糖类物质的毛细管电泳分析.pdf

收稿日期:2002209202;修回日期:20032032103 通讯联系人文章编号:100421656(2003)0520607205糖类物质的毛细管电泳分析张 利,陈蓁蓁,王 燕,唐 波3(山东师范大学化学系,山东 济南 250014)摘要:毛细管电泳(CE)是近二十年发展起来的一种新的分离分析技术,它以快速、高效、高灵敏度、所需样品少等优点被广泛应用于各个领域。八十年代末开始应用于糖类物质的分析,并获得了快速发展。本文对毛细管电泳分离分析糖类物质进行了评述,主要集中在多糖的水解、衍生、检测、分析应用及前景等方面。全文引用文献40篇。关键词:毛细管电泳;多糖;评述中图分类号:O65718 文献标识码:A 糖是自然界和生物体中广泛存在的物质。长期以来人们认为糖的主要功能是提供能量,而新兴的糖生物化学研究发现糖类物质除了提供能量外还有其它多方面的生物活性与功能,诸如抗癌、抗菌、抗病毒、控制细胞分裂,调节细胞生长和人体免疫功能等作用1,多糖及其衍生物还被用作分离对映异构体的手性选择剂2,3,所以糖类的研究受到人们越来越多的重视。但多糖的结构复杂,具有很高的微观不均一性,因此对其分离分析相当困难。毛细管电泳是20世纪80年代发展起来的一种分离分析技术,它以快速、高效和灵敏度高、所需样品少等优点被广泛应用于各个领域。用毛细管电泳分析糖类物质在20世纪90年代发展迅速,但目前毛细管电泳对糖的分析主要集中在单糖和寡糖的分离检测方面,对多糖的分离分析还不多见。本文依据毛细管电泳分析多糖的步骤对糖类物质的分析及其应用前景进行了评述,对影响多糖分析的各种因素进行了较为系统地介绍。1 糖及毛细管电泳分析简介糖是多羟基醛、酮、醇及它们的衍生物。按其所含糖元的数目可分为单糖、寡糖、多糖和糖蛋白、糖肽等糖缀合物。单糖常以环状形式存在,尤其是五元环,六元环最常见,它是构成寡糖和多糖最基本的结构单元。寡糖一般是指分子中含有2-10个单糖单元的聚合物。多糖是指由超过10个以上的单糖通过糖链组合而成的高级聚合物4。糖蛋白和糖肽是糖分别与蛋白质和多肽组成的糖缀合物。毛细管电泳是利用带电粒子在高压电场中由于迁移速率不同而达到分离目的的一种新技术。其检测方式有紫外可见检测、激光诱导荧光检测、电化学检测等5。但糖类物质既不带电,也无紫外吸收基团和荧光基团,所以不能直接利用毛细管电泳对其进行分离分析。因此要用毛细管电泳对糖进行分离应从两个方面考虑:(1)使糖带电,(2)对糖进行衍生化,使其具有紫外吸收基团和荧光基团。目前,对多糖及糖缀合物中糖基部分的分离分析是建立在对单糖和寡糖的毛细管电泳分析的基础上,先用酶解和化学水解使糖链分解为单糖和寡糖,再对其进行分离分析,因此对多糖的分析主要是对多糖所含糖元的分析。2 多糖及糖缀合物的水解4,6,7使多糖水解的传统方法是酸解,多糖经酸解释放出单糖和寡糖,Fontaniella8等人用盐酸水解从死亡甘蔗茎液汁中分离出来的多糖,经毛细管第15卷第5期2003年10月化 学 研 究 与 应 用Chemical Research and ApplicationVol.15,No.5Oct.,2003 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.电泳分离分析后,发现蔗糖、纤维素二糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖212P、葡萄糖醛酸是这种提取多糖的主要成分。酸解方法虽然被广泛利用,但是用酸解释放出的单糖在不同程度上被酸解破坏,而且糖醛酸阻碍酸解的进行,在此条件下糖醛酸残基仅有一小部分释放出来。另一方面,不饱和的糖醛酸残基被酸解完全破坏,使其不能通过这种程序检测出来。含有糖醛酸的配糖键通过甲醇分解被有效地裂解,甲醇解是应用在无水甲醇中加入强酸使多糖分解的方法,其分解比酸解更有效。在甲醇分解过程中释放出的糖醛酸的降解程度也比较小。