基因工程实验指导.pdf

1实验一 实验一 大肠杆菌感受态的制备及转化大肠杆菌感受态的制备及转化1.实验目的实验目的 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体细胞的 技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.实验原理实验原理 转化（transformation）：是将异源DNA 分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗 传性状的一种手段，是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。进 入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传 性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切 酶和甲基化酶的突变株。自然界中多数细菌的转化频率较低，如大肠杆菌等。但受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许 有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competentcells)。在一定条件下，将带有外源DNA 的载体分子与感受态细胞混合，可以使载体DNA 分子进入受体细胞。常用的转化方 法主要有以下两种：1）化学法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将 载体DNA 分子导入受体细胞；2）电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载 体DNA 分子导入受体细胞。进入细胞的 DNA 分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗 传性状。将经过转化的细胞在选择培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带 有异源DNA 分子的受体细胞。本实验以E.coli DH5菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后 与pUC19质粒共保温，实现转化。pUC19质粒携带抗氨苄青霉素和lacZ基因，因而接受 了pUC19质粒的受体菌具有了抗氨苄青霉素的能力，能在含有amp的培养基上存活，从 而将转化细胞筛选出来。3.仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温水浴，分光光度计，冷冻离心机，摇床，移液枪，水浴 锅 试剂：LB培养基（液体、固体）：胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，调pH7.0。高压灭菌)1MCaCl2(预冷，过滤除菌)1MMgCl2(预冷)含amp 的固体LB培养基（琼脂浓度 15g/L）冰块若干 材料：大肠杆菌菌株：E.coliDH5 质粒：pUC192耗材：带盖离心管(预冷)，枪头(预冷)，PE手套4.操作步骤操作步骤4.1 感受态的制备感受态的制备1）从新活化的 E.coliDH5 菌平板上挑取一单菌落，接种于 35mlLB 液体培养中，37振荡培养12h 左右，至对数生长期。将该菌悬液以1:1001:50转接于100mlLB液体 培养基中，37振荡培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600，至OD6000.5时停止培养。2）在无菌条件下将细菌转移到一个冰预冷的无菌 50mL 离心管中，冰上放置 10min，使培养液冷却至0C。（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快）3）4C2500g 离心5min，倒尽培养液，回收细胞。4）用20mL（原体积的1/5）无菌冰预冷的0.1mmol/LMgCl2悬浮细胞，4C2500g离心5min，倒尽培养液，回收细胞。5）50mL无菌冰预冷的0.1mmol/L CaCl2悬浮细胞，冰上放置20min，4C 2500g离心4min，倒尽培养液，回收细胞。6）10mL 无菌冰预冷的0.1mmol/LCaCl2重悬浮细胞。可4C存放1224hrs，或加 入1mL 无菌甘油，分装于1.5mL 离心管中，70C可保存半年至一年。4.2 细胞转化细胞转化1）准备 LB/ampicillin/IPTG/Xgal 固体培养基。（每板涂 200mg/mL 的 IPTG 和20mg/mL 的XGal 各40L，室温下放置23hr）2）在1.5mL离心管中加入2L 连接产物，其中一管加入2L 水作为对照。3）从70C冰柜中取出感受态细胞，冰浴中融化。4）将感受态细胞轻轻混匀，取4050L 与连接产物混合。冰浴中放置20min。5）控制水浴温度恰好为 42C，热击7590sec，然后迅速转移至冰浴2min。6）加入950LLB液体培养基（不含 ampicillin），37C摇床震荡培养1.5hrs。使受 体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。7）8,000rpm离心1min，除去上清液。沉淀用 100LLB回溶。8）将 100L 菌液涂于培养基上（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再 用，不要过烫），菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜(1216 小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和 菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。