人角膜内皮细胞株的建立与组织工程人角膜内皮的体外重建[1].pdf

书书书第 卷第 期 山东大学学报（理学版）（）年 月 收稿日期：；网络出版时间：网络出版地址：基金项目：国家高技术研究发展计划（计划）资助项目（）作者简介：樊廷俊（），男，理学博士，教授，博士生导师，主要研究方向为动物细胞工程与角膜组织工程 ：文章编号：（）人角膜内皮细胞株的建立与组织工程人角膜内皮的体外重建樊廷俊，马西亚，赵君，胡修忠（中国海洋大学角膜组织工程重点实验室，山东 青岛 ）摘要：为了体外重建出可用于角膜移植的组织工程人角膜内皮（），本文从业已建立的非转染人角膜内皮（）细胞系中筛选出单克隆细胞株（），并以其为种子细胞对 的体外重建进行了研究。经有限稀释法从非转染 细胞系筛选出了 细胞株，形态结构、染色体分析以及细胞连接蛋白和膜运输蛋白的检测结果显示，单克隆细胞株细胞具有正常而稳定的形态、结构和二倍染色体核型，并能表达细胞连接蛋白和膜运输蛋白，具有 种子细胞的理想特征。以 细胞为种子细胞、以去上皮层修饰羊膜（）为载体支架体外重建出了 ，形态结构鉴定结果显示，多角形 种子细胞在 上形成了连续、完整的细胞单层，在细胞之间以及细胞与 之间均形成了广泛的细胞连接，单层细胞密度高达 个 （相当于 岁孩童 的细胞密度），所重建单层角膜内皮的形态结构与在体 高度近似。可见，本文成功建立了形态结构、核型以及功能蛋白表达正常的单克隆细胞株，并利用 细胞和 在体外成功重建出了形态结构与与在体 高度近似的最“年轻”的 ，有望作为捐献角膜内皮的等效替代物用于角膜内皮异常疾病的临床治疗。关键词：人角膜内皮细胞；单克隆细胞株；去上皮层修饰羊膜；组织工程人角膜内皮；重建中图分类号：文献标志码：，（，）：（），（），（），（），2011-09-01 10:25http:/ 卷 ，“”：；引言人角膜内皮层（）由单层六角形枝状内皮细胞镶嵌而成，这层细胞在成年后失去了分裂能力，局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞扩张和移行来填补缺损区 。一旦 细胞密度低于维持内皮细胞生理功能的临界密度，角膜将出现不可逆之病变，即角膜内皮盲 。目前，临床治疗角膜内皮盲的唯一途径就是角膜移植，但由于角膜移植材料的高度匮乏，我国每年能进行的角膜移植手术只有 例，绝大多数患者因得不到移植角膜而无法重见光明 。近年来角膜组织工程的兴起，为组织工程人角膜的体外重建及其临床应用带来了新的希望，但如何在体外获得大量的正常角膜种子细胞和研制出一种生物相容性理想的载体支架材料，一直是该领域的研究热点和主攻方向 。自 年 利用酶消化法首次获得纯的新西兰兔角膜内皮细胞并成功启动了其体外培养以来，学者们先后对人 、兔 、牛 、猪 、猫 和小鼠 角膜内皮细胞的体外培养条件进行了研究。由于成体 细胞丧失了分裂能力，对其进行继代培养和建立细胞系非常困难 。为此，学者们开始利用多种肿瘤病毒和和多种癌基因等对原代培养的 细胞进行了转染实验，虽然获得了几个可继代培养的 细胞系 ，但由于具有潜在致瘤性致使所重建 无法临床应用 。年，等 采用贴膜培养和时间梯度连续揭膜法使用 细胞专用培养液成功建立了非转染、无致瘤性的 细胞系（），解决了 细胞不经转染无法建系的国际难题。自 年 等 首次开始 的体外重建研究之后，国内外学者先后体外重建出 的组织类似物，并利用新西兰兔和大鼠进行了移植实验，但由于所用种子细胞或为原代培养的 细胞或为仅继代培养 代的 细胞，所重建 的数量有限，临床移植应用价值不大 ，。