AQP4在大鼠脑缺血再灌注损伤过程中作用机制_石向群.pdf

脑与神经疾病杂志年第卷第期在大鼠脑缺血再灌注损伤过程 中作用机制石向群杨金升王运良包仕尧摘要目的 探讨在大 鼠脑缺血再灌注损伤过 程中对脑损伤、脑水肿形成等的影响以及作用 机制。方法采用大 鼠复制脑局 限性缺血再灌注模型,应 用免疫组 织化 学 方 法 检 测脑内蛋 白,记 录大 鼠神经功 能 缺损 程度、血脑 屏障通透性、脑水肿 程度 的动态 变化。结果脑局限性缺血再灌注损 伤后脑内蛋白水平迅速降低,至再灌注后一小时达最低 水平,至再灌注天 时恢 复到正常水平。脑水肿程 度峰值出现 在再灌注损伤第一小时、蓝最大通 透率出现在再灌注损伤第一小时。神经功能缺损最重的时间点出现在再灌注损伤的第小时。分析再灌注小时伤侧半球与 同时间点的神经功能缺损评分的相关性,结果显 示水平与神经功能缺损评分呈 负相关性一 一,尸一。结论脑缺血再灌注损伤过 程中水平 的迅速下降,是机体对脑损伤所作出的一种保护性反应,具有阻止血脑屏障破坏、减轻血管源性脑水肿和细胞源性脑水肿 的效 应。调节缺血后 脑内的功能和表达水平可望成为新 的治疗脑缺血再灌注损伤的靶点。关键词水通道蛋 白缺血再灌注脑水肿中图分 类号文献标识码文章编 号一一一,丫一,一夕,一、,一,一一一,一一一一,一一即一一一,一一脑水肿一直是神经 科 学研 究 的热 点 之 一,本研究目的在于采用免疫组织化学方法观察大 鼠脑缺血再灌注损伤过程 中脑 内水通道蛋 白水平 的变化,探讨其水平 的变化 与脑水肿 的相关性及脑卒 中后脑水肿形成机制,为临床治疗、研究提供有益 的线索。材 料 与 方法作者单位兰州军区兰州 总医院神经内科石向群,杨金升苏州大学 附属第二医院 神经内科王 运良、包仁尧一、实验动物 及分组选用健康成 年一雄性 大 鼠,体重一克。大 鼠分 为正常组、缺血小时再灌注、小 时和天组,共个组,每组实验动物只。二、大 鼠脑缺血再灌注损伤模型制作和成 功标 志模型制作参照“二方法,线栓法复制大 鼠大脑 中动脉缺血再灌注损伤模型。模型成功脑与神经 疾病杂志。洲年第卷第期标志 大 鼠于缺血小 时开始再灌注后并麻醉清醒,出现神经功能缺损,其评 分与术前评分相 差分以上者。未达 到上述标准者视 为模型制作失败,不计人实验组。因麻醉未醒和经解剖发现存在脑蛛 网膜下腔 出血均视为模型制作失败不计人实验组。三、研究指标及检测方法生命体征的监测经 股 动 脉 插 管 监 测 动 脉 血压、血气分析,在大脑 中动 脉 闭塞前、及再 灌注 开始各监测一 次,血压持续 监测。肛表持续监测直肠温度,手术缺血麻醉期 间通过瓦的灯 泡加热 维持体温在正常范 围士之 内。缺血再灌注损伤脑 内水 平应用兔抗大 鼠单 克 隆抗 体 进 行 免 疫 组 织 化学 检 测 大 鼠脑缺血再灌注损伤后脑 内水平的变化,为了便于定量分析、减少操 作 误差,将显 色 时 间统一限定为。免疫组织化 学 半 定 量分析免 疫 组织化学 检测法时,每批 次各选 取每组一只大 鼠张切片,进行相同条件下的染色,每只大 鼠共染色张切片批次,取 均值作为该 大 鼠的定量值进 行统计 学分析,以减少由于人工操作和试 剂批 次不 同所带来的误差。参照方 法,依据 染 色强度和阳性目标的数量不 同进 行 评分,评 分 分 为一、共个等级。每批 次均以正常组 的染色强度作 为标 准评分并定为,稍低于正 常为、中等低于正常定 为、明显低于正常定 为、染色结果 阴性定 为。,稍 强于 正常定为、中等强 于正常定为、明显强于正常定 为。脑水肿应 用 干 湿 重法 测 定 脑 缺 血 再灌注损伤后不同时间点脑不同区域皮 质区、皮 质下区水肿的程度。依据 公 式脑水肿 程 度一湿 重一干重湿重,计算出脑各部分 的水 肿 程 度,以每湿重脑组织 中所 含水 的重量表示。