9）用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生51062107个转化菌落。在实际工作中，每微克有 105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。10）有的菌落为白色，有的为蓝色（无插入片段）。选取白色菌落，提取质粒 DNA，酶切鉴定。如果要进一步计算转化频率，可对转化后的培养液进行稀释培养。5 注意事项注意事项 为提高转化率，实验中要注意以下几个因素：a.细胞生长状态和密度。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞在5107个范围为3最佳（可通过测定培养液的OD600控制）。密度不足或过高均会使转化率下降。不 要使用已经多次转接及储存在 4C的培养菌液，否则效果欠佳。b.转化的质粒DNA的质量和浓度。用于转化的质粒DNA应主要是共价闭环DNA（即cccDNA，又称超螺旋 DNA）；转化率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正 比，但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。c.试剂的质量。所用的试剂，如CaCl2等，应是高质量的，且最好保存于干燥的暗 处。d.防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。所用器皿，如离心管、分装用的Eppendorf 管 等，一定要洗干净，最好是新的。整个实验过程中要注意无菌操作。少量其他试 剂在器皿中残留或 DNA 的污染，会影响转化率。其它注意事项：1）实验中凡涉及溶液的移取、分装等需敞开实验器皿的操作，均应在无菌超净台中 进行，以防污染。2）衡量受体菌生长状况的OD600值和细胞数之间的关系随菌株的差异而不同，因此 不同菌株适宜的OD600值是不同的。3）本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株和不同质粒DNA的转化，但不同菌株 的转化效率是不同的，有的重组质粒转化率很低。筛选转化体时，甚至需将恢复 生长活性的液体培养基的体积减少，以增加转化体浓度，便于筛选和准确计算转 化率。计算公式为：含抗菌素平皿中的菌落数/不含抗菌素平皿中的菌落数。4）在对照组不该长出菌落的平皿中长出了一些菌落，首先确定是否抗生素已失效，若排除了这一因素，则说明实验有污染。如果长出的菌落相对于转化实验组的平 皿中长出的菌落而言，数量极少（一般在 5个以下），则此次转化还算成功，可继 续以后的实验；如果长出的菌落很多，则需设计对照实验，找出原因后，再重新 进行转化。5）根据所需质粒 DNA 的特性，选择相应的选择培养基进行筛选，有的可能还需进 行多部筛选。4实验二 实验二 转化子的筛选及初步鉴定转化子的筛选及初步鉴定1 实验目的实验目的 学习掌握 互补的原理，掌握根据蓝/白斑选择重组克隆的方法。2 实验原理实验原理2.1 重组子的筛选 载体与目的片段连接后，连接混合物中除了目的重组 DNA 外，还含有以下成分：1 未连接的载体分子2 未连接的 DNA 片段3 载体的自连产物4 含有错误插入片段的重组DNA 分子 未连接的分子一般不会产生问题，即使被细菌摄取也会被降解，自连的载体和错误/正确插 入的重组质粒都可以正常的复制。另外，感受态细胞的转化并不是一个高效的过程，虽然1ng的pUC8可产生100010000个转化子，意味着只吸收了0.01%的DNA分子。在感受 态细胞中10000个转化子仅是整个培养物细胞的一小部分。如果将转化后的菌液涂在无选 择性的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质 粒。因此需要某种方法筛选、鉴定正确的重组质粒。筛选重组子的方法是利用质粒所含有的选择标记。质粒中含有的选择性标记赋予转化 细胞新的特性，可以很方便地与非转化细胞区分开来。例如氨苄抗性基因，转化之后，只 有含有氨苄抗性的大肠杆菌才能在含有氨苄的培养基上形成克隆，而非转化细菌不能生 长。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。大多数的克隆载体含有至少一个抗生素抗性基因，利用相关的抗生素培养既可以方便 的筛选转化细胞。然而抗性的获得不仅仅是抗性基因的存在，抗性基因必须能表达，产生 抗性。转化一旦完成，抗性基因就可以表达，但需要一段时间的表达积累足够的酶分解抗 生素。正因为这一原因，热激处理后并不立即铺在选择培养基上进行选择培养，而是先在 少量的液体培养基中（无抗生素）进行短时间的恢复培养，使抗性基因充分表达。当将细 胞铺于选择培养基时，转化细胞已经合成足够的酶能够正常的存活和生长。2.2 重组子的鉴定重组子的鉴定 虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于 连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。鉴定重组子的方法常用的有 互补，小规模制备质粒DNA进行酶切分析、PCR以及 杂交筛选等。最常用的方法是小规模制备质粒DNA 进行酶切分析，对于带有LacZ 基因的 载体还可以结合 互补现象来筛选鉴定。互补现象：许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码 互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 半乳糖苷酶实现互补（互补）。当这种 载体转入可编码 半乳糖苷酶C 端部分序列的宿主细胞后，在异丙基D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可 以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为 互补现象。