年以来，樊等 以非转染 细胞系的细胞为种子细胞、以去上皮层羊膜（）为载体支架在体外成功重建出了与在体 形态结构近似的 ，且移植后先后使新西兰兔角膜保持透明 、和 ，证明非转染 细胞和 是 体外重建的理想种子细胞和载体支架材料。但在上述研究中，所用 细胞由第 代 细胞中克隆而来，所重建 的细胞密度约为 个 ，故仍存在有如下问题：一是 细胞的克隆化来源细胞传达次数太高，在体外培养过程中很难长期保持形态结构及核型的稳定；二是 的细胞密度仍需进一步提高，以使所重建 更加“年轻化”。本文拟从第 代 细胞系中筛选出形态结构及核型正常的 单克隆细胞株（），进而以其为种子细胞、以 为载体支架开展 的体外重建研究，为 作为捐献角膜替代物临床治疗角膜内皮盲奠定基础。材料与方法 材料健康 小鼠，体重 ，不分雄雌，购自青岛大学医学院实验动物中心；非转染、无致瘤性人角膜内皮细胞系（）由本实验室自行建立 ，利用含 小牛血清（）的 培养液进行常规继代培养；新鲜羊膜（）由山东省眼科研究所友情提供。人角膜内皮细胞的克隆化培养 小鼠经脊柱脱臼法处死后放于 酒精中浸泡 ，用手术剪开小鼠腹腔处的皮肤暴露腹腔壁，用 的酒精冲洗后用 玻璃注射器往腹腔内无菌注射 无血清 培养液，轻揉小鼠腹部 后用无菌注射器吸出腹腔液，离心 ，弃去上清，加入含 的 培养液悬浮细胞，定容至 ，按 孔的量接种至 孔细胞培养板中，置 、培养箱中培养，后吸出培养上清液用作细胞饲养层。第 期樊廷俊，等：人角膜内皮细胞株的建立与组织工程人角膜内皮的体外重建取第 代 细胞系的对数期细胞，按前述 胰蛋白酶消化（）和离心法（，）收集细胞，加入含 胎牛血清（）的 培养液悬浮细胞，经细胞计数后将细胞密度调整至个 ，按 孔的量接种到具有细胞饲养层的 孔培养板中，置 、培养箱中培养，每隔 在 倒置显微镜下观察细胞的分裂情况，每 换液一次。培养 周观察克隆的形成，标出并统计形成的细胞单克隆，进行扩增培养，并利用 倒置显微镜观察 单克隆细胞株（）细胞的形态。单克隆细胞株细胞的免疫荧光染色与观察免疫荧光染色参照 等 的方法进行。将 细胞培养在 孔培养板中，待生长至对数期后，用磷酸缓冲液（）轻轻洗涤细胞表面 次，加入 的多聚甲醛 于 固定 ，吸出固定液后自然干燥，用 洗涤后用 的 处理 ，加入 小牛血清 将培养板置湿盒中 封闭 ，用 洗涤后分别加入山羊抗人鬼笔环肽（，）的单克隆抗体 ，下孵育 ，液洗涤后再加入罗丹明（）标记的兔抗羊 （）第二抗体 ，放入湿盒内 暗处孵育 ，洗涤后，置 倒置荧光显微镜下观察并照相。洗涤时，每次 ，共 次。对照组用含 血清的 液代替第一抗体，其它操作相同。单克隆细胞株细胞的超微结构鉴定将 细胞培养于 培养瓶中，待生长至接近细胞单层后，按上述方法收集细胞，缓慢加入 预冷的 戊二醛固定液 ，下固定 ，弃去固定液并用 漂洗 次（次），再用 饿酸于 固定 ，经梯度乙醇脱水处理后，环氧树脂 浸透包埋进行超薄切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅分别染色 后，置 透射电镜下观察并照相。单克隆细胞株细胞的染色体分析染色体标本制做和核型参照 等 的方法进行。对数期 细胞，经 秋水仙素处理 后，按上述方法收集细胞，用 溶液低渗处理 ，经 液固定后滴片、自然干燥，经吉姆萨染液染色后流水冲洗、文火烤干，置 光学显微镜下观察并照相。