HEPES和NaHCO31640培养液的的影响.pdf

化学工程与装备C h e m i c a lE n g i n e e r i n g E q u i p m e n t2 0 0 8 年第9 期2 0 0 8 年9 月H E P E S 和N a H C 0 3 对R P M I 1 6 4 0 培养液的渗透压和p H 值的影响李岩松1 2，柳增善1，周玉1(1 人兽共患病教育部重点实验室，吉林长春1 3 0 0 6 2；2 吉林大学军需科技学院；吉林长春1 3 0 0 6 2)摘要：本文对实验室利用R P M I 1 6 4 0 干粉配制培养液时易忽视的渗透压和p H 值等因素进行了比较分析，提出配制培养液时对渗透压和p H 值控制的关键因素。关键词：R P M I l 6 4 0；培养液；渗透压；p H 值R P M I 1 6 4 0 培养液是杂交瘤技术制备单克隆抗体最常用的培养基之一。本文在R P M I 1 6 4 0 粉(不含H E P E S 和N a H C 0 3)按说明书配制培养液(以5 C 0 2 平衡为例)的基础上对H E P E S 和N a H C 0 3 的添加量、培养液p H 值和渗透压、血清渗透压等因素进行了对比分析。l 材料和方法1 1 材料1 1 1 主要试剂R P M I 1 6 4 0 粉(不含H E P E S 和N a H C 0 3)，G B I C O；H E P E S，A m r e s c o；N a H C 0 3、N a O H，国产分析纯；玻璃三蒸水；血清(某国产胎牛血清)；杂交瘤细胞株(本室冻存)1 1 2 主要器材C 0 2 培养箱(L i s h e n，香港)；渗透压仪(A d v a n c e d3 2 5 0，美国)；精密酸度计(P h s 3 C，上海雷磁)；玻璃蒸馏水器(S z 9 3，上海亚荣)；密立博滤器(0 2 2 岫，m 3 5 c m)；细胞培养板(C o s t a)；细胞培养瓶(玻璃)1 1 3 试剂配制培养基原液(按每袋培养基粉加水9 0 0 m l 溶解)，7 5 N a H C 0 3，1 m o l LN a O H，l m o 儿H E P E S，高压灭菌三蒸水，以上均滤过除菌。1 2 方法1 2 1 无H E P E S 和N a H C 0 3 的R P M I 1 6 4 0 基础培养液培养基原液：水(9：1)，测定p H 值和渗透压：1 2 2 血清的p H 值和渗透压某国产胎牛血清(两个批号)直接测定其p H值，并通过冰点渗透压仪直接测定渗透压。1 2 3 按说明书添加N a H C 0 3 的R P M I 一1 6 4 0 基础培养液根据培养基粉说明书，按每袋培养基粉添加2 9 N a H C o。，加水至1 L(用N a o H 调p H 值至7 4)，测定渗透压。1 2 4N a H C Os 与p H 值和渗透压的关系按1 2 1 方法配制基础培养液，并按0 5、1 0、2 0、3 O、4 0g L 的比例添加N a H C Os，分别测定p H 值和渗透压。以加入N a H C o s 的体积数为横坐标，渗透压和p H 值为纵坐标，分别做N a H C O。渗透压和N a H C Os p H 坐标图。1 2 5N a o H 与p H 值和渗透压的关系按1 2 1 方法配制基础培养液，并按1 O、2 0、3 O、4 0、5 0 m l L 的比例添加N a O H，分别测定p H 值和渗透压。以加入N a 0 H 的体积数为横坐基金项目：国家自然科学基金资助项目(3 0 7 7 1 6 5 7，3 0 6 7 1 7 6 2)万方数据李岩松，H E P E S 和N a H c 嘎对R P M I 1 6 4 0 培养液的渗透压和p H 值的影响4 l标，渗透压和p H 值为纵坐标，分别做N a o H-渗透压和N a O H p H 坐标图。1 2 6N a H C Oa、H E P E S 对培养液渗透压和p H 的影响按1 2 1 方法配制基础培养液，设1 5 9 L、2 0 9 L、2 5 9 L 三个N a H C Os 添加浓度，每个N a H C O。添加浓度再设1 0、1 5、2 0、2 5 m m o l L四个H E P E S 添加浓度，分别用1 m o l LN a o H 调p H 值至7 4，测定渗透压。1 2 7 培养液质量的评价通过细胞生长曲线评价培养液的质量。