5由互补产生的 半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5溴4氯3吲哚 D半乳糖苷(Xgal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的LacZ基因编码序 列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源 DNA 片段时，会造成LacZ基因的失活，破坏 互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重 组质粒的菌落为蓝色。3.仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，移液枪，恒温培养箱，震荡培养箱 试剂：LB培养基（液体）：胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，调pH7.0。高压灭菌)含amp 的固体LB培养基（琼脂浓度 15g/L）50mg/mlIPTG：溶于水，0.22m滤膜过滤，20C避光保存。20mg/mlXgal：溶于二甲基甲酰胺，分装，20C避光保存。材料：大肠杆菌菌株，E.coliDH5 质粒：重组pUC19耗材：带盖离心管(预冷)，枪头(预冷)，PE手套4 实验步骤实验步骤 分别取3个100l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入1l重组质粒DNA(体积不超过10l)+100l感受态细胞，此管为转化实验 组。第二组，H2O对照组，1l H2O+100l感受态细胞悬液；第三组，质粒 DNA 对照组，即1ng 未酶切质粒DNA 十100l感受态细胞悬液。4.1 稀释稀释1）将转化后的培养液摇匀后进行梯度稀释，如表1 所示。表1 细胞转化后溶液稀释梯度 试管号12345678910加 入 样 品 液0.1ml原液 稀释 液1稀释 液2稀释 液3稀释 液4稀释 液5稀释 液6稀释 液7稀释 液8稀释 液9LB培养基 0.90.90.90.90.90.90.90.90.90.9稀释浓度1011021031041051061071081091010稀释倍数10110210310410510610710810910102）取适当稀释度的各种样品培养液0.10.2ml，分别接种于含抗amp的LB平板上，涂匀。（参考转化量：0.55ng，涂板时取转化液0.2ml）3）菌液完全吸收后，倒置培养皿，于37C培养24h 左右。4.2 检出转化体和计算转化率检出转化体和计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示:转化频率的计算公式如下：转化体总数菌落数稀释倍数（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）转化频率转化体总数/加入质粒DNA 的量（计算出每微克的转化菌落数）6表2 各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析 组 含抗菌素的平板 结果说明 转化实验组H2O对照组 质粒对照组 白色菌落和少量蓝色菌落 无菌落 蓝色菌落 说明有重组质粒导入细胞中 说明amp 是有活性的 可以判断感受态细胞的效率4.3 转化子的鉴定 经过蓝/白斑选择可以初步鉴定重组克隆，含有错误插入片段的重组质粒也可以在选择 培养基上形成白斑。进一步鉴定可以提取质粒 DNA，进行酶切或者PCR鉴定。5 作业计算转化效率。7实验三 实验三 质粒质粒DNA 的提取与检测的提取与检测1.目的与要求：通过实验，了解质粒 DNA 的特性；学习掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理与技术，了解分光光度计测定 DNA 含量的原理与方法。2.原理 在基因工程操作中，需要载体(Vector)将外源DNA引入受体细胞。载体是用于携带重 组DNA，并且能够使外源DNA 一起复制与表达的质粒或噬菌体(运载工具)。具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状 的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最 多。图图31 质粒质粒pSC101 的电镜照片的电镜照片 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小在1Kb200Kb，它们复制时利用宿主细胞复 制自身染色体的同一组酶系。质粒可分为两种类型：严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有 10200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如 较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒结构：1.抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene,Kanamycineresistancegene)2.启始复制子（ori,Originofreplication)；3.多克隆位点(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；4.标记基因(Markergene,suchasLacZgene)。质粒DNA的提取方法很多，不外乎以下3个主要步骤：细菌的培养，细菌的收集和 裂解，以及质粒DNA 的分离与纯化。常用的提取方法有：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法：沸水煮沸40秒8SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。