实时PCR技术在NG和CT筛查中的应用.pdf

实时实时 PCR 技术在技术在 NG 和和 CT 筛查中的应用筛查中的应用 金红芝 杨志军 摘摘 要要：本文简述了 NG 和 CT 感染概况与分离培养法、涂片镜检法、酶免测定法、常规 PCR 法、实时 PCR 技术等主要的检测技术，着重介绍了实时 PCR 技术在 NG 和 CT 筛查中的应用情况。关键词关键词：NG，CT，实时 PCR，筛查 淋病（gonorrhea）和非淋菌性尿道炎（nongonococcal urethritis，NGU）是最常见的性传播疾病（STD），被卫生部列为重点防治的对象。淋病是由淋病奈瑟氏菌（Neissria gonorrhoeae，NG）引起的一种性传播疾病。人类是淋球菌唯一的自然宿主，主要通过性接触而传播。感染淋病之后，患者发生泌尿生殖系统的损害，男性发生尿道炎，女性引起尿道炎和子宫颈炎。如治疗不彻底，可扩散至生殖系统，引起不孕不育症。患者主要是年轻的成人，它严重影响着人们的身体、工作和生活质量。据近来世界卫生组织估计，全世界每年约有 6200 万新病例发生。在我国，目前其发病率排在性传播疾病之首，约占性病的 56.67%78.11%，1996 年全国报告为 202620 例（17.3/10 万），近 2 年仍有上升的趋势。据一些城乡健康妇女调查，其患病率约 0.30.5%左右。沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）感染是引起非淋球性尿道炎的主要原因，其所致的泌尿生殖道感染占非淋菌性尿道炎的 40%50%。美国估计每年有 300 万青年与成人感染 CT，我国近年来病例数也不断增加。CT 感染与年龄关系密切，年轻人感染率较高。性伙伴越多，感染的机会也越多。CT 感染若不及时治疗也可引起多种疾病，且伴有严重的并发症和后遗症。在男性可引起阴道炎、附睾炎。对于女性患者，症状较轻或不典型而未医治的，40%的可引起盆腔炎；至于有明显感染症状的，患盆腔炎的几率更大。在这些盆腔炎患者中，20%的会引起不育症，18%的会转化成慢性盆腔炎，9%的可能会导致有生命危险的输卵管受孕。CT 感染可通过母婴传播引起新生儿肺炎及眼结膜炎，还可引起胎膜早破、早产、新生儿死亡等。感染衣原体的孕妇，产下的婴儿有 50%70%将成为带菌者。目前，NG 和 CT 感染在我国的发病率呈不断上升的趋势，1524 岁的青年人是 NG 和 CT 发病率最高的人群，且感染女性生殖道的机会远远高于感染男性生殖道。由于这类疾病的感染常常无症状或症状很轻，患者得了性病却不自知，绝大多数患者不会主动就医，从而延误病情，对患者的身心健康造成很大的危害，还导致疾病的更广泛的传播。因此，针对 CT 和 NG 感染开展广泛的筛查工作对于此类疾病的早期诊断和治疗具有非常重要的作用。在美国，已经发起了针对PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 CT、NG 的大规模的筛查工作。在国内，这方面的工作还亟待开展。主要的检测技术主要的检测技术 目前，针对 NG 和 CT 主要的实验室检测方法主要有分离培养法、涂片镜检法、酶免测定法、常规 PCR 法、实时 PCR 技术等。其中，实时 PCR 技术具有简便、快捷、特异性高、定量准确等优点，适用于检测高、低发病率人群，可望在性病感染的早期筛查、早期诊断和早期治疗中常规使用。一、一、胞生物学检测方法胞生物学检测方法 1.分离培养法 此法是将分泌物、血液、尿液、大便、痰液及体液等标本在限菌条件下于特定培养基上进行分离培养，依次而判断病原微生物的种类，用于定性诊断。该方法应用比较早，培养成本比较低，操作简单，特异性较高，可在各级医院广泛开张。但是培养耗时比较长，同时敏感性较低，可能因病原微生物的量过少，或接种后病原微生物不成活而延误病情。此方法是淋病筛选和发现病例的主要方法，其检出率与培养基质量关系比较密切，但其不足之处是等待报告的时间较长。对于沙眼衣原体，一般培养法不能使其生长，多采用细胞培养法。细胞培养法几乎没有假阳性，被认为是诊断CT感染的金标准，并可作为治疗效果的判断标准及作为评价其它非培养法的标准。早期曾试图用尿标本做培养，但阳性率甚低，只能采用尿道或宫颈拭子。细胞培养法缺点是费用高、操作繁琐、培养周期长，且实验室技术要求高。