分别将1 2 3(样品编号1 3)和1 2 6(样品编号l 1 2)所配基础培养液，加入1 5 血清，测定p H 值和渗透压。分别用上述培养液将杂交瘤细胞稀释至1 0 4个m L，各取lm L 加入2 4 孔板，并在3 7，5 C 0 2图lN a H c 0 3、N a 0 H 与p H 值的关系lR e 蜥N a H o qo r N 删a n d p Hv a l 嵋R c 衄i o nb e t W e e n7 5 N a H C 0 3 锄dp Hv a l 鹏oI k l a t i o nb e t v 睇nl m 0 1 I。N a O H 锄dp Hv a J u e2 3N a H C O s、H E P E S 对培养液渗透压和p H 的影响加入不同浓度N a H C o s 和H E P E S 后，基础培养箱中培养一周，绘制杂交瘤细胞生长曲线，以此评价各培养液质量。2 结果与分析2 1R P M I 1 6 4 0 基础培养液(无H E P E S 和N a H C 0 3)及血清的p H 值和渗透压无H E P E S 和N a H C 0 3 的R P M I 1 6 4 0 基础培养液的p H 值为7 2、渗透压为2 2 6 m O s n l l(g：血清的p H 值为7 0、渗透压2 3 0 m O s m I(g。其中仅血清的渗透压与产品标识不符(2 8 0 3 4 0m O s 删傲g)。2 2N a H c O。及N a o H 与p H 值和渗透压的关系测定结果见图1 和图2。从图中可以看出在p H 7 0 8 O 之间，用7 5 N a H C 0 3 调节培养液的p H 值时所需的量多，且对培养液渗透压影响也大；用l NN a O H 调节培养液的p H 值时所需的量少，且对培养液渗透压影响也小。图2N a H C 0 3、N a o H 与渗透压的关系F 毽2 R c l 砸b e“僦n N a 配0 30 f N 扣H a n d 啁f r 刚c 脚潞u 陀R e h t i o nb e t w n7 5：N a H C 0 3 锄do 锄o t i cp r c s s 呲R c l a l i b 时w e e nl m o l L N a o H 锄d o 锄。如p r c s s 峨培养液的渗透压结果及加入1 5 血清的培养液渗透压和p H 结果见表l。表lN a H C O，、H E P E S 对培养液渗透压和p H 的影响墅垒：!曼墼!堡2 1 壁呈星兰竺皇型坐竺Q 2 丝旦!里旦!i!仑堡!竺堡塑璺巳曼2 1 1 竺!坐堡坐!璺!竺翌I t e mS a m p l eN o N 努菡岛蒸勰篆爱，篓酣o s m m 搀勰，(a d d e d(圳(眦0 儿蕊m 等；念捌蕊)s 船1 5 聪一N o 1N o 2N o 3N 0 41 51 51 51 51 01 52 02 57 47 47 47 42 6 32 6 92 7 22 7 77 27 27 27 22 5 82 6 l2 6 42 7 0万方数据4 2李岩松tH E P E s 和N a H c 嘎对R P M I 1 6 4 0 培养液的渗透压和p H 值的影响2 4 通过细胞生长曲线评定所配制的培养液质量分别将1 2 3 和1 2 6 所配基础培养液，杂交瘤细胞生长曲线结果见图3。其中7、6、5 号三个样品培养基效果较好。可见不同H E P E S 和N a H C o。配比对细胞生长确有影响，实验中应根据所用试剂，通过预试而确定最佳配比。3 讨论3 1 培养液的p H 值细胞培养最适p H 值随培养的细胞种类不同而不同，大多数培养细胞的适宜p H 值为7 2 7 4，多数培养液靠N a H C 0 3 与C 0 2 体系进行缓冲维持p H 值，因此，气相中的C 0 2 浓度应与培养液中N 州C 0 3 浓度相对应。如果气相或培养箱空气中C 0 2 浓度设定在5，培养液中N a H C 0 3 的加入量应为1 9 7 9 L L z J。然而利用N a H C 0 3 和C 0 2 缓冲对的培养液p H 值非常不稳定，储存或暴露一定时间后容易偏碱。3 2 培养液的渗透压细胞需在适当的渗透压环境中生长，渗透压是培养基必要的质量控制项目。但由于渗透压仪价格较高，一般单位都不具备随时检测的条件，因而渗透压参数在实验中往往被忽视。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在2 6 0 3 2 0 m o s 觚g的范围都能生长。