神经功能缺损评估参照厂的方法对缺血损伤后 的大 鼠进 行 神 经 功 能缺 损评 分,用 于从行为学方面反 映脑损伤的程 度,评 分共分项最高评分为分、最 低 为分。血脑屏障通 透率参照众仁的方法,应用二作为示踪 剂监测 血脑屏障的损伤程度。在实验各时间点前小时经大 鼠尾静脉按体重标准静脉注射,循环小 时后,给予大 鼠腹腔 注射水合氯醛,麻醉,经心脏快速灌注冰生理盐水灌注压 力等于。水柱,迅速 断头 取 脑。横 断面切 取 损伤平面厚约的脑组织,并将其分 为损 伤 侧 皮 质、皮 质下和健侧皮质、皮质下四个部分,在分析天平上秤湿重,各部 分 组 织 放 人 匀浆 器 进 行 匀 浆,匀浆液 为的三氯乙酸,组织匀浆液经离心,取上清与无水乙醇混合,应用荧光 分 光 光 度 计旧本产。一型在、的条件下进行比色,依据其值计算出的浓度。依据所测得浓度计算出血脑屏障对的通透率,以每克湿重 脑 组 织 内所 含的量昭表示。组织处理脑组织按常规行石蜡 包埋、胖厚度切片裱于经多聚赖氨酸包被 的清 洁载玻片上,再按常规进 行脱蜡、复水和液 漂洗,行免疫组 织化 学检测。四、统计分析使用统计软件包构建数据库,并对数据进行相应 的统计学 分析。结果一、大 鼠手术、缺血过程 中生命体征 的变化手术 中的生理学各项参数 的监测结果均在正常范围,手 术前血压、动脉血气 等监 测 结 果 为士、士、士、士、血糖士、士梗塞小 时后 上述 监测结 果 为士、士、士、士、血糖士、士。统计学分析检验 显示其差异无统计 学意义。由此显 示 实验手术过程 中大 鼠生命体征平稳。二、大鼠脑缺血再灌注损伤后行 为学 的变化本组研究发现大 鼠卒中后出现 明显 的神经功能缺损和行 为学变化,几乎所有卒中大 鼠均出现进食减少、体重 明显减轻、活动减少、反应迟钝,部分大 鼠出现抓头、恶心等表现,少部分出现鼻粘膜、眼结膜出血,严重的出现抽搐、昏迷、死亡。比较再灌注不同时间点 的神经功能缺损评分,发现卒 中后第一小时的神经功能缺损程度最重方差分析其尸。其中再灌注小时的神经功能缺损评分为士。本实验组大鼠卒中后有一定的死亡率,死亡 多 出现在小时之内,小时以后 大 鼠未 出现死亡,本实验组大 鼠死亡率为,小时以内为。三、大鼠脑缺血再灌注损伤后脑水肿形成过程本组研究结果显示大鼠脑缺血再灌注损伤后,脑水肿 出现于再灌注数小时之内,至一小时达到高峰,随后逐渐消退,这一过程与神经功能缺损 的变化在脑。神经疾 病 杂志年第卷第期时间上相一致。伤 侧半 球 水肿程度的详 细结果见表。四、大鼠脑缺血再 灌注损 伤后血 脑屏障损 伤的动态变化本组实验资料显示大 鼠血脑屏障的损伤早在再灌注小时就已出现,至再 灌注一小 时最 为严重,随后逐渐好转,但至病程第天虽未完全恢 复正常,但可获得 大部分恢复。动态分析结果显示四个部位 的通透率在缺血再灌注损伤过程 中均有变化,统计学 分析其差异均有统计学意义。伤侧半球通 透率 的详细结果见表。表脑缺血再灌注 损伤后脑水肿和血脑屏障对通 透率的动态变化下常组再灌注时间分组伤侧皮质区伤侧皮质下区伤侧皮质区伤侧皮 质下区标本数水肿程度士士仪、州士士矛工“下,士洲水肿 程度士通 透率士当通 透率士土士“士士土,生士士士。户土,士,土”“生士魂土“工丁一土”厂工苦,士注表示与正常组比较尸。五、大 鼠脑缺血再灌注损伤过程 中脑 内蛋白水平的动态变化本组实验数据结果显 示早 在再 灌注损伤小时,伤侧半球的水平就 出现了降低,再灌注损伤论一注小时其水平达到最低水平,至再灌注损伤天时其水平可恢复正常,且部分大鼠高于正常水平,统计学分析其结果与正常脑 组 织的水 平 的差 异具有统计学意义。详细结果见表。