单克隆细胞株细胞中细胞连接蛋白表达的免疫荧光检测 细胞的免疫荧光染色参照 等 的方法，按上述操作进行。第一抗体使用山羊抗人紧密连接蛋白 （，）、小鼠抗人 钙粘蛋白（）、小鼠抗人间隙连接蛋白 （）和小鼠抗人整联蛋白 （）的单克隆抗体，第二抗体使用 荧光素标记的兔抗羊 （：）或羊抗鼠（），对照组用含 血清的 液代替第一抗体，其它操作相同。单克隆细胞株细胞中膜运输蛋白 表达的实时荧光定量 检测对 细胞膜运输蛋白 的实时荧光定量 检测，参照 等 的方法进行。按上述方法收集 细胞，用 试剂盒抽提出全 ，利用 第一链 合成试剂盒以 全 为模板反转录合成 第一链，采用 分析系统和 荧光定量 试剂盒，使用特定目的基因的正反向引物，进行荧光定量 。扩增条件为 预变性 、变性 、退火 、延伸 、检测荧光，共进行 个循环。循环结束时，通过分析 产物的熔解温度曲线确定产物的特异性。检测的膜运输蛋白包括人的水孔蛋白 （）、泵 多肽链（）、电位依赖性阴离子通道蛋白（，）、氯离子通道蛋白（，）、协同运输蛋白（）和囊性纤维化跨膜转运调控蛋白（），以人 磷酸甘油醛脱氢酶（）基因为内参。上述 反应中所用的引物序列详见文献 。去上皮层修饰羊膜载体支架的制备新鲜羊膜经 生理盐水清洗后，置 妥布霉素溶液中消毒 ，用无菌 生理盐水清洗去除消毒剂，按上皮面朝下的方向将羊膜平铺在预先用 胰蛋白酶混合液浸透的滤纸上，置 消化 ，用无菌生理盐水清洗去除酶液，按上皮面朝上的方向将羊膜平铺于玻璃板上，用细胞刮刀轻刮上皮面，无菌生理盐水清洗后用眼科剪将羊膜剪成直径 的圆片，平铺于 孔培养板孔底，加入含有一定浓度 型胶原蛋白和纤连蛋白溶液，置 孵育包被过夜，自 然 干 燥 后 即 获 得 去 上 皮 层 修 饰 羊 膜（），用作 体外重建的载体支架。组织工程人角膜内皮的体外重建 细胞经扩增培养后用作 体外山东大学学报（理学版）第 卷重建的种子细胞。对数期 细胞，按上述胰蛋白酶消化和离心法收集细胞，加入含 培养液悬浮细胞，经细胞计数后将细胞密度调整 个 ，按 孔的量将细胞接种到预铺有 的 孔培养板孔中，置、培养箱中启动 的体外重建。在 倒置显微镜下每日观察细胞的形态变化并照相。组织工程人角膜内皮的茜素红染色启动重建 后，从培养孔中取出体外重建的 ，用生理盐水对其表面进行轻轻漂洗 次后，将 茜素红轻轻滴加到细胞单层的表面染色 ，吸出染液并用生理盐水轻轻冲洗至无红色为止，细胞面朝上平铺于玻璃载玻片上，置 光学显微镜下观察、照相，检测细胞间连接的形成和细胞的形态；并利用方格目微尺进行细胞计数，每组计数 个平行样，每个样随即计数 个区域。组织工程人角膜内皮的冰冻切片与染色观察启动重建 后，从培养孔中取出体外重建的 ，用冰冻胶低温固定后，利用冰冻切片机进行切片（厚 ），经甲醇固定后，空气干燥 ，水洗 后，苏木精 伊红（）染色 ，盐酸 酒精分化 ，水洗 后伊红染色 ，水洗后梯度酒精脱水封片，置 光学显微镜下观察并照相。组织工程人角膜内皮的电镜观察启动重建 后，从培养孔中取出体外重建的 ，用 戊二醛 蔗糖添加二甲胂缓冲液固定后，进 行 临 界 点 干 燥 和 喷 金 处 理，置 扫描电镜下观察并照相；启动重建 的 ，用 戊二醛 蔗糖添加二甲胂缓冲液固定后，按上述方法进行再固定、包埋、超薄切片和染色，置 透射电镜下观察并照相。统计学分析数据均用平均值 标准误表示，样品重复数位，用 程序分析 单因子的统计学差异。实验结果 单克隆细胞株的鉴定经过克隆化培养，从 细胞系中筛选出了 个形态结构正常且核型正常的单克隆细胞株（）。