核酸提取及琼脂糖电泳.pdf

核酸提取及琼脂糖电泳核酸是遗传信息的载体，是最重要核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作基本的操作。DNA提取的几种方法提取的几种方法染色体染色体DNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它基因组基因组DNA CTAB法法CTAB法原理（植物法原理（植物DNA提取经典方法）提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。基因组基因组DNA CTAB法法CTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方20 mMEDTA（pH8.0）0.1%（V/V）使使用前加入用前加入2%(W/V)1.4M100 mM终浓度终浓度-巯基乙醇巯基乙醇CTABNaClTris-HCl （pH8.0）组份组份20 mMEDTA（pH8.0）0.1%（V/V）使使用前加入用前加入2%(W/V)1.4M100 mM终浓度终浓度-巯基乙醇巯基乙醇CTABNaClTris-HCl （pH8.0）组份组份Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除CTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方5%(W/V)PVP4020 mMEDTA（pH8.0）2%（V/V）使用前加入使用前加入3%(W/V)1.4M100 mM终浓度终浓度-巯基乙醇巯基乙醇CTABNaClTris-HCl（pH8.0）组份组份5%(W/V)PVP4020 mMEDTA（pH8.0）2%（V/V）使用前加入使用前加入3%(W/V)1.4M100 mM终浓度终浓度-巯基乙醇巯基乙醇CTABNaClTris-HCl（pH8.0）组份组份PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。糖结合，有效去除多糖。CTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNASDS法法SDS是一种阴离子去垢剂是一种阴离子去垢剂，在高温在高温（5565）条件下能裂解细条件下能裂解细胞胞，使染色体离析使染色体离析，蛋白变性蛋白变性，释放出核酸；释放出核酸；提高盐提高盐(KAc或或NH4Ac)浓度并降低温度浓度并降低温度（冰浴冰浴），使蛋白质及多糖使蛋白质及多糖杂质沉淀杂质沉淀，离心后除去沉淀；离心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法原理法原理 SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液20 mMEDTA（pH 8.0）2%0.4M10 mM终浓度终浓度SDSNaClTris-HCl（pH8.0）组份组份20 mMEDTA（pH 8.0）2%0.4M10 mM终浓度终浓度SDSNaClTris-HCl（pH8.0）组份组份 SDS法流程图法流程图（以动物组织为例）（以动物组织为例）动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNA其它方法其它方法根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法：吸附材料结合法：硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。物，从而达到分离目的。浓盐法浓盐法：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物基因组基因组DNA其它方法其它方法DNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备准备基因组基因组DNADNA的提取的提取 最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长，否则会造成否则会造成DNA降解降解 含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少，提取前先富集少，提取前先富集细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取核酸分离、纯化核酸分离、纯化基因组基因组DNADNA的提取的提取采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提时，应提供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法应的去杂质的方法核酸分离、纯化核酸分离、纯化 蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤 蛋白酶处理蛋白酶处理核酸分离、纯化核酸分离、纯化 多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体积体积的的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积)，氯苯可以，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500500 L DNAL DNA液中加入液中加入200200 l 20%PEGl 20%PEG8000 8000(含含1.2 M NaCl)1.2 M NaCl)，冰浴，冰浴20min20min。核酸分离、纯化核酸分离、纯化 多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合 盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解基因组基因组DNADNA的提取的提取当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaOAc（pH5.2，3M），有），有利于充分沉淀利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解DNA提取常见问题提取常见问题问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原原因因1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子对对策策1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）质（具体方法见前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2 2-3 3次）次）DNA提取常见问题提取常见问题问题二：问题二：DNADNA降解。降解。原原因因1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融对对策策1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融DNA提取常见问题提取常见问题原原因因问题三：问题三：DNADNA提取量少。提取量少。1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失对对策策1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PKPK的用量）的用量）4.4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒动物组织细胞基因组动物组织细胞基因组DNA提取提取2.试剂：试剂：1、TE:10mM Tris-HCl(pH 7.8);1mM EDTA(pH 8.0)。2、裂解缓冲液：裂解缓冲液：250mM SDS;使用前加入蛋白酶使用前加入蛋白酶K至至 100mg/ml。3、20%SDS 4、2mg/ml蛋白酶蛋白酶K 5、Tris饱和酚（饱和酚（pH 8.0）、酚）、酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇6、无水乙醇、无水乙醇、75%乙醇乙醇7、TAE电泳缓冲液电泳缓冲液实验操作实验操作材料处理材料处理1、新鲜或冰冻组织处理新鲜或冰冻组织处理取组织块取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器，转移到匀浆器中匀浆。中匀浆。将匀浆液转移到将匀浆液转移到1.5ml离心管中。离心管中。加加20%SDS 25l，蛋白酶，蛋白酶K(2mg/ml)25l，混匀。，混匀。65C水浴水浴30min。于台式离心机以。于台式离心机以12000 rpm离心离心5min，取上清液入另一离心管中。取上清液入另一离心管中。