Chambers和Clamp在甲醇解实验中,证实了在糖蛋白甲醇解中中性糖、己糖醛酸、乙酰脱氧己糖和N2乙酰神经氨酸等单糖的释放。结果表明,在1mol/L的盐酸甲醇溶液中,85 加热24小时,所有单糖都是稳定的。但甲醇解对某些多糖的分解所得的糖产率可能较低。酶解是一种已经建立起来的检测多糖结构的方法。酶具有选择性和专一性,选择性可以使我们得到想要的糖链,专一性可以确定配糖键的结合位置。对多糖进行分解时要多种酶相混合的酶体系才能对多糖进行有效地水解。Suzuki等用多种酶混合的酶体系使木质素和纸浆中的多糖得到很好的分解。Cescutti9等人用纤维素酶和 2甘露聚糖酶分解葡甘露聚糖,进而研究多糖链的结构与顺序。Znang Mingquan10等人用壳多糖酶和葡聚糖酶分别水解花生霉菌病原体和发面酵母中的甲壳质和葡聚糖,得到它们相应的糖单体:N2乙酰葡糖胺和葡萄糖,然后用62氨基喹啉对这两种单糖进行衍生检测。3 糖类物质的衍生衍生的目的是为了引入紫外吸收基团或荧光基团以利用毛细管电泳的紫外或荧光检测器对糖进行分离检测。因为包含双键、三键、共轭键、孤对电子以及C=0、S=S、N=0、N=N等功能团的物质都能吸收紫外光,因此在糖分子中引入这些功能团可对其进行有效地紫外检测。在糖分子中引入荧光基团可以对其进行荧光检测。目前,大部分的衍生试剂都是氨基取代的环状化合物如单苯胺取代衍生物11:22氨基苯甲酰乙酯(22ABEE)、32ABEE、42ABEE;22氨 基 苯 甲 酰 胺(22ABA)、32ABA、42ABA;22氨 基 苯 腈(22ABN)、32ABN、42ABN;32氨基苯甲酸(32AB)、42AB等,它们是还原糖衍生化的衍生试剂,还原糖可以通过这些苯胺衍生物的还原氨化作用进行标记,反应通过席夫碱的形成进行,反应如下:32取代的单苯胺衍生物对席夫碱的生成有利,因此对未知糖链混合物进行分析时32ABA是首选衍生试剂。衍生试剂还有62氨基喹啉12、32(42羧基苯甲酰基)222喹啉羧基醛(CBQCA)13、22氨基吡啶(PA)14、22氨基丫啶酮15、82氨基芘21,3,62三磺酸(APTS)16、氨基萘磺酸17,18 22氨基26,82萘二磺酸(ANDS)和萘三磺酸;四甲基若丹明19、芴甲氧基肼、芴甲氧羧基氯、52羧基四甲基若丹明琥珀酰亚胺酯等。Suzuki7等提出了一种不同于还原氨化类型的新的衍生方法,方法以12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP)作衍生试剂,利用活泼碳(C24)和还原糖的还原端之间的一种新的缩合反应。在温和条件下缩合反应快速定量进行,不需要酸催化剂。PMP法将最适合于糖蛋白样品的外观不均匀性研究。近年来肼类试剂也被引入糖的毛细管电泳的柱前衍生。这类试剂的优点是衍生速度快,反应专一性好,肼类试剂在糖的毛细管电泳柱前衍生中具有很好的应用前景,基806化 学 研 究 与 应 用 第15卷 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.于此,王晓燕、陈义20开发出带电荷的肼类衍生试剂 对肼基苯磺酸,它具有紫外吸收基团,其磺酸根易于电离,是较理想的衍生试剂。4 糖的检测411 缓冲溶液缓冲溶液的pH值及组成对糖的分离起十分重要的作用。很多不可分离的糖通过改变缓冲溶液的pH值及组成可以获得很好的分离。由于单糖的pKa值大于11,因此选择pH值大于11的强碱性缓冲溶液可以使糖失去质子带负电,能对其直接进行电泳分离。Soga21等利用此性质建立了一种用毛细管电泳间接紫外检测法检测食物样品中糖类物质的简单且重现性良好的方法。并且在电化学检测中常用氢氧化钠溶液作缓冲溶液。丁祥欢22等用毛细管电泳 电化学检测法研究了不同浓度的NaOH溶液中各种单糖的分离情况,并用此法分析了牛膝多糖的单糖组份。朱叔韬23利用铜电极在NaOH缓冲液中对单糖进行了直接测定。