(E)gene positive transformant2.3lsa(E)基因 qRT-PCR 标准曲线,扩增曲线和熔解曲线结果将构建的重组质粒以 10 倍梯度稀释之后,进行 qRT-PCR,并扩增 lsa(E)基因,得到标准曲线(图 3-A)、扩增曲线(图 3-B)和熔解曲线(图 3-C)。综合性分析可知,标准曲线的拷贝数量和 Ct值呈现线性反比关系。根据数据计算 lsa(E)基因回归方程,结果为 y=-3.285 2x+42.137,且 R2为0.997,表明标准品在此范围内线性关系好,lsa(E)基因的检测拷贝数量范围是 1.71102 1.71108 copies L-1,Ct 值的范围是 15.22 34.27。lsa(E)基因标准曲线的扩增效率为 101.56%,处于90%110%,符合要求。扩增曲线平滑,不同质量浓度标准品的扩增曲线平行分布,熔解曲线呈单峰,表明本试验设计的引物特异性强,无非特异性扩增和引物二聚体的存在。因此,该检测方法良好,能够用于后续环境样品中 lsa(E)基因拷贝数量的检测。A.标准曲线;B.扩增曲线;C.熔解曲线。A.Standard curve;B.Amplification curves;C.Melting curves.图 3lsa(E)基因 qRT-PCR 检测方法的标准曲线、扩增曲线和熔解曲线Fig.3Standard curve,amplification curves and melting curves of qRT-PCR assay for lsa(E)gene第 4 期张博,等:多重耐药基因 lsa(E)实时荧光定量 PCR 检测方法的创新643 2.4qRT-PCR 方法的重复性试验测试结果以质粒拷贝数量 1.71103 1.71105 copiesL-1的标准品作为模板,用本试验创新的 qRT-PCR 方法进行组内、组间重复性测试,利用所得 Ct值计算变异系数。如表 1 所示,组内变异系数为0.45%1.20%,小 于 1.50%,组 间 变 异 系 数 为1.14%1.66%,小于 2.0%,表明该方法重复性和稳定性较好。表 1qRT-PCR 重复性试验结果Table 1Fluorescence real-time quantitative PCR repeatability test results质粒拷贝数量/(copiesL-1)Copies of standard plasmid组内重复性试验Repeatability of intra-batch assay平均数标准差MeanSD变异系数/%CV组间重复性试验Repeatability of inter-batch assay平均数标准差MeanSD变异系数/%CV 1.7110428.350.331.2028.370.321.141.7110525.040.110.4524.890.331.321.7110621.030.200.9721.330.351.662.5牛场环境样品中 lsa(E)基因拷贝数量和相对丰度检测结果运用本试验创新的 qRT-PCR 方法对采集的24 份牛场环境样品进行检测。如表 2 所示,牛场环境样品中 lsa(E)基因拷贝数量的范围为 2.541041.52108 copiesL-1,相对丰度范围为 9.3910-41.20103,说明本方法适用性广。使用普通PCR 方法检测牛场环境样品中的 lsa(E)基因的存在情况,仅能定性地在 NNF1、RCF2、RCF3、NBF2、RDT1、RDT2、RDT3 和 RDY1 8 份环境样品中检出,且 8 份样本中 lsa(E)基因拷贝数量均大于 1106 copiesL-1。表 2环境样品中 lsa(E)基因拷贝数量、相对丰度和 lsa(E)基因检出情况Table 2lsa(E)gene of copies number,relative abundance and detection in environmental samples样品编号Sample number样品类型Sample typelsa(E)基因拷贝数量/(copiesL-1)lsa(E)gene copy number16S rRNA基因拷贝数量/(copiesL-1)16S rRNA gene copy numberlsa(E)基因相对丰度Relative abundance of lsa(E)genelsa(E)基因普通 PCR 检测Result of lsa(E)gene detected by