一般认为小鼠细胞渗透压在3 2 0 m o s 删蚝左右例。G I B C OI 冲M I 16 4 0 于粉按说明书配制并调p H 值后的渗透压一般保持在2 6 8 左右，加入血清(一般产品说明均在2 8 0 3 4 0 m o s m l(g 之间)后，渗透压会有上升，刚好在细胞生长合适的渗透压范围之内。3 3N a o H 和N a H C os 与p H 值和渗透压的关系通过N a o H 和N a H C os 都可调节培养液的p H 值，但用N a H C os 调节培养液的p H 值时，会对渗透压有较大的影响。尤其是在加入脏P E S图3 杂交瘤细胞生长曲线F i g 3G r o w c hc u r v e so f h y b r i d o m ac e l lN o t c：A c c o r d i n gt 0t h ea p o g e eo fg m w t hc u n，e sf 如mt l l et o pd o、v I l：S 啪p l e N o 7、6、5、4、1 2、l l、l O、9、8、l、1 3、3、2时，需要加入较多的N a H C o。调节培养液的p H值，对培养液的渗透压影响更为明显。而用N a O H调节培养液的p H 值时，对渗透压的影响很小。因此，一般在加入H E P E S 时，都是通过N a O H来调节培养液的p H 值【l J。3 4H E P E S 对培养液p H 值和渗透压的影响髓P E S 是一种非离子两性缓冲液，在p H7 2 7 4 范围内具有较好的缓冲能力，一般在添加浓度1 0 2 0 n u n o 儿时对细胞没有毒性。但H E P E S 是一种酸，加入培养液后应该用N a o H 调节p H 值至所需范围，或直接加入已调好p H 值的H E P E S N a o H。同时，H E P E S 的加入还在一定程度上提高了培养液的渗透压【2 1。表l 列出了几种不同H E P E S 和N a H C 0。的比例对培养液渗透压的影响情况(可能因为试剂不同而有差异)。在细胞培养基中添加H E P E S 后培养液呈橘红色，细胞生长过程中培养基的颜色变化不大。3 5 血清对培养液p H 值和渗透压的影响本实验所用国产血清p H 值为7 0、渗透压为2 3 0 m o s I I l k g(实测)，加入培养液后出现了渗透万方数据李岩松。既P E S 和N a H c 喝对R P M I 一1 6 4 0 培养液的渗透压和p H 值的影响4 3压下降的情况。一般血清产品的p H 值在7 O 7 4左右，渗透压在2 6 0 3 4 0 m O s m l(g 之剐1 4。鉴于一般细胞对渗透压的要求在2 6 0 3 2 0 m o s m I(g 的实际【2 j 和国外相关血清产品的渗透压指标【4】，国产血清亦应增加渗透压指标并控制在2 6 0 3 4 0 m O s m l(g 之间例。3 6 不同H E P E S 和N a H C o。配比的培养液细胞生长曲线从图3 可以看出不同H E P E S 和N a H C Oa 配比的培养液对杂交瘤细胞生长的影响。其中添加N a H C 0 32 9 L，H E P E Sl O 2 0 m m o l L 时细胞生长较佳，而H E P E S2 0 m m o l L 时细胞生长最好。但是由于H E P E S 价格很高，在不影响实验效果的情况下可以酌情添加。本实验所用血清渗透压较低，对培养液的影响较大，故可能在一定程度上影响细胞生长，但(上接第4 8 页)所绘细胞生长曲线仍可代表不同H E P E S 和N a H C os 配比培养液对细胞生长的效果。其中1 3号培养液(按说明书配制)细胞生长不佳应为本实验所用血清渗透压过低所致。