由于细胞培养特异性是100%，因此，国外该方法在某些法律纠纷上仍具有重要意义，如寻找性虐待的证据等。细胞培养的敏感性为70%96%，它受到标本采集、转运、保存以及实验室条件和技术的影响，因而难以成为临床常规检测手段，多用于科研和疑难病例的终鉴定。现在沙眼衣原体检测的是以培养方法+两个原理不相关的非培养方法(如DFA+核酸探针或E IA+PCR)作为金标准，如果培养阳性，则无需使用非培养方法。如果培养阴性，则使用两个非培养方法，只有在后者两个同时阳性才能判断为阳性，否则判断阴性。由于实验室技术要求较高，国内只有很少几个研究实验室可从事沙眼衣原体培养及鉴定工作，但与细菌学要求不同，以诊断为目的的常规实验室尚无必要均开展衣原体培养工作。需要强调的是，如果临床上要求高度特异衣原体检测结果，应当选择培养方法。另外，如果要从标本中获得活的沙眼衣原体分离株，以便进一步研究，细胞培养即是惟一的选择。2.涂片镜检法 涂片镜检法是指将尿道分泌物、宫颈分泌物、前列腺液、痰液及其他体液标PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 本进行涂片并经革兰染色后在显微镜下对病原微生物进行分类鉴定，此方法受取材、涂片、染色等各种因素的影响，且镜下淋病双球菌极易与其他的革兰氏阴性双球菌混淆，易发生误诊和漏诊。用作淋球菌感染初筛的涂片应在宫颈口取材。此法简便易行，价格低廉，对男性淋菌性尿道炎患者的检出敏感性和特异性在95%以上，具有初步的诊断价值。但对女性患者的检出敏感性仅50%左右，其特异性受检测者的经验影响。因女性宫颈分泌物中杂菌很多，有的在形态上很象淋球菌，因此WHO不推荐将涂片法用于女性患者的诊断。另外，不推荐用涂片检查来诊断淋菌的直肠和咽部感染，不推荐用来作判愈。沙眼衣原体应用此方法进行检测的敏感性特别低，不推荐用于临床标本的检测，仅限于沙眼衣原体(CT)的鉴定。另外，此方法对于诊断医生的经验要求较高，镜检结果以主观性判断为主，容易造成误诊漏诊，检测结果阳性率不高。二、二、免疫学检测方法免疫学检测方法 1.直接荧光抗体测定（DFA）：DFA技术是将荧光标记的单克隆抗体直接染色涂片标本中的衣原体，从而在病原学上快速(30 min)诊断沙眼衣原体感染。所使用的单抗分为两类，一类是抗沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)单抗，系衣原体种特异性单抗，与沙眼衣原体18个血清型均有反应，由于MOMP在衣原体原体(EBs)分布均匀，故荧光染色的衣原体质量(形态和亮度)较好。另一类是抗衣原体脂多糖(LPS)抗原单抗，是衣原体属特异性单抗(与沙眼衣原体，鹦鹉热衣原体以及肺炎衣原体均可反应)。由于LPS在EB s上分布不均匀，故衣原体荧光染色的质量差于前者。与细胞培养法相比，此法诊断沙眼衣原体感染的敏感性为70%95%，特异性为83%99%。其优点是快速、价廉，操作简便，标本的贮存和运送方便,标本中的沙眼衣原体不必是存活的或是有感染性的。缺点是在低感染率的人群中敏感性差，受实验人员的主观影响大，荧光易淬灭，不适于检测大量标本等缺点。DFA技术在国内使用较少，可能与DFA技术需要荧光显微镜和较强的免疫荧光经验有关。2.酶免疫测定（EIA）：本试验是检测病原微生物抗原的方法。用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测CT的LPS或MOMP，酶反应生成有色产物，用酶标仪进行测定。目前有hlamydiazyme、ID-EIA、Pharmacia Chlamydia EIA等多种市售诊断试剂盒可供使用。其敏感性从64%到98%，特异性从93%到98%。通常认为，其敏感性在高危人群中可得到满意结果，而在新近感染及治疗监测中敏感性明显下降。应用EIA检测男性清晨首次晨尿（FCU）或较长时间不排尿后的尿（FVU）标本是一种受PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 欢迎的非侵入性方法。对有症状男性患者的尿道样本检测NG，其敏感性与革兰染色法相当。对无症状的男性病人，它的敏感性约为70%，特异性 95%。在女性，此法比革兰染色法更敏感，但其敏感性与特异性均低于培养法。因此，本法可考虑在流行率很高又不能做培养或标本需长时间运送时，用来对妇女人群诊断淋球菌感染。