PCRNNF1粪便4.451064.511089.8710-3+NNF2粪便2.051068.521082.4010-3-NNF3粪便9.861051.051099.3910-4-RCF1粪便7.861074.791081.6410-1-RCF2粪便1.141084.111072.77100+RCF3粪便1.521082.901075.24100+NBF1粪便1.631061.401081.1610-2-NBF2粪便1.531077.701081.9910-2+NBF3粪便6.391057.481088.5410-4-RDF1粪便5.351055.331061.0010-1-RDF2粪便2.541041.521061.6710-2-RDF3粪便3.601066.011065.9910-1-NNW1卧料8.021051.491075.3710-2-NNW2卧料1.721053.101065.5410-2-NNW3卧料8.211052.201073.7310-2-NBW1卧料2.551056.081064.1910-2-NBW2卧料1.931055.991053.2210-1-NBW3卧料2.591053.421067.5710-2-RDT1土壤1.121081.731076.47100+RDT2土壤1.191089.941041.20103+RDT3土壤9.961071.411077.06100+RDY1淤泥7.191067.201089.9910-3+RDY2淤泥7.351051.861073.9510-2-RDY3淤泥5.761051.941082.9710-3-注:“+”表示通过普通 PCR 检测出 lsa(E)基因,“-”表示通过普通 PCR 未检测出 lsa(E)基因。Note:“+”means lsa(E)gene is detected by ordinary PCR,“-”means lsa(E)gene is not detected by ordinary PCR.644 河南农业大学学报第 57 卷3结论和讨论lsa(E)基因不仅位于细菌染色体基因组上,而且也能被质粒携带,同时 lsa(E)基因通常与其他耐药基因组合在一起形成不同类型的耐药基因簇。此外,lsa(E)基因在不同来源(人、动物和环境)的细菌中均有报道,且在多个国家广泛分布。同时,lsa(E)基因的广泛存在影响林可胺类、链阳菌素 A类和截短侧耳素类等抗生素的治疗效果,对公共卫生安全造成威胁。目前,关于 lsa(E)基因在畜禽养殖环境中的存在情况尚不清晰。针对环境中耐药基 因的研究方 法主要有细 菌分离培养 技术、qRT-PCR 检测技术以及宏基因组学方法,但是养殖环境中绝大多数细菌为不可培养菌,极少量可分离培养的细菌不利于对养殖环境中耐药基因流行分布情况进行全面评价,同时宏基因组学的经济和技术成本都较高。因此,本研究通过创新 lsa(E)基因 qRT-PCR 检测方法,使后续细菌基因组及养殖环境中该基因的检测和分析更加有效。qRT-PCR 检测方法不同于普通 PCR,通过向反应体系中加入 SYBR 荧光基团,只有嵌入在双链DNA 小沟的空隙中的荧光基团才能被激发出荧光,因此反应过程中目的基因和荧光强度的增加是对应的。对反应过程中的荧光强度进行监测,不仅能够明确目的基因在反应过程中的数量变化,而且还可以推断模板中目的基因的数量。与普通 PCR相比,qRT-PCR 具有便捷、快速、准确的优势,该技术目前应用广泛,尤其是在病原微生物的诊断、基因拷贝数量和表达量检测等方面14-15,20。本研究通过创新 lsa(E)基因 qRT-PCR 的检测方法,不仅能够检测纯化培养的细菌基因组中的lsa(E)基因,而且也可检测土壤、粪便等环境样本中 lsa(E)基因的拷贝数量和相对丰度。本研究表明,该检测方法熔解曲线均为平滑单峰,特异性强;扩增效率良好 101.56%;标准曲线呈现良好的线性关系(r20.997);检测拷贝数量范围广(1.711021.71108 copiesL-1)且灵敏度高。同时,该检测方法的标准曲线 r2值与其他研究中耐药基因(blaKPC、blaNDM和 blaOXA-48)qRT-PCR 检测方法的标准曲线的 r2值(0.995 0.997)相当21,但高于耐药基因(optrA、cfr 和 poxtA)qRT-PCR 检测方法 的 标 准 曲 线 的r2值(0.992、0.994 和0.995)19,且相邻稀释梯度的扩增曲线在增长的对数期间隔也基本一致。该检测方法的检测范围与 BONTRON 等22报道的 mcr-1 的标准曲线所适用的检测范围相比,范围更广,说明本试验设计的qRT-PCR 引物和程序条件均较好。此外,使用该检测方法对牛场采集的 24 份环境样本中 lsa(E)基因的拷贝数量和相对丰度进行测定,结果显示lsa(E)基因拷贝数量的范围为 2.54104 1.52108 copiesL-1,相对丰度的范围为 9.3910-41.20103,其中土壤样品 RDT2 中 lsa(E)基因的相对丰度最高,为 1.20103。使用普通 PCR 方法检测这些样品中 lsa(E)基因,仅能在 lsa(E)基因拷贝数量大于 1106 copiesL-1的样品中定性地检测到,而采用 qRT-PCR 检测方法灵敏度达到了100 copiesL-1,且普通 PCR 检测方法还需要与测序技术相结合,费时费力。本研究创新了多重耐药基因 lsa(E)的 qRT-PCR 检测方法,特异性强,灵敏度高,检测范围广,且能定量检测于不同养殖环境样品(粪便、土壤、淤泥等)中 lsa(E)基因,为 lsa(E)基因流行和传播的监测提供技术支持。