参考文献【l】北京清大天一生物技术有限公司清大天一细胞培养基手册2 0 0 7【2】生物谷生物在线的实验方法频道实用哺乳动物细胞培养手册【3】天津市灏洋生物制品科技有限责任公司血清在细胞培养中的作用和质量要求【4】S i g m a-A l 州c hC o【5】国家药典委员会编中华人民共和国药典北京：化学工业出版社，2 0 0 5：9 4 参考文献【l】陈渭民卫星气象学北京：气象出版社，2 0 0 3 f 2 1E s a i a sW E，M R A b b o t t，I B a n o n，o B B r o w n，J W：C a m p b e l l，K L C a r d e r，D K C 1 a d(，R H E v a n s，F E H o g e，H R G o r d o n，、M M B a l c h，R L e t e l i e r，a n dP J M i m l e 仕，19 9 8：A no v e r v i e wo fM o D l Sc a p a b i l i t i e sf o ro c e a I ls c i e n c eo b s e r v a t i o n s I E E ET 1 a n s G e o s c&R e n l o t eS e n s i I l g，3 6(4)，p l，2 5 0 1，2 6 5 f 3 1M e I l z e lW P，S w S e 锄舢，J“，a n dL-E(上接第5 2 页)G u m l e y，2 0 0 2：M O D I SA t m o s p h e r i cP r o f i I eR e n 沁V a lA l g o r i l mT h e o r e t i c a lB 捌sD o c 岫e n t，V e r s i o n6，U n i V e r s i t)，o fW i s c o n s i n M a d i s o n，o c t o b e rl0，2 0 0 2 4】傅克付，曾宪模，任敬萍，荒川久幸，佐藤博雄由现场离水辐亮度估算黄海透明度几种方法的比较 J】黄渤海海洋，1 9 9 9；(0 2)【5】金亚秋电磁散射和热辐射的遥感理论，北京：科学出版社，1 9 9 3 只有信号有短时的平稳特性，就很可能求出正确的参数。这一点可以从3 2 的实验中看出，同样的信号截取不同段进行分离，各个方法的效果就很不一样。因此，如果要用这些算法来处理非平稳性好，就要充分利用信号的短时平稳性(这也是语音信号处理的基础之一)，充分利用平稳信号端来进行处理。参考文献 1 D a v i d S A 1 b e r t，J o h n J G a r s t k a，F r e d e ric k P S t ei n N e t w o r kc e n t r i cw a r f a r e，d e v e l o p i n ga n dl e v e r a g i n gi n f o r m a t i o ns u p e r i o r i t y2 n dE d i t i o n R 1 9 9 9 2 蔡自兴人工智能及其应用北京：清华大学出版社。1 9 9 6 3 张贤达，保铮盲信号分离 J 电子学报，V 0 1 2 9，N o 1 2 A，2 0 0 l；(1 2)万方数据HEPES和NaHCO3对RPMI-1640培养液的渗透压和pH值的影响HEPES和NaHCO3对RPMI-1640培养液的渗透压和pH值的影响作者：李岩松，柳增善，周玉作者单位：李岩松(人兽共患病教育部重点实验室,吉林,长春,130062;吉林大学军需科技学院,吉林,长春,130062)，柳增善,周玉(人兽共患病教育部重点实验室,吉林,长春,130062)刊名：化学工程与装备英文刊名：CHEMICAL ENGINEERING EQUIPMENT年，卷(期)：2008，(9)被引用次数：0次 参考文献(5条)参考文献(5条)1.北京清大天-生物技术有限公司 清大天-细胞培养基手册 20072.生物谷生物在线的实验方法频道.实用哺乳动物细胞培养手册3.天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 血清在细胞培养中的作用和质量要求4.Sigma-Aldrich Co5.国家药典委员会 中华人民共和国药典 2005 相似文献(10条)相似文献(10条)1.学位论文 白奕华 氧化型染发剂对人肾小管上皮细胞损伤及凋亡的影响 2007 染发剂被用于美化人们的生活已经有几百年的历史，国内外均有因使用染发剂导致原有肾脏病加重或新发生肾脏病的报道，以及误服染发剂导致急性肾功能衰竭、甚至死亡的例子。本实验以氧化型染发剂的两种不同主要成分作为干预物质，模仿染发工序处理干预物质，然后观察此两种物质分别对人肾小管上皮细胞(human kidneycells,HK-2 cells)的增殖能力，损伤及凋亡的影响。目的 探讨氧化型染发剂中两种不同成分分别对肾小管上皮细胞增殖能力，损伤及凋亡的影响，并作比较。