EIA的优点在于方法简便、操作自动化，适于短时内大批量标本的检测。但其最大缺点在于特异性比较低，不能用于直肠中标本NG感染的检测，易与其他常见微生物产生交叉反应，如金黄色葡萄球菌、A群及B群链球菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯菌及其他革兰阴性细菌；此方法还存在“窗口期”问题，不能判定是现症感染还是既往感染，也不能用于判愈。当在低流行率人群中使用时，阳性预测值非常低。三、三、分子生物学检测方法分子生物学检测方法 1.直接检测核酸的技术（即基因探针技术）：此技术利用核酸分子的复性原理，用特定的标记探针去检测标本中的靶核酸。最初为放射性标记，后来逐渐发展为酶或化学发光试剂标记。目前有美国圣地亚哥 Gen-Probe 公司生产的发光标记基因探针试剂盒 PACE-2。与培养法相比，Gen-Probe 方法的敏感性和特异性分别为 73%96%和 98%99%，尚无培养法敏感和特异。由于此法成本高、步骤繁琐，随着核酸扩增技术的出现，基因探针技术也就失去了其应用价值。2.常规 PCR 技术：PCR 是以特异的 DNA 片断进行体外扩增的技术，由于先将标本中的核酸特异成分先进行扩增复制，再用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的 DNA，其敏感性较直接检测核酸大大提高。有学者认为其将对感染诊断引起革命性变化。国内外已广泛应用于 NG 和 CT 的检测，尽管在美国其结果尚不能应用于医学法律目的，即不能作为法庭的证据。选择合适的 CT DNA 中的靶序列作为目的基因序列两端互补引物是决定实验系统的特异和灵敏度的关键。此引物决定 PCR 扩增片段的位置、长度、特异性和灵敏度。目前国内外用于构建引物的 CT DNA 有 7.5Kb质粒、MOMP 基因（omp1）和 16SrRNA 基因。有研究表明，质粒引物 PCR 最敏感，omp1 引物 PCR 最不敏感，16SrRNA 基因引物 PCR 介于两者之间。诊断试剂盒 AMPLICOR CT PCR 已通过食品与药品管理局(FDA)的审批，其扩增靶序列即为质粒 DNA。许多临床评价显示，PCR 敏感性超过细胞培养法以及所有其他非培养法，而且 PCR 对于有症状或无症状人群同样敏感。由于 PCR 敏感性高，检查的是死菌，PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 因此，对采集标本的要求并不那么严格，其不但能检测尿道或宫颈拭子标本，而且可以采用尿标本（清晨首次尿，或禁尿 24 小时后的首次尿）进行检测。现已有用病人的尿沉渣和几个病人的尿液混合后（发现阳性再分别做）作 PCR 的报道，这种非侵入性的取材方法颇受患者的欢迎。男性尿液标本用 PCR 检测沙眼衣原体的敏感性为 93.5%100%，特异性为 99.1%100%。女性尿液标本用 PCR 检测沙眼衣原体的敏感性为 95.7%，特异性为 100%。由于尿液取材方便，对患者无侵害，因此这种方法适合于在不同人群中进行大规模筛查。但尿中可能存在扩增的抑制物，会导致假阴性结果。Verkooyen 等报道将标本进行预先的加热处理或使用 2SP 转运培养基可显著降低 AMPLICOR CT PCR 对抑制因子的易感性。将临床标本加热处理后 10 倍稀释亦可在很大程度上防止这种抑制。采用常规 PCR 方法进行临床基因诊断，因有简便、快速等优点，在我国大中小医院广泛使用。但因其扩增产物需电泳检测，而在开放状态下检测数量巨大的 PCR 产物，很难避免实验室不被污染。污染所致的假阳性是常规 PCR 在临床基因检测中面临的最大难题。另外，PCR 不宜用作判愈，病人经治疗后病菌死亡、症状消失即可判为治愈，如果要等体内死菌也全部排完(PCR 转阴)，势必造成过度治疗。3.实时 PCR 技术：实时PCR是一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针进行检测来实现其定量的，与常规PCR相比，实时PCR具有许多优点。在一般的实验检验中，对常规PCR 反应后产物的分析主要以琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳为主，由于分离差，分辨不好掌握，操作较繁琐，而且影响因素较多，结果判定的主观性和经验性太强，容易出现假阳性和假阴性。