碱裂解法是目前最常用的提取方法，提取的原理如下：DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA 的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA 复性。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所 以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。在pH12.012.6碱性环境中，线性的大分子量的细菌染色体 DNA变性，而共价闭合(cccDNA)质粒DNA仍为自然状态。将pH值调至中性并有高盐浓度存 在的条件下，染色体DNA之间交联形成不容性网状结构。大部分DNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心，可去除大部分细胞碎片染色 体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA留在上清中，再用苯酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。DNA 浓度的测定：测定DNA 浓度的方法有两种：一种利用分光光度计法测定DNA 的紫外光吸收值；另 一种方法根据嵌入样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过 测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导 致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测 定比较纯的样品。溴化乙锭荧光强度法：当 DNA含量较低以及样品中杂质含量高时，会影响紫外光吸 收值的测定，这时，可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧 光强度，因为这种荧光的强度与DNA 总质量数成正比。3.主要仪器、材料和试剂 仪器：离心机 台式高速离心机 旋涡混合器 移液枪1ml,200l各6支 电泳仪 恒温震荡培养箱 试剂：LB 培养基(胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，调 pH7.0。高压 灭菌)苯酚：氯仿(将等体积的Tris饱和酚、氯仿混合，氯仿是氯仿与异戊醇按24：1的混合物)乙醇（无水乙醇，70%乙醇）限制性酶（EcoRI）STE：0.1MNaCl,10mMTrisCl,1mMEDTA,pH8.0SolutionI：50mM葡萄糖,25mMTris,10mMEDTA,pH8.0,高压灭菌，4C贮存。9SolutionII：0.2MNaOH(使用10M 母液),1%SDS（新鲜配制，分别配制，使 用时混合）SolutionIII：5MKAc60ml,冰乙酸11.5ml,dH2O28.5mlSTET(0.1 mol/LNaCl,10mmol/L TrisCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH 8.0),5%TritonX100)10mg/mlRNase：称取100mg RNase粉剂，溶于10ml 10mM Tris.cl(pH 7.5),15mM NaCl缓冲液中，水浴煮沸15分钟，缓慢冷却至室温。分装，20贮 藏备用。琼脂糖凝胶TBE缓冲液 耗材：离心管：1.5ml移液枪头：1ml,200l各若干（高压灭菌）吸水纸 离心管架4 实验步骤4.1 碱裂解法提取质粒DNA1）挑取一单菌落，接种于含50mg/L ampicillin的LB液体培养基上，37剧烈震荡培养 过夜。2）将1.5mL 培养物倒入微量离心管中，并将剩余的培养物贮存于4。用微量离心机4 以12,000g 离心30sec，吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。3）将细菌沉淀重悬于0.5mLSTE中，412,000g 离心 30sec。(如果对DNA 质量要求不 高，该步骤可省略)4）弃上清液。将细菌沉淀重悬于 100L 用冰预冷的溶液 I（SolutionI）中，剧烈震荡。5）加入200L 新配制的溶液II（Solution II），盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合 内容物，使离心管的整个内表面与溶液II 充分接触。6）加150L冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和震荡10sec使溶液III在粘稠 的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上35min。7）用微量离心机于4以12000g 离心5min，将上清液转移到另一离心管中。8）加等体积的（苯酚：氯仿）混匀后，用微量离心机于 4以12，000g 离心2min，将 上清液转移到另一离心管中。9）加入2倍体积的乙醇，室温放置2min。用微量离心机于4以12,000g 离心5min。10）弃上清，用1mL 70%的乙醇于4洗涤 DNA 沉淀，将离心管倒置于吸水纸上，室温 干燥。11）用50LTE重新溶解DNA 沉淀。加入 1LRNase，37保温23hrs。20保存。12)取5L 于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质粒 DNA 的质量。13)EcoRI 酶切，电泳检测插入片段大小是否正确。4.2煮沸裂解法提取质粒DNA101）将细菌沉淀重悬于350LSTET 中。2）加入25L 新配制的溶菌酶（10mg/mL,用10mmol/LTrisCl(pH8.0)配制），震荡3sec 混 匀。3）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰好为40sec.4)微量离心机于室温以120000g 离心10min。