DNA提取加等量的酚加等量的酚/氯仿氯仿/异戊醇至上述样品处理液中振荡混匀，离心异戊醇至上述样品处理液中振荡混匀，离心12000 rpm，5min。取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。取上层溶液至另一管，加取上层溶液至另一管，加1/10体积的体积的3M醋酸钠（醋酸钠（pH 5.2）和）和2.5倍体积的倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀室温沉淀无水乙醇，轻轻倒置混匀室温沉淀2min，离心，离心12000 rpm,10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。掉。用用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物乙醇洗涤沉淀物1次，离心次，离心12000 rpm，10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。掉，室温干燥。加加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于重新溶解沉淀物，然后置于4或或-20保存备用。保存备用。DNA及及RNA含量测定含量测定 取少量待测取少量待测DNA(RNA)样品，用样品，用TE或蒸馏水稀释或蒸馏水稀释50倍（或倍（或100倍）。倍）。用用TE或蒸馏水做空白，在或蒸馏水做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光处调节紫外分光光度计的读数至零。度计的读数至零。加入待测加入待测DNA(RNA)样品在三个波长处读取样品在三个波长处读取OD值。值。纯纯DNA样品的样品的OD260/OD280 大约为大约为1.8，高于，高于1.8可能有可能有RNA污染，低污染，低于于1.8有蛋白质污染；纯有蛋白质污染；纯RNA 样品的样品的OD260/OD280 大约为大约为2.0。根据根据OD值计算值计算DNA（RNA）浓度或纯度。）浓度或纯度。SSDNA=33（OD260-OD310）稀释倍数稀释倍数dSDNA=50（OD260-OD310）稀释倍数稀释倍数SSRNA=40（OD260-OD310）稀释倍数稀释倍数DNA及及RNA含量测定含量测定琼脂糖凝胶电泳原理及方法琼脂糖凝胶电泳原理及方法天然琼脂（天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占，约占80%）及琼脂胶（）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。因此，目前多用的电渗现象。因此，目前多用琼脂糖琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。为电泳支持物进行平板电泳。琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸:如重组质粒的鉴定，如重组质粒的鉴定，DNA酶谱制作等。酶谱制作等。琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点琼脂糖电泳优点：琼脂糖电泳优点：操作简单，电泳速度快，样品处理容易。操作简单，电泳速度快，样品处理容易。样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占（琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%99%98%99%），近似），近似自由电泳，样品扩散较自由。）自由电泳，样品扩散较自由。）无紫外吸收，可直接用紫外光灯检测及定量测定。无紫外吸收，可直接用紫外光灯检测及定量测定。易染色，易洗脱样品，便于定量测定。制成干膜可长期保易染色，易洗脱样品，便于定量测定。制成干膜可长期保存。存。DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分分子量子量及分子及分子构型构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。，同时与凝胶的浓度也有密切关系。1 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系不同大小的不同大小的DNADNA需要不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。需要不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度与琼脂糖浓度与DNA分离范围分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度/%线状线状DNA大小大小/kb0.50.71.01.21.52.030-1 12-0.8 10-0.5 7-0.4 3-0.2 2-0.052 2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型不同构型DNADNA的移动速度次序为：的移动速度次序为：供价闭环供价闭环DNA直线直线DNA开环的双链环状开环的双链环状DNA3 3、电泳方法、电泳方法（1 1）电泳类型电泳类型用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型垂直型及及水平型水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下下1 1-2mm2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。（2 2）缓冲液系统缓冲液系统缺少缺少离子离子时，电流太小，时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和熔化和DNADNA的变性。的变性。常用的电泳常用的电泳缓冲液缓冲液有有EDTA（pH8.0）和）和Tris-乙酸乙酸（TAE），），Tris-硼酸（硼酸（TBE）或）或Tris-磷酸（磷酸（TPETPE）等，浓）等，浓度约为度约为50mmol/L(pH7.57.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液贮备液，临用时稀释到，临用时稀释到所需倍数。所需倍数。（3 3）凝胶的制备凝胶的制备以稀释的电泳缓冲液为溶剂，用微波炉配制一定浓度的以稀释的电泳缓冲液为溶剂，用微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。（4 4）样品配制与加样样品配制与加样DNA样品用适量样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，溴酚蓝或其他指示染料，含有含有10%-15%蔗糖或蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，甘油，以增加其比重，使样品集中。使样品集中。（5 5）电泳电泳低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分离分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在时，为增加凝胶硬度，可在44进行电泳。进行电泳。（6）染色和拍照染色和拍照常用荧光染料溴乙锭（常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观）染色，在紫外光下观察察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。统输出照片，并进行有关的数据分析。琼脂糖电泳注意问题琼脂糖电泳注意问题融胶时非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注融胶时非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。倒胶的时候制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。倒胶的时候制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在如果在制胶时加入，在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的以上的EB很难摇匀，而且凝的速度很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。染色。室温凝胶室温凝胶30分钟，过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间分钟，过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。