而荧光探针定量PCR 技术自上样后到得出结果是在完全封闭的系统中运行，无需PCR 后处理和冗长的电泳，避免了交叉污染，使得结果更加客观真实，同时在扩增时结合了特异探针的杂交，进一步提高了实验的敏感性和特异性。有文献报道，实时PCR 其敏感性和特异性均高于常规PCR。实时-PCR技术对病原体的活性无任何限制，少量的病原微生物经指数扩增后均可检测出来，解决了某些病原体培养条件高、周期长的问题。另外在实验时采用阳性、阴性标准品做对照，大大提高了定量诊断的准确率，可用于治疗效果观察。值得注意的是，应用实时PCR对性病病原体进行检测，与HBV-DNA 定量检测有所不同。因为生殖道标本的采集无法定量，实时PCR检测沙眼衣原体与定性PCR在临床诊断意义方面并无大的差别。孙继梅等应用实时PCR 诊断试剂盒对296 份标本进行淋球菌、沙眼衣原体及解脲支原体联检，检测结果表明实时-PCR PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 技术不仅可对一份标本同时检测3 种病原体，而且其操作步骤简单、反应时间短，整个过程可在2 h 内完成，结果判定简单客观，能够满足临床检测要求。蔡兰等应用实时PCR 技术检测了临床标本3641份，检测结果证明实时PCR 技术可准确定量检测常见性病病原体基因，可为临床治疗提供依据，并具有简便、快捷、特异性高、定量准确等优点，对性病的诊断和治疗有指导意义。到目前为止，实时PCR 在性病检测的敏感度、灵敏度以及准确性等方面优势比较明显，是目前性病检测最有前途的方法，可用来进行大规模的性病筛查和检测。随着技术的不断推广和应用，这种方法现已被大中型医院和性病专科门诊广泛采用。近年来亦有学者应用连接酶链反应（LCR）检测 CT。LCR 属于一种探针扩增技术，是依赖靶核酸序列的寡核苷酸探针的连接技术。Abbott LCR-CT 诊断试剂盒也已通过 FDA 的审批。同 PCR 相比，由于使用两对引物，用 LCR 检测 CT感染，具有更高的敏感性和特异性。但连接酶价格昂贵，难以在临床普及应用，仅适用于科研，且国内应用较少。四、实时四、实时 PCR 技术用作技术用作 NG 和和 CT 筛查的具体情况筛查的具体情况 1.标本采集及处理 无论使用何种技术检测 CT 和 NG 感染，标本的正确采集都是至关重要的一个环节。如果所要检测的标本没有正确地采集时，最好性能的诊断技术也不能得出正确的检测结果。对于 CT 检测来说，宫颈拭子中柱状上皮细胞的存在与 PCR技术及其他检测技术的灵敏度的高低密切相关，且获取柱状上皮细胞对 CT 检测比 NG 检测更重要。标本采集时，先用一个棉拭子擦拭宫颈以除去表面的黏液，然后再用另一棉拭子取材。当缺少宫颈标本质量监测时，大约有 10%的样本采集不适合做 CT 检测，因为含有太多的分泌物，但是缺少宫颈细胞。阴道拭子或宫颈拭子标本采集：把合适的拭子或宫颈刷伸入男性尿道口或女性宫颈口上1-2厘米，拭子紧贴阴道壁或女性宫颈壁旋转2周，停留数秒后取出，将拭子头放入盛有1毫升无菌生理盐水的样本冷冻保存管中，反复漂洗，漂洗液供检测用。漂洗液在-20保存，长期在-70保存。尿标本采集：取初段尿1毫升，在无菌离心管中15000rpm离心15分钟，弃上清，留取沉淀供检测用。尿液标本进行 CT 或 NG 筛查时，灵敏度与宫颈拭子的相同或略低。用 PCR技术对男性 CT、NG 感染进行筛查时，用尿道拭子与尿液都是可行的，但是没有症状的尿道炎患者经常不接受尿道拭子的取样方式。PCR 检测尿液标本中的NG 用于筛查具有足够的灵敏度。仅有很少量的研究表明 PCR 检测无尿道炎症状的男性患者，用尿道拭子作为标本可能比尿液要好。2 阳性结果的后处理工作 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 国外许多研究对 CT 和 NG 筛查中所使用的检测方法的进行了评估，一致认为PCR 技术比培养法、EIA 等技术具有更高的灵敏度。高灵敏度的技术用于筛查可以减少假阴性，以尽量减少阳性患者被延误治疗或疾病的持续传播，但同时要容忍一定数量的假阳性的诊断结果。然而，必须采取措施减少假阳性结果的比率与数量。如果对医疗机构的设置、患者类群、患者特征等不加考虑，假阳性结果必定会对患者造成医疗上的、社会上的、心理上的不利影响。