5）转移上清液于新的离心管，加入40L5mol/L 乙酸钠（pH5.2）和420L 异丙醇，混匀，于室温放置5min。6）4，120000g 离心5min，回收核酸沉淀。7）弃上清液，加入1mL70%的乙醇洗涤沉淀。8）室温干燥，50L TE或无菌水溶解沉淀。注：含有endA+基因型的菌株，如HB101，不宜用煮沸法提取质粒DNA，因为煮沸并不 能使核酸内切酶失活。4.3 用分光光度计法定量DNA1)取2l提取的质粒DNA，加入98L蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释)2)蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm 处调节紫外分光光度计读数至零。3)加入DNA稀释液，测定260nm及280nm的吸收值。260nm读数用于计算样品中核 酸的浓度，OD260值为1 相当于约 50g/ml双链DNA，33g/ml单链DNA。可根据 在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA 的 纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。4)记录OD 值，通过计算确定DNA 浓度或纯度，公式如下:dsDNA=50(OD260)稀释倍数 以上浓度单位为 g/ml。5 注意事项：用移液器（俗称“枪”）操作时，每一步都要格外小心，以免切碎 DNA(包括质粒DNA和基因组 DNA)加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，避免导致基因组DNA的断裂而污染质粒DNA！利用碱裂解法和煮沸法提取的质粒DNA能够满足一般的酶切、PCR分析等要求，但 对于一些 DNA 纯度要求比较高的实验，需要进一步提高质粒DNA 的纯度，可以通过CsCl梯度离心等方法进一步纯化 DNA。11实验四 实验四 目的基因的目的基因的PCR 扩增扩增1实验目的 学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法，并深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。2 实验原理 多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)，又称无细胞分子克隆法，是一种对 特定的DNA 片段在体外进行快速扩增的方法。是由 Kary.Mullis及同事1985年创立的，随后借助于热稳定性TaqDNA 聚合酶的发现，于1987年实现了自动化操作装置，使PCR技术进入实用阶段。1993年度，KaryMullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学 奖。PCR技术曾于1989年被美国Science杂志评为十项重大科学发明之首。PCR反应原理类似于 DNA 的变性和复制过程，即将待扩增的 DNA 片段和与其两侧互 补的两段寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后 DNA 扩增倍数可达2n倍。PCR反应系统的组成主要包括：引物、Taq DNA 聚合酶、4种dNTP、模板DNA、缓 冲液。1）引物：要扩增模板 DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序 列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物 的两个5末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，因此，引 物设计也就更为重要。引物的设计：1.长度一般最低不少于 16个核苷酸，而最高不超过30 个核苷酸，最佳长度为2024个核苷酸。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或 启动因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要。2.两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互 补碱基也不应大于 2 个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primerdimer）。3.G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引 物中（G+C）%含量应尽量相似。4.引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。引物在PCR反应中的浓度一般在0.11M之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生 非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环 的扩增反应，则会降低PCR的产率。引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢 固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性 产物增加。一般可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般试验中退火温度Ta(annealingtemperature)比扩增引物的融解温度Tm(meltingtemperature)低5，可按公式进行计算：12Ta=Tm 5=4(G+C)+2(A+T)5 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。引物延伸温度的选择取决于 DNA 聚合酶的最适温度。