方法 采用对数生长期的人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞株)，分别加入不同浓度的两种不同染发剂成分孵育12小时和24小时。本实验共分14组：1空白对照组(无血清的RPMI-1640培养液)；2双氧水组(0.03H2O2)：3PAP组(根据PAP不同浓度，以及是否与H2O2混合又分为6个亚组)：(1)PAPl组(无血清的RPMI-1640培养液+对氨基苯酚40ug/ml)；(2)PAP2组(无血清的RPMI-1640培养液+对氨基苯酚4ug/ml)：(3)PAP3组(无血清的RPMI-1640培养液+对氨基苯酚0.4ug/ml)：(4)PAPlH组(无血清的RPMI-1640培养液+对氨基苯酚40ug/ml+0.03H2O2)；(5)PAP2H组(无血清的RPMI-1640培养液+对氨基苯酚4ug/ml+0.03H2O2)；(6)PAP3H组(无血清的RPMI-1640培养液+对氨基苯酚0.4ug/ml+0.03H2O2)；4、PPD组(根据PPD不同浓度，以及是否与H2O2混合又分为6个亚组)：(1)PPDl组(无血清的。RPMI-1640培养液+对苯二胺40ug/ml)；(2)PPD2组(无血清的RPMI-1640培养液+对苯二胺4ug/ml)：(3)PPD3组(无血清的RPMI-1640培养液+对苯二胺0.4ug/ml)：(4)PPDlH组(无血清的RPMI-1640培养液+对苯二胺40ug/ml+0.03H2O2)：(5)PPD2H组(无血清的RPMI-1640培养液+对苯二胺4ug/ml+0.03HO)：(6)PPD3H组(无血清的RPMI-1640培养液+对苯二胺0.4ug/ml+0.03HO)：四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞的增殖能力，观察不同干预物质在不同浓度不同作用时间下对HK-2细胞的增殖能力的影响；测定培养液中LDH值，观察比较不同干预物质在不同浓度不同时间下对HK-2细胞损伤的影响；碘化丙啶染色(PI)流式细胞仪(FCM)分析检测肾小管上皮细胞的凋亡率；RT-PCR法检测Caspase-3 mRNA的表达水平；扫描电镜观察不同物质干预后HK-2细胞形态的改变。结果 1氧化型染发剂对HK-2细胞作用12小时和24小时的MTT结果：(1)各实验组与对照组比较A492值均有明显下降(P0.01)，且呈时间依赖性。(2)PAP1组较PAP2组及PAP3组A值均明显下降(P0.01)，12h时PAP2组和PAP3组间A值无明显差别(P0.05)，24h时PAP2组较PAP3组A值明显下降(P0.01)；PAP1H组、PAP2H组、PAP3H组A值依次明显升高(P0.01)；对氨基苯酚(PAP)与0.03双氧水的混合物作用于HK-2细胞比相同浓度的对氨基苯酚(PAP)或0.03双氧水单独作用于HK-2细胞其A值下降更明显(P0.01)。(3)PPD1组较PPD2组及PPD3组A值均有明显下降(P0.01)，PPD2组和PPD3组在12h和24h时A值均无明显差别(P0.05)：PPDlH组、PPD2H组、PPD3H组A值依次明显升高(P0.01)；对苯二胺(PPD)与0.03双氧水的混合物作用于HK-2细胞比相同浓度的对苯二胺(PPD)或0.03双氧水单独作用于HK-2细胞其.A值下降更明显(P0.01)。(4)相同浓度对氨基苯酚(PAP)单独作用HK-2细胞比对苯二胺(PPD)单独作用HK-2细胞其.A值下降更明显(P0.01)；与0.03双氧水混和后，相同浓度对氨基苯酚(PAP)比对苯二胺(PPD)作用HK-2细胞其A值下降更明显(P0.01)。2.氧化型染发剂对HK-2细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(I,DH)12小时及24小时的影响：(1)各实验组与对照组比较培养液中乳酸脱氢酶均有明显上升(P0.01)，且呈现时间依赖性。(2)PAP1组、PAP2组、PAP3组乳酸脱氢酶依次明显下降(P0.01)：PAP1H组、PAP2H组、PAP3H组乳酸脱氢酶依次明显下降(P0.01)；PAP1H组较PAP1组，PAP2H组较PAP2组，PAP3H组较PAP3组乳酸脱氢酶均有明显升高(P0.01)；PAP与0.03双氧水的混合物作用于HK-2细胞比0.03双氧水单独作用于HK-2细胞其培养液中乳酸脱氢酶升高更明显(P0.01)。