叶建农24等采用毛细管电泳 电化学检测技术(CE-EC),以铜电极为工作电极,在011mol/L NaOH溶液中对10种市售饮料中的糖类物质的分离检测进行了研究。在利用光学检测器时应用最多的缓冲溶液是硼酸盐体系,pH值一般在8-10,实际起作用的是B(OH)-4,它能与糖形成带电络合物,其反应如下:由于每个络合物分子只带一个负电荷,故也能根据分子大小进行分离。这对糖蛋白中大小及结构相近的寡糖的分离分析意义非同寻常。缓冲溶液中常用的除硼酸盐外还有磷酸盐,它们可以分别单独使用,也可联合使用。412 缓冲溶液添加剂合适的缓冲溶液添加剂能诱导或减少某些多糖类物质的淌度而影响其迁移速率25。对于电荷密集的多糖类物质,可以使用离子对试剂来控制淌度。由于多糖具有两亲性26,所以在多糖毛细管电泳分析中表面活性剂可作为一种添加剂,如十二烷基硫酸钠(SDS)、四氢呋喃(THF)等。各种不同添加剂的混合使用也是得到良好分辨率的一种方法。413 检测器糖类的毛细管电泳的检测方式常用的有紫外检测(UV)、电化学检测(EC)、激光诱导荧光检测(LIF)等。紫外检测最方便,是绝大多数商品仪器的主要检测手段,其缺点是灵敏度低,检测限在pmol范围,可分为直接检测和间接检测。间接紫外检测应用较广泛,它是以某些具有紫外吸收的物质作为背景电解质,使无吸收的物质产生负吸收而进行检测的一种方法。山利酸,12萘乙酸是常用的背景电解质。Soga27用间接紫外吸收测量法使胎球蛋白和桔子汁中的糖类物质能够同时检测出来。电化学检测常用的方法有安培和电导法,Wang Qingjiang28等人首次利用毛细管区带电脉-安培检测法测定了中国女贞多糖的成分,研究发现女贞多糖水解产生的四种单糖在30分钟内能被很好的分离,在铜电极上有很强的电流响应信号,方法的检出限和线性范围令人满意。虽然电化学检测灵敏度比紫外检测高,但其重现性差,且没有商品化的检测器,其它应用情况如311所述。激光诱导荧光检测尽管仪器造价比较昂906第5期 唐 波等:糖类物质的毛细管电泳分析 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.贵,但其灵敏度高,检测限在amol(10-18mol)以下,所以近几年这种检测方法在糖类物质的分析中得到了广泛应用。党福全,陈义29用毛细管电泳-激光诱导荧光检测法,以82氨基芘21,3,62三磺酸作衍生剂,对痕量单糖及葡聚糖水解寡糖进行了分离与检测。Chen30等用LIF分离分析了糖蛋白中N2连接的寡糖。Suzuki31等用LIF对氨基糖进行了超微量分析。Ruiz2Calero32等用间接激光诱导荧光检测分析了聚氨基葡糖中的单糖。作者指出,尽管间接激光诱导荧光检测选择性比较低,但它可用于非衍生单糖测试,可以避免标记过程。Kakehi33等以32氨基苯甲酰胺和32氨基苯甲酸作为标记物,用He2Gd激光诱导荧光检测器分析糖复合物,其标准曲线最低限达10-16mol。Honda34等建立了一种用LIF对糖进行超微量分析的方法,方法建立在通过柱前转化把糖转化成72硝基22,1,32苯并二唑(NBD)标记的N-甲基糖胺的基础上。Chen35等提供了一种利用毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测定量分析单糖的方法。以82氨基芘21,3,62三磺酸衍生化的糖的检测限为100pmol(以Neu5Ac为内标),对其他糖是50pmol。此外,CE与质谱联用是对糖类化合物定性、定量及结构分析的理想方法,其特点是精密度高、快速,所需样品少,但由于CE2质谱仪器昂贵,故应用不太广泛,Klampfl36等建立了一种以电雾化电离-质谱为检测器,对非衍生糖进行毛细管电泳检测的新方法,方法的检出限范围为015-310mgL-1。5 总结与展望从二十世纪八十年代发展起来的毛细管电泳在生命科学领域得到广泛应用。对单糖、寡糖的分析应用较多,也较趋于成熟。对多糖及糖缀合物的分析分离也已越来越多地受到人们的重视1,37-40。