对 单克隆细胞株形态结构的鉴定结果显示，细胞多为多角形，且透明度高（图 ）；经鬼笔环肽 罗丹明染色后，发现细胞几乎全为多角形，肌动蛋白丝的走向与细胞的长轴一致（图 ）；在 下的超微结构与正常的在体 细胞相似（图 ）。染色体鉴定结果显示，细胞的染色体数目均为 条（图 ），且核型正常（图 ）。此外，在体外连续传代 次后，细胞的形态结构及核型依然正常（结果同图 ，未给出）。单克隆细胞株细胞对细胞连接蛋白的表达免疫荧光检测结果显示，细胞仍维持有 、间隙连接蛋白 和整联蛋白 的阳性表达（图 ）。暗示 中的 种子细胞仍保持有细胞 细胞及细胞 间细胞连接的形成潜能。图 单克隆细胞株细胞的形态结构 体外培养的 细胞（标尺 ）；鬼笔环肽 罗丹明免疫荧光染色后的 细胞（标尺 ）；细胞的 照片（标尺 ）。（）；（）；（）第 期樊廷俊，等：人角膜内皮细胞株的建立与组织工程人角膜内皮的体外重建图 单克隆细胞株细胞的核型 细胞的 条染色体；细胞的核型。；图 体外重建 后 的免疫荧光照片 人紧密连接蛋白 ；人 钙粘蛋白；人间隙连接蛋白 ；人整联蛋白 。标尺 。（）；单克隆细胞株细胞对膜运输蛋白的表达实时 荧 光 定 量 检 测 结 果 显 示，细胞能表达人 、泵 多肽链、和 的基因，几乎不表达 基因，而原代培养的 细胞几乎不表达 、和 基因（图）。说明 细胞仍保持有表达除 外其它膜运输蛋白的能力。组织工程人角膜内皮的体外重建 细胞接种至 上后，逐渐开始贴膜并伸展为多角形细胞形态，后已基本形成汇合细胞单层，随着时间的延长，细胞单层越来越致密，细胞间界限也越来越清晰（图 ）。茜素红染色结果显示，多角形 细胞在 之前虽然形成了汇合细胞单层，但细胞间细胞连接的形成仍不完整（图 ，），细胞间才开始形成广泛的细胞连接，并随着时间的延长，细胞间的细胞连接越来越完整（图 ）。即 后才逐渐体外重建出 。对 细胞计数的结果如表 所示，在 之前随着时间的延长，细胞密度逐渐增大，时 单 层 的 细 胞 密 度 可 高 达 ，但 以后随着时间的延长，细胞密度逐渐减小。图 单克隆细胞株细胞的实时荧光定量 检测 ，人水孔蛋白 基因；，泵 多肽链基因；，电位依赖性阴离子通道蛋白基因；，氯离子通道蛋白基因；，协同运输蛋白基因；，囊性纤维化跨膜转运调控蛋白基因。，；，；，；，；，；，山东大学学报（理学版）第 卷图 体外重建 的光镜照片（标尺 ）（）图 体外重建 的茜素红染色照片（标尺 ）（）第 期樊廷俊，等：人角膜内皮细胞株的建立与组织工程人角膜内皮的体外重建表 体外重建不同时间 单层的细胞密度 重建时间 细胞密度（个）注：种子细胞的接种量为 个细胞。组织工程人角膜内皮的形态结构鉴定体外重建 冰冻切片的 染色结果显示，种子细胞在 载体支架上形成了连续的细胞单层，且种子细胞与载体支架结合状态紧密（图 ）；观察结果证实，多角形 细胞形成了连续的完整细胞单层（图 ）；观察结果显示，细胞形成的细胞单层紧密黏合在 上（图 ），细胞质中含有大量的线粒体、较多数量的糙面内质网及一些分泌泡样结构（），且细胞之间相互嵌合紧密、形成了多处细胞连接结构（），种子细胞与载体支架之间也于多处形成了紧密结合（）（图 ）。图 体外重建 后 的形态结构 冰冻切片的 染色照片（标尺 ）；的 照片（标尺 ）；的 照片（标尺 ）；的 照片（标尺 ）。（）；（）；（）；（）讨论 是紧密结合在后弹力层上的由 细胞镶嵌而成的一个细胞单层，通过建立角膜 房水屏障在维持角膜透明和向角膜供养中具有不可替代的重要作用 。