(3)PPD1组较PPD2组及PPD3组乳酸脱氢酶均有明显上升(P0.05)；PPDlH组、PPD2H组：PPD3H组乳酸脱氢酶依次明显下降(P0.01)：PPD1H组较PPD1组，PPD2H组较PPD2组，PPD3H组较PPD3组乳酸脱氢酶均有明显升高(P0.01)；PPD与0.03双氧水的混合物作用于HK-2细胞比0.03双氧水单独作用于HK-2细胞其培养液中乳酸脱氢酶升高更明显(P0.01)。(4)相同浓度对氨基苯酚(PAP)单独作用HK-2细胞比对苯二胺(PPD)单独作用HK.2细胞其细胞培养液中LDH值上升更明显(P0.01)；与0.03双氧水混和后，相同浓度对氨基苯酚(PAP)比对苯二胺(PPD)作用HK-2细胞其细胞培养液中LDH值上升更明显(P0.01)。3.氧化型染发剂对HK-2细胞作用12h的凋亡率的影响：(1)染发剂干预的各实验组与对照组比较细胞凋亡率均有升高(P0.05)。(2)PAP1组、PAP2组、PAP3组细胞凋亡率依次明显降低(P0.05)，PAPlH组、PAP2H组、PAP3H组细胞凋亡率依次明显降低(P0.05)，且PAP1H组较PAP1组，PAP2H组较PAP2组，PAP3H组较PAP3组细胞凋亡率均有明显上升(P0.05)。(3)PPD1H组、PPD2H组、PPD3H组细胞凋亡率依次明显降低(P0.05)，且PPD1H组较PPD1组，PPD2H组较PPD2组，PPD3H组较PPD3组细胞凋亡率均有明显上升(P0.05)。(4)相同浓度的对氨基苯酚(PAP)单独作用与对苯二胺(PPD)单独作用于HK-2细胞比较，表现为PAP作用的细胞凋亡率升高更加明显(P0.05)。4.氧化型染发剂对HK-2细胞作用12h的Caspase-3 mRNA表达的影响。5.氧化型染发剂作用12h对HK-2细胞形态的影响。结论：1.氧化型染发剂中对氨基苯酚(P-Aminophenol，PAP)和对苯二胺(P-phenylenediamine，PPD)在0.440ug/ml浓度范围内，作用于HK-2细胞12h和24h，均可抑制细胞增殖；与0.03双氧水混和后，PAP和PPD抑止细胞增殖的能力均更明显，且呈浓度、时间依赖性；在完全相同处理条件下(是否与双氧水混合)，相同浓度的PAP对细胞的抑制作用明显强于PPD。2.氧化型染发剂中对氨基苯酚(P-Aminophenol，PAP)和对苯二胺(P-phenylenediamine，.PPD)在0.440ug/ml浓度范围内，作用于HK-2细胞12h和24h，均可促进细胞损伤；与0.03双氧水混和后，PAP和PPD促细胞损伤的能力均更明显，且呈浓度、时间依赖性；在完全相同处理条件下(是否与双氧水混合)，相同浓度的PAP对细胞促损伤作用明显强于PPD。3.氧化型染发剂中对氨基苯酚(P-Aminophenol，PAP)和对苯二胺(P-phenylenediamine，PPD)在0.440ug/ml浓度范围内，作用于HK-2细胞12h，均可促细胞凋亡；与0.03双氧水混和后，PAP和PPD的促细胞凋亡作用均更明显，且呈浓度依赖性；在完全相同处理条件下(是否与双氧水混合)，相同浓度的PAP比PPD的促细胞凋亡作用更明显。4.氧化型染发剂中对氨基苯酚(P-Aminophenol，PAP)和对苯二胺(P-phenylenediamine，PPD)在40ug/ml浓度，作用于HK-2细胞12h，对细胞外观形态均有影响，与0.03双氧水混和后，两物质对HK-2细胞外观形态的影响更加明显，在完全相同处理条件下(是否与双氧水混合)，PAP对HK-2细胞外观形态的影响强于PPD。2.期刊论文 杨丽霞.余鹰翔.陈国苍.郑祥榕.Yang LX.Yu YX.Chen GC.Zheng XR 深低温+100%甘油+RPMI 1640合成细胞培养液保存羊膜联合角膜缘干细胞移植在眼表重建中的应用-中国组织工程研究与临床康复2007,11(46)目的:评价深低温+100%甘油+RPMI 1640合成细胞培养液保存羊膜联合角膜缘干细胞移植在重建眼表结构中的治疗效果.方法:实验对象:选取解放军南京军区福州总医院眼科中心20002006年收治的严重眼表烧伤患者29例34眼.实验经医学伦理委员会批准,剖腹产孕妇的胎盘由本院妇产科提供,孕妇均签署知情同意书.离体6 h以内的同种异体新鲜角膜由福建省红十字会提供.