实时PCR筛查所得的阳性检验结果均被看作是NG或CT感染的一种参考依据。当针对低流行率的人群进行筛查的时候，应该在对一种检测方法筛查所得的阳性结果再进行一附加实验，对筛查到的阳性结果进行验证。如果两种检测方法所检测的结果均为阳性，那么检测所得的判断结果为 CT 或 NG 感染阳性。有时只是增加一种附加实验不能解决所有问题，因为附加实验也有可能提供假阳性或者假阴性的检测结果。但是，由于目前 CT 和 NG 感染的治疗是安全、有效的，且不能延误，在等待附加实验结果，甚至在附加实验结果为阴性的时候，征得患者同意，也可以对其实施治疗。但需对患者提供可能会出现的假阴性、假阳性结果等方面的咨询服务，让患者明了延误治疗的风险，以及假阳性结果对患者可能造成的不利影响。理论上，对同一标本用不同的方法进行第二次检验极少会出现假阳性的结果，然而用同样的方法对同一样本做第二次检测时很有可能会出现假阳性结果。PCR 技术作为附加实验具有很好的优势，因为其较高的灵敏度；且只有 PCR 技术可以作为 PCR 检测阳性结果的附加实验。除非是分离 CT 或 NG 的分离株，培养法等非扩增的检验技术一般不能用作附加实验，因为其低灵敏度。3.一种节省成本的筛查方式 选择合适的技术与策略进行CT和NG的筛查还要考虑到费用问题，因为在缺少症状时所进行筛查的费用，包括劳务费以及试剂费用一般不属于保险公司负责的范围，了解筛查的费用及益处对于人们的选择是很重要的。因此，筛查时要注意节省成本，降低检测费用。因PCR技术具有很高的灵敏度，先把多个样品混在一起后再进行利用PCR技术进行CT或NG检测是目前用来降低费用的一种比较有效的筛查方式。多个标本混在一起，进行PCR检测，如果检测结果为阴性，则这些样品均报阴性；如果为阳性，则需要对这些标本分别进行检测。这种筛查方式，对于低流行率人群筛查时节省费用是比较有效的，节省的费用随流行率的降低而增加，因为在低流行率的时候，更多的样品可以混在一起，而不会增加出现检测结果阳性的可能性。有证据表明，在没有降低实时PCR技术的灵敏度和特异性的情况下，少数的样本混在一起是有效地节省费用的检测方式。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 理论上，把多个样本混在一起进行检测与对单个样本分别进行检测，可能会降低 PCR 检测的灵敏度或提高其特异性。诊断为阳性的结果，被混在一起进行检测的样品的检测结果与单个进行检测的结果均为阳性。这与单个标本检测相比提高了特异性。除此之外，混检可能会降低 PCR 技术的灵敏度，因为混检使每一样品在检测溶液中添加的量减少了。而且，如果部分样本中含有抑制 PCR 扩增的物质，混检时可能会使本来单检时为真阳性的标本的检测结果均出现假阴性。如果PCR 反应体系里面不包含检测抑制物的内质控，将检测不出抑制物质的存在。然而，多个样本混检使抑制物质稀释也可以减少抑制物质的影响。另外，混检的方式增加了实验及数据的记录步骤，也容易导致错误的假阳性或假阴性结果的出现。而且，混检会导致被混在一起的多个样本检测结果为阳性，还增加了不理想操作（如使用吸管）的使用机会，易导致交叉污染及假阳性结果的出现。关于 PCR 技术用来 CT 和 NG 混检的报道目前还比较少，并且这方面所进行的大多数研究都没有一独立的参考标准。然而，目前的研究表明把 4-10 份尿液或宫颈标本混在一起进行 PCR 检测可以降低费用、增加通量，同时保持 PCR 技术的灵敏、特异的特点。由此节省下来的试剂费用可达 40%到 60%。总之，随着性病在我国发病率逐年上升以及性病感染状况不断复杂化，提高性病实验室检测方法的敏感性、特异性，简化操作步骤、缩短检出时间，加大力度开展高危人群性病感染的筛查工作是防治性病的重要措施。传统的泌尿生殖道NG 和 CT 感染检测方法普遍存在检出率低、耗时长、灵敏性低、特异性差的缺点，给性病的早期诊断带来困难。近几年发展起来的实时 PCR 技术克服了常规PCR 的许多缺点，具有高灵敏性、高特异性、效率高、污染小等特点，可望在NG 和 CT 感染的大规模筛查项目中使用。随着分子诊断概念和技术的不断发展和推广，实时 PCR 技术在性病及妇科病的确诊和疗效观察等方面将具有广泛的应用前景。参考文献（略）PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建