一般取7075，在72时酶 催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决 于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与 DNA 模板的性质。所以根据扩增片段长度的不同来 设计引物延伸的时间。对于1kb以上的 DNA 片段，可根据片段长度将延伸时间控制在17min。2）dNTP在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可 以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度 太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50200M，不能低于1015M。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。3）TaqDNA 聚合酶:TaqDNA 聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。典型PCR反应混合物中，所用酶 浓度为2.5U/L，常用范围为 14U/100L。由于DNA 模板的不同和引物不同，以及其 它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。4)模板 模板的种类：单、双链 DNA 或RNA 都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。对于模板的用量来说，虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，应采用ng 级的DNA。当使用高分子量的DNA（如基因组 DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用作模板。模板变性温度是决定PCR反应中双链 DNA 解链的温度，达不到变性温度就不会产生 单链DNA 模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA 双链会很快复性，因而减少产量。一般取9095。DNA变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之，在 高温时间应尽量缩短，以保持DNA 聚合酶的活力，加入TaqDNA 聚合酶后最高变性温度 不宜超过95。5）PCR缓冲液:用于PCR的标准缓冲液为1050mM的TrisHCl缓冲液（pH8.3）和1.5mMMgCl2。在72时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。Mg2+过量易 生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为110mmol/L。PCR循环次数 常规PCR循环次数一般为2540个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应13尽量减少循环次数。PCR扩增过程 在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板 DNA、四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐 热Taq聚合酶及两个合成DNA 引物，并有 Mg2+存在。其循环的温度取决于引物的Tm值、模板的种类以及聚合酶的耐热性。(1)变性阶段 加热使模板DNA 在高温下（9095）变性，双链解链；(2)退火阶段 降低溶液温度，使合成引物在低温（3570,一般低于模板Tm 值的5左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链；(3)延伸阶段 溶液反应温度升至中温(72)，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引 物为复制起点，模板 DNA 的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。3.实验仪器及材料 仪器：PCR仪、微量离心机、电泳仪、移液枪（10L,200L）、凝胶电泳系统等 试剂：dNTP、Taq酶、超纯水、模板DNA、引物（Primer1and2,10 M)琼脂糖、TBE缓冲液 耗材：离心管(0.5ml，高压灭菌)、枪头（200L）、PE手套4 实验步骤1）在0.5mL 的离心管中，加入下列体积的反应物（如果同时做多个反应，则应先将除DNA外的其它组分先混匀、分装，最后加入 DNA 样品）。PCRMixture:TemplateDNA:1L(10ng)Primer1:1L(10M)Primer2:1L(10M)dNTPs:1L(10mM)TaqDNApolymerase:0.5L(5U/L)10buffer:5LddH2O:40.5mL总体积50L2）将反应混合物于微量离心机上离心，混匀混合物。3）将反应管放入PCR基座的样品孔中（无热盖功能的PCR仪，需要在反应管中滴加12滴灭菌的石蜡油），设置好程序，进行PCR反应。PCR反应程序如下：94预变性5min 后开始以下循环；94变性45sec65退火45sec72延伸1min进行30个循环；14最后72反应7min；4 保温。4）PCR产物分析 采用1.2琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。5 作业1）绘制PCR产物的电泳图谱。2）讨论影响PCR反应的因素。15实验五实验五 DNA 回收纯化回收纯化1.实验目的和要求 学习、掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法，了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片 段的有关技术，为PCR产物的克隆创造条件。