参考文献 References:1MENDES R E,DESHPANDE L,RODRIGUEZ-NORIEGA E,et al.First report of Staphylococcal clinical isolates in Mexico with linezolid resistance caused by cfr:evidence of in vivo cfr mobilizationJ.Journal of Clinical Microbiolo-gy,2010,48(8):3041-3043.2WENDLANDT S,LOZANO C,KADLEC K,et al.The enterococcal ABC transporter gene lsa(E)confers com-bined resistance to lincosamides,pleuromutilins and streptogramin a antibiotics in methicillin-susceptible and methicillin-resistant Staphylococcus aureus J.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2013,68(2):473-475.3MENDES R E,PAUKNER S,DOYLE T B,et al.Low prevalence of gram-positive isolates showing elevated le-famulin MIC results during the SENTRY surveillance pro-gram for 2015-2016 and characterization of resistancemecha-nismsJ.Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2019,63(4):2118-2158.4LI B B,WENDLANDT S,YAO J N,et al.Detection and new genetic environment of the pleuromutilin-linco-samide-streptogramin a resistance gene lsa(E)in methi-cillin-resistant Staphylococcus aureus of swine originJ.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2013,68(6):1251-1255.5LI X S,DONG W C,WANG X M,et al.Presence and genetic environment of pleuromutilin-lincosamide-strep-togramin A resistance gene lsa(E)in enterococci of hu-man and swine origin J.Journal of Antimicrobial 第 4 期张博,等:多重耐药基因 lsa(E)实时荧光定量 PCR 检测方法的创新645 Chemotherapy,2014,69(5):1424-1426.6DENG F R,WANG H W,LIAO Y F,et al.Detection and genetic environment of pleuromutilin-lincosamide-streptogramin a resistance genes in staphylococci isola-ted from petsJ.Frontiers in Microbiology,2017,8:234-240.7DOUARRE P E,SAUVAGE E,POYART C,et al.Host specificity in the diversity and transfer of lsa resistance genes in group B StreptococcusJ.The Journal of Antimi-crobial Chemotherapy,2015,70(12):3205-3213.8ZHANG A Y,XU C W,WANG H N,et al.Presence and new genetic environment of pleuromutilin-linco-samide-streptogramin a resistance gene lsa(E)in Erysipelothrix rhusiopathiae of swine originJ.Veteri-nary Microbiology,2015,177(1/2):162-167.9SINGH K V,MURRAY B E.Differences in the Entero-coccus faecalis lsa locus that influence susceptibility to quinupristin-dalfopristin and clindamycin J.Antimi-crobial Agents and Chemotherapy,2005,49(1):32-39.10