作为 的结构功能类似物，是角膜内皮盲患者通过临床角膜内皮移植而复明的希望，而足量的正常 种子细胞及适宜的载体支架材料是 体外重建的两大关键要素 ，。我们的前期研究工作已证明 细胞系及其单克隆细胞株细胞与 具有理 想 的 生 物 相 容 性，并 利 用 细 胞 和 成功重建出了形态结构与载体角膜内皮相似，且移植后可使新西兰兔角膜长期保持透明的 。为了解决种子细胞传代次数过高的问题并进一步提高 的细胞密度，本文又从第 代 细胞中克隆并筛选出 细胞，并以其为种子细胞、以 为载体支架进行了 的体外重建研究。在体外培养过程中能否保持六角形或多角形细胞形态并具有正常的二倍体染色体，是判定 细胞是否仍具有 细胞固有属性的重要依据 ，。本文从第 代 细胞中所筛选出的 单克隆细胞株，其细胞形态为多角形，其二倍体染色体数目为 条，核型正常，且连续传代 次后，细胞的形态结构及核型依然正常。此外，细胞仍保持有细胞连接蛋白 、间隙连接蛋白 和整联蛋白 的阳性表达，说明 细胞不仅具有在细胞之间形成封闭连接、锚定连接和通讯连接的潜能，还具有在细胞与 等细胞外基质之间形成锚定连接的潜能，即具有形角膜内皮单层及发挥角膜内皮屏障的潜能；同时，细胞还具有膜运输蛋白 、泵 多肽链、，、，和 基 因 的 表 达 能 力，表 明 细胞稳定保持有稳定执行水运输和各种泵功能的潜能，具有维持角膜透明度和向角膜供养的潜在活性。上述结果证明，单克隆细胞株具有稳定的形态结构和核型并能表达细胞连接蛋白和膜运输蛋白，在形态结构和功能的稳定性方面完全符合作为 种子细胞的条件，可以用于 的体外重建研究。山东大学学报（理学版）第 卷 细胞之间能否建立各种细胞连接进而形成完整的单层内皮，是判定 细胞能否形成内皮屏障和发挥泵功能的关键指标 。本文以 细胞为种子细胞以 为载体支架所重建出的 ，其种子细胞的形态多为多角形，细胞接种 后便可形成紧密汇合的细胞单层，在 细胞之间形成了广泛的细胞连接并随着时间的延长越来越完整，重建 的 单层细胞密度可高达 ，但随着时间的延长细胞密度逐渐减小，表明在接种量为 个细胞时培养 是功能性 体外重建的最佳时间，而 对种子细胞的生物相容性可能要优于非修饰的去上皮层羊膜（）。此外，本文将 的单层细胞密度提高到约 个，相当于 岁孩童的 细胞密度，在国际上首次体外重建出了最为“年轻”的 ，可确保各种年龄的患者移植后均能长期行使 的功能。形态结构的鉴定结果还表明，体外重建 具有与在体 高度近似的形态结构，即具有完整的细胞单层，细胞呈多角形的内皮样形态，在细胞 细胞间和细胞 间形成了广泛而紧密的细胞连接，细胞的超微结构与对在体 细胞的近似，且在胞质中含有大量的线粒体、较多糙面内质网及一些分泌泡样结构，表明种子细胞正在活跃合成蛋白质，分泌泡样结构中的组分可能是重建后弹力层的前体物 ，。综上所述，我们成功从第 代非转染、无致瘤性 细胞系中成功筛选出了形态结构和功能正常的 单克隆细胞株，以其为种子细胞、以 为载体支架体外重建出了形态结构与在体 高度近似的最“年轻”的 ，有望作为 的等效替代物，用于角膜内皮失代偿和角膜内皮盲患者的临床移植和治疗。目前，正在进行 的家猫角膜移植试验。