表脑缺血再灌注损伤后脑 内水 平 的动态 变 化正常组再灌注 时间分组标本数伤侧半球入士士二峨刁刁上,二飞飞巾二了土土士飞健侧 半球,士,士吕二二土注。示与正常组 比较差 异 有统计学意义尸匀,六、大 鼠卒 中后脑 内水平与神经功能损伤程度的相关性 分析本组实验结果显示脑卒 中后脑水肿最严重 的时 间点出现在再灌注损 伤小时。影响卒 中后大鼠神经功能缺损的主要 因素之一就是卒 中后 的脑水肿。为此本研究分析了再灌注损 伤小时 时间点 的神经功能缺损程 度与脑内的 相关 性,应 用 相关 分析处理,结果显 示在脑内的水平 与神经 功能缺损评分呈负相关性一尸一。讨论目前在各种生命 体 中已发现种水通道 蛋白,由此为极性水分子透过以脂质双分子层为特征 的细胞膜提供了分子结构 依据,它们参 与调节极性水 分子 的跨细胞膜转运,并且 发现,、的功能障碍已成 为多种水代谢障碍疾病 的中心 环节。本研究结果显示大鼠脑缺血小时后随着再灌注的开始,脑 内水平 表现出逐 渐下降,至再灌注小时降至最低点,随后开始逐渐恢复,至再灌注第天时其水平可恢 复正常,且部 分大鼠高于 正常 水平。脑与神经疾病杂志年第卷第期对于这一现象我们做 如下 解析 在脑 缺血 再灌 注损 伤的早期脑 内蛋 白水 平迅速 降 低 是 机体对脑损伤的一种保护性反应,以达到减 轻血 脑屏障损 伤和减缓脑水肿 的形成 的目的,尤 其可以减轻血管源性脑水肿的形成随着损伤的逐渐 加重,进 人失保护状态下,水平逐渐恢 复,脑 水肿 在随后的一 定 时 间 内也明显加重。结合脑缺血再灌注损伤后早期脑水肿 的性质以细胞源性脑水肿 为主、后期 则以血管源性脑水肿为主的特 点。提示 后期水 平的恢 复与血脑屏障的开放有一定的相关 性,早 期水 平 的降低可能是机体自身对损伤所作出的一种保护性反应。从一仁和仁习的研究结果 中均可发现再灌注早期即 出现了血脑屏障的破坏,从而导致水和大分子物质 经破 坏的血 脑屏障进人脑组织细胞外间隙,加速 脑水肿的形 成。急剧 形成的脑水肿必 然加 剧 脑 组 织的损伤,有 时甚至是 致命的。对于这样一个病理 过 程,机体 是否存 在 保护机 制在宏观上大脑通过自身调节机制减少脑的血流灌注以期达到降低、减缓脑 内压力的升高本研究发现 的水平或活性主动降低,减少进入脑组织 中的水分的量,正是机体从微观上对脑水肿和血脑屏障损伤的一种微观保护性反应。其可能 的作用机制是缺血再灌注损伤后,细胞 间隙 中增 高 的、以及以谷 氨酞胺 为首的一系列兴奋性氨基 酸浓 度上升,由此刺激 胶质细胞启动激活细胞 内信号传导 系统,并导致 蛋 白激酶活性升高阁,激活的蛋 白激酶对进行磷酸化反应,经磷酸化后其生物活性 丧失,弓,从而在一定程度上减少经由破坏的血脑屏障进人脑组织细胞间隙以及经胶质细胞膜进 人 细胞 内的水 分 子的量,从而达到减缓脑水肿 的目的。匡在剔除基因的小 鼠上进行脑 缺血和水 中毒 实验,结果显示 剔除基因后具有 阻止脑水肿 的形成,减轻神经 功能损伤程度。口在 肌 营养 不良小鼠上 进行 水中毒实验结果亦发现该小 鼠具有延缓脑水肿形成 的能力,究 其 原因是 该 小鼠因脑 内水 平下降和不能正常定 位 在 细胞 膜上 而丧 失了生物活性这两个结果 均 支 持水 平 或活性 的降低对 脑水肿 的形成具有阻止作用。本实验结果所显示的再灌注早期组织损伤相对较轻时,水平有所下降但并不很明显,当再灌注至小时,这时脑 组织细胞损 伤 变得 明显急剧,各种有害物质在细胞外 间隙 中的积 聚也更 加明显,为此伤侧脑皮质和皮 质下区内的水 平 降至最低 水平,这一过程在时间上与脑水肿程度的变化、神经功能缺损评分的变化表现出一致性 结合再灌注小时的水平与神经功能缺损评分呈负相关性,它们均支持水平 或活性 的降低有利于延缓 脑水肿 的形成和发展,因此本研究认为该现 象是机体对脑 缺血再灌注损伤后脑水肿形成所作出 的一种保护性反 应。