2.实验原理 在含有各种不同大小的DNA 混合物中，分离纯化特定分子量的 DNA 片段是基因工程 技术中的基本操作。DNA纯化的主要目的是回收得到纯化的目的DNA片段，去除影响DNA工具酶活性 的物质以及其它的DNA片段。如大多数级别的琼脂糖中混有硫酸酯多糖，这种物质能抑 制基因克隆中使用的多种工具酶的活性，如限制性内切酶、连接酶、激酶及聚合酶。纯化DNA 片段的方法有多种，如：从低熔点琼脂糖凝胶中回收、电洗脱法、玻璃珠纯化、柱 层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR 产物中或琼脂糖凝胶中 回收DNA 片段的试剂盒，有效地加快了 DNA 的纯化速度。本文只介绍低熔点琼脂糖凝胶 和硅胶树脂吸附回收、纯化 DNA 片段的方法。低熔点琼脂糖凝胶法：在琼脂糖的多糖侧链上引入羟乙基，成为低熔点凝胶。其凝固点降为30，在65条 件下可以熔化，这一温度低于大多数双链 DNA 的变性温度，保证 DNA 分子不变性，从而 可以将DNA 分子从凝胶中提取、纯化出来。硅胶树脂法：在NaI 存在的条件下，使含有DNA 片段的凝胶融化，使DNA 片段吸附于硅胶树脂上，最后用TEBuffer或灭菌水溶出DNA。3.实验材料与仪器：仪器：电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，离心机、酒精灯、刀片、灭菌离 心管、一次性塑料手套等。材料试剂：PCRFragmentRecoveryKit(Takala 产品)，成分为：硅胶树脂（SilicaMatrix），NaI 溶液，浓缩缓冲液PCR产物 琼脂糖，低熔点琼脂糖，电泳缓冲液TAE。4实验方法和步骤4.1 低熔点琼脂糖凝胶法1）灌注适当浓度的低熔点琼脂糖凝胶，于4条件下进行电泳以保证凝胶不熔化。2）用手提紫外灯确定条带的位置，用锋利的刀片切下含有目的条带的琼脂糖，转移至Eppendorf 管中。3）加入5 倍体积的 20mMTrisCl、1mMEDTA(pH8.0)，于65温育5min，以熔化凝 胶。164）待溶液冷却至室温，假如等体积的苯酚抽提，常温下4000g 离心10min，回收上 清液。再用苯酚：氯仿、氯仿各抽提一次。5）回收上清液，加入 0.2 体积的10M 的乙酸铵和 2倍体积的无水乙醇，室温放置 10min，离心获得 DNA 沉淀。6）70%乙醇洗涤沉淀，干燥后加入水溶解。4.2 硅胶树脂法 用DNA 回收试剂盒(PCRFragmentRecoveryKit,TaKaRa公司）回收特异 DNA 片段。操作步骤如下：1)样品用琼脂糖凝胶电泳后，将含目的 DNA 片段的凝胶块切出（约100mg）。2)将切下的凝胶块放入 1.5mL 离心管中。3)向反应管中加入600LNaI 溶液，55保温510min，使凝胶完全融化。4)加入15L 硅胶树脂，充分混合，室温放置 20min。5)10,000rpm离心1min。除去上清液。6)在反应管中加入500L 洗净用缓冲液，振荡搅匀后10,000rpm离心1min，除去上清液。此操作重复一次。7)离心后除净上清液，加入纯水后搅匀，55水浴 5min。8)10,000rpm离心1min，回收上清液。20保存备用。5 注意事项1）凝胶制作时尽量使用TAEbuffer，虽然TBEbuffer也可以使用，但此时的DNA 回收率 低于TAEbuffer。2）切胶时，尽量除去多余的胶块。3）为了保证回收DNA 的质量，尽可能使用高纯度的琼脂糖。17实验六实验六 TA 克隆克隆1 实验目的：学习、掌握TA 克隆的原理与操作技术，将PCR片段重组到T 载体中。2 实验原理DNA 重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段通过 DNA 连接酶的 作用插入到质粒载体中的过程。DNA 片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能 进行复制，从而大量的扩增目的DNA片段。多数的Taq DNA聚合酶能在扩增片段的3端增加一个A，因而可以通过T 载体将PCR片段克隆出来。DNA 连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA 连接酶和大肠杆菌DNA 连接酶。E.coliDNA连接酶催化 DNA 分子连接的机理与T4噬菌体DNA 连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。对于T4噬菌体 DNA 连接酶的活性测定至少有三种以上的方法：1.Weiss单位（Weiss等,1968），是指在37C下20分钟内催化1nM 32P从焦磷酸 根置换到,32PATP所需酶量；2.（NEB公司，粘性末端）将1g 由HindIII 酶解的 DNA 的12碱基对粘性末端 在10C条件下、30分钟、20l反应体系中连接50%时所需酶量。3.(Takara公司)在 20l的反应体系中，6g 的 DNAHindIII 的分解物在16C反应30分钟时，有90%以上的DNA 片段进行连接的酶的活性为1U。相当于 ATPPpi交换反应中0.008WeissU。连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37，此时连接酶 的活性最高。但37时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可 最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即 1216。3 实验材料与仪器 仪器：恒温水浴、恒温培养箱、移液器、超净工作台 材料：纯化的PCR片段、pGEMTeasyVector、感受态大肠杆菌 DH54 实验步骤4.1T 载体的制备 任何能产生唯一平端的质粒都可以用来制备TVector。1）在1.5mL 离心管中，加入：质粒DNA10g10EcoR