实验方法:钝性分离羊膜与绒毛膜,将羊膜上皮面朝上平铺于去除胶面的眼科手术薄膜纸片上,剪成3 cm4 cm大小,置于100%甘油+RPMI 1640合成细胞培养液各5 mL的无菌小瓶中,-80冷藏备用.在供体眼球角膜缘前1 mm处透明角膜上、角膜缘后2 mm处巩膜上作适当深度的环形划界,然后剖出带有浅层基质的角膜缘上皮移植片备用.严重眼表烧伤组织,将备好的羊膜植片上皮面朝上平铺于眼表面,依结膜缺损区大小修剪,缝合固定于近角膜缘的浅层巩膜上,使羊膜紧贴于角膜表面,然后将羊膜边缘与球结膜对位缝合.再将备好的角膜缘上皮移植片与植床角膜缘对位固定缝合.此外,4眼伴轻度眼睑闭合不全者同时行眼睑缘粘连性缝合.结果:严重眼表烧伤患者29例34眼中,除眼睑缘粘连性缝合的4眼外,余30眼(88.24%)术后714 d角膜水肿消退,1421 d上皮修复角膜全表面,结膜表面光滑,无感染发生;术后36个月角膜新生血管明显减少,角膜透明度改善,视力提高35行;经过22.8个月随访,眼表面稳定.睑缘粘连性缝合的4眼(11.76%)发生羊膜植片急性排斥反应,羊膜融解,改行深板层角膜移植,2个月后观察眼表亦光滑,无睑球粘连发生.结论:深低温+100%甘油+RPMI 1640合成细胞培养液保存羊膜联合角膜缘干细胞移植手术,既发挥了羊膜的生物学特性,又提供了角膜缘活性细胞,能快速、稳定促进角膜更新机制的恢复,加速角膜表面重新上皮化,是治疗严重眼表烧伤有效、可行的手术方式.3.学位论文 柯茂林 5-脱氧杂氮胞苷对Hep G细胞生长速度、生长周期、分泌免疫抑制因子的影响及对裸鼠肿瘤模型P53基因蛋白表达的影响 2005 目的：人肝癌细胞株HepG2培养于RPMI-1640培养液中，加用5-脱氧杂氮胞苷混合培养后，测定人肝癌细胞株HepG2的细胞生长速度、生长周期、细胞调亡率，与未经5-脱氧杂氮胞苷处理的人肝癌细胞株HepG2的生长速度、生长周期、细胞调亡率比较，以观测5-脱氧杂氮胞苷对人肝癌细胞株HepG2细胞生长速度、生长周期、细胞调亡率的影响。人肝癌细胞株HepG2培养于RPMI-1640培养液中，加用5-脱氧杂氮胞苷混合培养后，测定人肝癌细胞株HepG2细胞分泌免疫抑制因子的活性，与未经5-脱氧杂氮胞苷处理的人肝癌细胞株HepG2细胞分泌免疫抑制因子的活性比较，研究5-脱氧杂氮胞苷培养HepG2后细胞分泌免疫抑制因子的活性变化，观测5-脱氧杂氮胞苷对人肝癌细胞株HepG2细胞分泌免疫抑制因子的影响。人肝癌细胞株HepG2培养于RPMI-1640培养液中，以肝癌细胞株HepG2建立裸鼠肿瘤模型，以5-脱氧杂氮胞苷处理裸鼠肿瘤模型，测定肿瘤抑制率及p53蛋白表达，与未经5-脱氧杂氮胞苷处理的裸鼠肿瘤模型的肿瘤抑制率及p53蛋白表达比较，研究5-脱氧杂氮胞苷处理裸鼠肿瘤模型后肿瘤抑制率及p53蛋白表达的变化，观测5-脱氧杂氮胞苷对裸鼠肿瘤模型肿瘤生长及p53蛋白表达的影响。人肝癌细胞株HepG2培养于RPMI-1640培养液中，加用5-脱氧杂氮胞苷混合培养后，分别提取DNA进行甲基化特异PCR法测定，观测5-脱氧杂氮胞苷对HepG2P15基因甲基化的逆转作用。通过以上研究，观测5-脱氧杂氮胞苷对人肝癌细胞株llepG2生长速度、生长周期、细胞调亡率、分泌免疫抑制因子的影响及对裸鼠肿瘤模型肿瘤抑制率及p53蛋白表达的影响，阐明基因甲基化及其变化对恶性肿瘤的影响。方法：人肝癌细胞株HepG2培养于RPMI-1640培养液中，实验组加用5-脱氧杂氮胞苷混合培养，测定细胞生长速度、生长周期、细胞调亡率；对照组不加用5-脱氧杂氮胞苷，以单纯RPMI-1640培养液培养，测定细胞生长速度、生长周期、细胞调亡率。人肝癌细胞株HepG2培养于RPMI-1640培养液中，实验组加用5-脱氧杂氮胞苷混合培养，测定细胞分泌免疫抑制因子活性；对照组不加用5-脱氧杂氮胞苷，以单纯RPMI-1640培养液培养，测定细胞分泌免疫抑制因子活性。人肝癌细胞株HepG2培养于RPMI-1640培养液中，以肝癌细胞株HepG2建立裸鼠肿瘤模型，实验组经5-脱氧杂氮胞苷处理，检测肿瘤抑制率及p53蛋白表达；对照组不经5-脱氧杂氮胞苷处理，检测肿瘤抑制率及p53蛋白表达。人肝癌细胞株HepG2培养于RPMI-1640培养液中，加用5-脱氧杂氮胞苷混合培养后，分别提取DNA进行甲基化特异PCR法测定。结果：与单独RPMI-1640培养液培养的细胞株比较，加用5-脱氧杂氮胞苷混合培养后，人肝癌细胞株HepG2细胞生长速度减慢，细胞凋亡率增高。与单独RPMI-1640培养液培养的细胞株比较，加用5-脱氧杂氮胞苷混合培养后，细胞分泌的免疫抑制因子的活性降低。