至于再灌注后期水平 的恢 复可能系机体的失保护所致,因为随着损伤的加重,损伤局部 内环境的恶化,为了维持神经元的生存环境的相对稳定,表达的恢复是为了增加水分 的进人,以缓 冲局部 离子浓度 的变化。因本实验对的检测所采用的方 法 是免疫组织化学法,该方法属于间接检测法,它受到多种因素的影响,排除人为和试剂的因素,蛋 白质构像 的变化对抗原决定簇的影 响是 对 结果 影响 最 大 的因素。三发现经蛋白激酶磷酸化后,将丧失其生物活性 结合二发现在调节其生物活性时也会产生空间构像的改变,由于抗原性的变化导致免疫组织化学染色阳性水平下降,这种情况并不能等 同绝对水平 的降低。本实验所 发现 的脑 缺血再灌注损伤过程 中的免疫组织化学染 色的变化 是 属于绝对 水平的降低还仅仅是磷酸化后空间构像的变化引起其抗原性发生变化还有待进一步观察明确 但有一点是肯定 的,即缺血再灌注损伤后 脑内总的生物活性是降低的。参考文献一,、,一,一、,一一一,一,一,、一,一一,一下转第页脑与神经疾病杂志年第卷第期前 尚不完全明了,文献报道有 如下几 种学说。、缺氧缺血学说,川等应用 正 电子发射体层摄影术检测表 明,及的患者可发 生脑局 部灌注 量降低。然而单纯用 缺 血 缺 氧还不足以解 释的全 部 临床表 现和病 理改变,特别是许 多症状都是发生在碳氧血红蛋 白水平完全恢 复正常之后,而且的水平 与临床症状及预后也缺乏 良好的相关性。、再灌注损伤 与 自由基学说叫、细胞毒学说叫、细胞凋亡、神经递质紊乱学说川。在所有发病学说中,中枢神 经的缺血 缺氧作为迟发脑病发生的始动因素,无疑占有非 常重要 的地位,就目前医疗条件而言,高压 氧是治疗急性一氧化碳 中毒、迅速改善机体缺氧 的最有效方法 之一。高压氧治疗急性一氧化碳 中毒的基 本原 理 如下、提高血浆内物理溶解氧量,提高氧分压和血氧弥散能力,从而改善脑组织供氧,保证脑组织 的有 氧代谢。在常压 下吸氧时脑组织的氧分 压 为,而在氧 压下,其 升高至而且脑灰质毛细血 管氧 的有效弥散半径从拜扩 大到拜。、在高压氧下,颈动脉血流减少,从而脑 血流量 减少,脑 水肿 减轻,颅 内压下降,避免了脑缺 氧、脑 水肿 的恶性循 环 但 椎 动脉血流量增加,因此脑 干和网状 激 活 系统的血 流量并不减少,对一氧化碳 中毒合并 脑水肿 昏迷患者有促醒作用。、加速的解 离和清 除,在 常 压下吸氧,一氧化碳排 出体外的半 廓 清 时 间为分 钟,在氧压下其半廓清时间缩短至分钟。动物实验和临床研究证实,治疗急性一氧化碳 中毒 在 缩短病 程、预 防和治 疗均 有 效。和报道,在 美国中迟发脑 病发病率估计 为一,在没有 接受治疗 或中毒后迟于小时 内接受治疗 的患者,迟发脑病 的发病率为,而在小时内接受治疗 的发病率仅为。故应尽快对急性一氧化碳 中毒患者实施高压氧疗。我们的观察还提示适当增加高压氧疗次数,虽不能杜绝的发生,但可减少其发生,有条件者还可数个疗程 治疗,“最佳疗程”目前尚在探索之 中,在目前 尚无 特异手 段解 决之 前,无疑仍是最佳手段之一特别是重症、老年、意识丧失和一氧化碳接触时间长者,及时、长疗程 的高压氧治疗能有效预防和减少的发生。参考文献叶任高主编,内科学,第版,北京人民卫生 出版社,一,一张 秀明,顾任骏,贾福军等急性中毒后 迟 发 脑病发病机制探讨中华卫生 职业病杂志,一卜一一一,一顾仁骏,张 秀 明,尹景 岗等一经 色胺、乙酞 胆 碱和多巴胺测 定在急性一氧 化 碳 中毒后迟发 脑病中 的 意义 中华 神经科杂志,一一,。,一一收稿上接第页,一一,一,一、一,飞,一一魂飞一一,一,一一,一一,一,一一盆一,一一卜一一,污。一一收稿