但由于多糖及糖缀合物的结构复杂,微观不均一性强,使得其分离分析仍很困难。目前对它们的分析还属起步阶段,对多糖结构的测定主要是集中在对多糖的糖组成分析上;定量测定目前也只限于多糖中某特定功能团和组成多糖的各单糖的定量分析。对多糖完整信息的分析尚属空白,当然只用毛细管电泳一种技术分析多糖的完整结构也是不可能的,因此需要多种分析方法如高效液相色谱、亲和色谱、核磁共振、质谱等技术联合运用。探索多糖及糖缀合物中糖链的有效离解,并不使糖元发生降解,寻求新的高效衍生试剂将是毛细管电泳分离分析多糖及糖缀合物的关键。毛细管电泳与其它多种技术联合使用将会获得关于多糖及糖缀合物更完整的信息。参考文献:1丁侃,方积年.色谱,1999,17(4):346-349.2 Nishi H,Kuwahara Y.J.Pharmaceutical and BiomedicalAanlysis,2002,27(3-4):577-585.3Chankvetadze B,Burjanadze N,Blaschke G.J.Pharmaceuti2cal and Biomedical Aanlysis,2002,27(1-2):153-159.4吴东儒.糖类的生物化学.北京:高等教育出版社,1987,256、885-892.5陈义.毛细管电泳技术及应用.北京:化学工业出版社,2000,30.6Dahlman 0,Jacobs A,Liljenberg A,et al.J.Chromatogr.A,2000,891(1):157-174.7 Suzuki S,Tanaka R,Takada K et al.J.Chromatogr.A,2001,910(2):319-329.8 Fontaniella B,Rodriguez C W,Pircon D et al.J.Chro2matogr.B.,2002,770(1-2):275-281.9Cescutti P,Campa C,Delben F et al.Carbohydrate Research,2002,337(24):2505-2511.10Zhang 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electrophoresisZHANGLi,CHEN Zhen2zhen,WANG Yan,TANGBo(Department of Chemistry,Shandong Normal University,Jinan 250014,China)Abstract:Capillary electrophoresis(CE)is a new analytical technology which has been developed in the last twentyyears.It has been applied in many areasfor its celerity,efficiency,high sensitivity and less sampling amount.CE hasbegun to be used to analyze saccharides at the end of the eighties and been developed veryfast.We review the anal2ysis of saccharides by CE,mainly focusing on the hydrolysis,derivation,detection,application and outlook,with 32references.Key words:Capillary Electrophoresis(CE);polysaccharides;review(责任编辑 李 方)116第5期 唐 波等:糖类物质的毛细管电泳分析 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.