与未经5-脱氧杂氮胞苷处理的对照组比较，5-脱氧杂氮核苷处理后，裸鼠肿瘤模型肿瘤生长速度减慢，p53蛋白表达显著性增加。与单独RPMI-1640培养液培养的细胞株比较，加用5-脱氧杂氮胞苷混合培养后，甲基化特异PCR法测定中电泳条带中出现了U带且较明显。结论：5-脱氧杂氮胞苷具有扭转HepG2抑癌基因甲基化的作用，通过降低抑癌基因的高甲基化状态抑制了人肝癌细胞株HepG2的生长，使其恶性降低，细胞生长减慢，细胞凋亡率增高，细胞分泌的免疫抑制因子的活性降低，裸鼠肿瘤模型肿瘤生长速度减慢，p53蛋白表达显著性增加，以此证实抑癌基因的高甲基化状态与恶性肿瘤的相关性关系，并为恶性肿瘤的治疗提供一个新思路。4.期刊论文 袁丽英.张壮志.石保新.米晓云.阿布都.阿依努尔.张玲.阿布里克木.王进成.岳城.张文宝.YUAN Li-ying.ZHANG Zhuang-zhi.SHI Bao-xin.MI Xiao-yun.ABUDU.AYINUER.ZHANG Ling.ABULIKEMU.WANG Jin-cheng.YUECheng.ZHANG Wen-bao 细粒棘球绦虫原头蚴在两种细胞培养液中体外培养的初步观察-畜牧兽医杂志2008,27(5)通过原头蚴在两种细胞培养液中(RPMI-1640和MEM)培养,观察其存活、生长及发育情况,从而为研究寄生虫发育提供最基本的数据资料.方法:细粒棘球绦虫幼虫-原头蚴培养的细胞培养基(RPMI-1640和MEM)分为4组:组为纯RPMI-1640培养液;组为含10%的小牛血清的1640培养液;组为纯MEM培养液;组为含10%的小牛血清的MEM培养液;并进行对比观察.结果:培养15 d的原头蚴的成活率分别为:组69.87%、组80.35%、组50.25%、组60.32%;成囊率分别为:组80.58%、组90.25%、组35.65%、组45.89%;头节外翻率分别为:组95.50%、组98.65%、组60.52%、组70.98%.结论:大多数虫体在早期向囊发育,一部分虫体头节外翻,并伴有规律的伸缩运动,但随时间的延长虫体运动减缓,又向囊蚴发育.通过对细粒棘球绦虫的原头蚴的体外培养,初步表明含有10%小牛血清的细胞培养基RPMI-1640较适合原头蚴的生长发育,在普通培养箱中培养,最适温度在3740,培养液pH=7.2,初步建立了原头蚴体外培养的方法.5.期刊论文 钟泉.闫福华.李艳芬.Zhong Quan.Yan Fuhua.Li Yanfen 两种培养液对Beagle犬牙龈成纤维细胞生物学活性的影响-医学研究杂志2010,39(8)目的 探讨两种常见培养液:DMEM和RPMI1640对Beagle犬牙龈成纤维细胞生物学活性的影响.方法 使用半消化+改良组织块法原代培养Beagle犬牙龈成纤维细胞,了解两种培养液下Beagle犬牙龈成纤维细胞游出成功率的差异;使用MTT、流式细胞仪检测两种培养液下细胞增生的情况;使用免疫细胞化学的方法检测两种培养液下Beagle犬牙龈成纤维细胞体外表达型胶原的差异.结果 DMEM和RPMI1640对Beagle犬牙龈成纤维细胞的游出成功率、增生以及型胶原的表达均无显著性差异.结论 DMEM和RPMI1640两种培养液均适合Beagle犬牙龈成纤维细胞的培养.6.期刊论文 郭涛.何明生.王廷华.庞江霞.Guo Tao.He Ming-sheng.Wang Ting-hua.Pang Jiang-xia 不同培养基和不同体积分数小牛血清对许旺细胞生长状态的影响-中国组织工程研究与临床康复2009,13(23)背景:许旺细胞目前正越来越多地被运用于神经修复、构建载体细胞等,但如何高效快速地培养获取大量许旺细胞尤为关键.传统方法存在细胞培养周期长、污染率高、生长状况不稳定等不足.目的:观察比较不同培养基和培养基中不同体积分数血清对许旺细胞的生长、增殖能力的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/07在昆明医学院神经科学研究所完成.材料:SPF级新生一两天龄ICR小鼠30只,由昆明医学院动物科提供.DMEM/F12培养液、RPMI 1640培养液、L-DMEM培养液为Gibco公司产品,小牛血清为Hyclone公司产品.方法:取ICR新生小鼠,无菌条件下取出坐骨神经,组织块消化法体外分离培养许旺细胞,设立4组:DMEM/F12培养液组、RPMI 1640培养液组、L-DMEM