参考文献：，（）：，（）：，：魏林娜，邹留河，高永庆，等 全国角膜性盲及低视力的流行病学调查 中国实用眼科杂志，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，第 期樊廷俊，等：人角膜内皮细胞株的建立与组织工程人角膜内皮的体外重建 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：樊廷俊，赵君，王晶，等 体外重建组织工程人角膜内皮在新西兰兔角膜内皮移植中的作用研究 国际眼科杂志，（）：樊廷俊，赵君，王晶，等 组织工程人角膜内皮的体外重建及其形态结构鉴定 国际眼科杂志，（）：樊廷俊，赵君，王晶，等 组织工程人角膜内皮在维持新西兰兔角膜透明中的效果研究 山东大学学报：理学版，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，：（编辑：许力琴）樊廷俊，男，年 月生。理学博士，教授、博士生导师，细胞生物学专业，主要研究方向为海洋动物细胞工程与角膜组织工程。现任中国海洋大学角膜组织工程重点实验室主任、中国海洋大学国家生命科学与技术人才培养基地主任、海洋生命学院副院长；国家细胞生物学教学团队带头人，山东省细胞生物学教学团队带头人，山东省高等学校教学名师，青岛专业技术拔尖人才，国家科学技术奖评审专家，国家科技部 计划专家库专家，教育部学科专家库专家，教育部学位中心 学位与研究生教育评估专家库 专家，山东省科学技术奖励评审专家；山东细胞生物学会副理事长，国际眼科杂志 常务编委，中国海洋大学高教研究 编委，中国海洋大学教育教学研究专家委员会委员，中国海洋大学实验室工作专家委员会委员。主要学术成就：（）在国际上率先查清了非洲爪蟾、牙鲆、中国对虾及卤虫孵化酶的生物化学性质和酶性质、孵化腺细胞的分化规律以及孵化酶基因的表达时相，为阐明动物胚胎的孵化机制奠定了基础，尤其是对非洲爪蟾孵化酶及其卵膜降解机制的研究方面达到了国际领先或至少是国际先进水平；（）在国际上首次查清了中国对虾、日本鑚和菲律宾蛤仔酚氧化酶的生物化学性质和酶性质，初步查清了多糖和弧菌类免疫促进剂提高虾 山东大学学报（理学版）第 卷贝类自身免疫力的细胞和分子机理，以及内分泌干扰物降低虾贝类自身免疫力的细胞和分子机理；（）在国际上首次建立了大菱鲆、大黄鱼、褐点石斑鱼、圆斑星鲽、条斑星鲽、红鳍东方等重要海水养殖鱼类的 个组织细胞系，为鱼类细胞工程育种、种质保存、毒理学以及病毒学研究创造了条件，并首次利用大菱鲆鳍细胞系大量繁殖出大菱鲆红体病虹彩病毒疫苗，进而制备出了免疫保护率超过 的大菱鲆红体病虹彩病毒疫苗，为大菱鲆红体病的免疫预防奠定了基础；（）在国际上首次于器官、组织、细胞和分子水平上阐明了罗氏海盘车创伤腕的再生过程、再生方式及其再生机理，为其它后口动物再生机理的阐明奠定了基础；（）在国际上首次建立了未经任何肿瘤病毒或癌基因转染的没有任何致瘤性的人的角膜内皮、上皮和基质细胞系，首次制备出与人角膜细胞具有理想生物相容性的去上皮层羊膜、三维复合胶原凝胶、脱细胞猪角膜基质以及去上皮层修饰羊膜载体支架，现已研制出结构与功能接近正常人角膜内皮的组织工程人角膜内皮、上皮、基质和全层人角膜，内皮移植后现已使新西兰兔角膜保持透明 天、家猫角膜保持透明 天、猕猴角膜保持透明 天，上皮移植后现已使新西兰兔角膜保持透明 天，为组织工程人角膜内皮、上皮、基质和全层人角膜的工业化生产及其作为捐献角膜替代物在临床角膜移植的规模化应用奠定了基础，不仅为我国近 万、全世界近 万角膜病盲患者重见光明带来了希望，也使我国 余万、全世界近 万白内障患者术后所致角膜内皮失代偿的临床（预防）治疗成为可能。第 期樊廷俊，等：人角膜内皮细胞株的建立与组织工程人角膜内皮的体外重建