课题综述.doc

地衣芽孢杆菌合成生物絮凝剂文献综述

摘要：从絮凝剂的来源和化学组成两方面对生物絮凝剂进行了系统分类，综述了生物絮凝剂的培养条件以及地衣芽孢杆菌的培养条件，在此基础上阐述了目前生物絮凝剂研究存在的问题，并提出生物絮凝剂今后主要的研究方向。

关键词：生物絮凝剂，培养条件，地衣芽孢杆菌

生物絮凝剂是由一类由微生物产生的可以使水体中不易降解的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子等凝集、沉淀的特殊高分子聚合物。该生物絮凝剂是利用生物技术，通过微生物培养、分离提取而得到的一种新型、高效、廉价的水处理剂。能够产生絮凝微生物种类繁多，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等[1]。
目前普遍使用的絮凝剂包括无机和有机两大类，但由于存在成本高、絮凝效果有限以及产生的污泥难处理等问题，因此开发新型的絮凝剂迫在眉睫。微生物絮凝剂因其高效、无毒而成为国内外近年来的研究热点课题。但从现有的研究状况看，大都局限于能产生絮凝剂的微生物菌种的筛选，微生物絮凝剂性能的研究，以及小型试验，所以微生物絮凝剂一直未能得到广泛的应用。本文在综述微生物絮凝剂研究现状的基础上，提出了新的设想，以期为微生物絮凝剂的研究探讨新的途径。
1、 生物絮凝剂的种类
生物絮凝剂按照来源不同，主要分为3类[2]（1）直接利用微生物细胞的絮凝剂 如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母，它们普遍存在于土壤、活性污泥和水体沉淀物中。此类微生物菌体细胞具有絮凝性的原因有很多：有的是由于菌体细胞表面带有荚膜层或粘液层，能够吸附溶液中的悬浮颗粒；有的是因为菌体细胞表面的附属结构的吸附作用；有的是因为菌体细胞壁表面带有活性基团，能够吸附溶液中的带电颗粒。（2）利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂 如酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和N-乙酰葡萄糖胺等均可用作絮凝剂；丝状真菌的细胞壁多糖除了纤维素、甘露聚糖、葡萄糖外，还含有一种重要的多糖-几丁质，几丁质经碱水解后产生带正电荷、高效无毒的脱乙酰几丁质，含有活性NH2-和-OH，对许多微生物菌体及其他带负电荷的粒子有极强的絮凝能力。（3）利用微生物细胞壁产物的絮凝剂 微生物细胞产生的具有絮凝性的代谢产物有的贮藏在胞内作为内源代谢产物，有的则分泌到胞外或粘附在菌体细胞表面或脱离菌体，或游离于培养液中。目前国内外学者研究开发的生物絮凝剂大多属于脱离菌体细胞游离于发酵液中的絮凝物质(如Kurane开发的NOC21; Takagi研制的PF2101等，He ning等研发的REA-11) 。与细胞的内源代谢物相比, 此类生物絮凝剂往往因为具有更为广阔的应用领域而受到重视。
按化学组成分类 (1) 蛋白质: Asp1 sojae AJ7002合成的絮凝剂的主要活性成分是蛋白质和己糖胺; 生物絮凝剂NOC21也是一种蛋白质, 并且该蛋白质分子中含有较多的疏水氨基酸。(2) 多糖: 目前已经鉴定的生物絮凝剂有很多种属于多糖类物质。A lca ligenes cupidus KT201代谢产生的Al2201即是一种由葡萄糖、乳糖、葡糖醛酸和乙酸(摩尔比: 6134∶5155∶110) 组成的生物絮凝剂;Paecilom yces sp1 I21产生的PF2101絮凝剂则是由氨基半乳糖以(1, 4糖苷键相连而成的粘多糖。(3) 脂类: Kurane首次从R1 ery thropolis S21的培养液中分离到了一种脂类絮凝剂, 这是目前发现的唯一的脂类絮凝剂。该絮凝剂分子中含有葡萄糖单霉菌酸酯( GM) , 海藻糖单霉菌酸酯( TM) ,海藻糖二霉菌酸酯(TDM) 3种组分。(4) DNA: 高分子量的天然双链DNA是Pseudomonas C2120菌体细胞凝集的直接原因。光合细菌———Rhodovulum sp1PS88的絮凝活性与该菌分泌到胞外的DNA亦直接相关。此外, 某些菌的代谢物—PHB, 聚γ2谷氨酸, 多聚磷酸盐等。下表列举了文献中微生物絮凝剂的物质属性、组成及相对分子质量。大多数微生物絮凝剂为多糖类和蛋白质类物质。
絮凝剂产生菌
絮凝剂
物质属性
絮凝剂组成
分子量
Haloalkalophilic Bacillus.I-450[3]

酸性多聚物
中性（52.4%）、糖醛酸（17.2%）和氨基糖（2.4%）中性糖包括半乳糖、果糖、葡萄糖、棉子糖
2.2×106
Rhodococcus
Erythro[4]
NOC-1
糖蛋白
多肽、多脂
3×105
Bacillus
mucilaginosus[5]

MBFA9
多聚糖
糖醛酸（19.1）中性糖（47.4%）、氨基糖（2.7%）
2.594×106
Corynebacterium
glutamicum[6]
REA-11

糖蛋白
由半乳糖醛酸作为结构单元，同时含微量蛋白质
1×105
Nannocystis sp.NU-2[7]

糖蛋白
由蛋白质（40.3%）和多聚糖（56.5%）组成，其中多聚糖是由葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸以5:4:1的比例组成

Alcaligenes cupidus K T201[8]
AL-201
酸性聚多糖
42.5%糖、36.38%半乳糖、8.52%葡萄糖醛酸、10.3%乙酸
3×105
Bacillus licheniformis[9]

谷氨酸聚合物

聚谷氨酸（PGA）
2×106
Nocardia anerueuk sp
Fix
蛋白质
主要为多肽，含25.6%甘氨酸、13.8%丙氨酸、12.3%丝氨酸
2×106

2、 生物絮凝剂的培养条件
影响生物絮凝剂的合成的因素很多。发酵罐培养基的组成、碳和氮的含量比（C/N比）、培养基的pH值、温度、搅拌速度及通气状况等都将影响生物絮凝剂的产率。
2.1 细胞生长与生物絮凝剂产生的关系
Pavoni等人提出：只有在微生物进入内生阶段才出现生物絮凝剂。同时，不同菌种一般在不同的时间阶段分泌的絮凝剂产量也不同。例如，Flavobacterium sp.细菌的培养物只有在对数生长期或静止期才出现絮凝活性。Pseudomonas，Corynrebactarium sp细菌经过三天培养才开始出现絮凝活性，之后絮凝活性保持不变。Aspergillus sp的微生物在培养的第一天就表现絮凝活性，第二天或第三天达到最大值，之后随着培养时间的延长，絮凝活性下降。在R..erythropolis[10]对数生长早期和中期，随着细胞的增长，同时产生絮凝剂，到了静止期，细胞开始分裂，不再产生新的絮凝物质。而Alc.latus分泌絮凝剂的最大活性是在对数生长期，稳定生长期结束时活性开始降低[11]。总体而言，胞外絮凝剂的分泌是在菌细胞生长的对数生长期以及稳定期，尤其集中在中后期和稳定期初期、中期，在此之前处于不分泌状态（少数例外），而在此之后，絮凝活性将不再有上升趋势。
2.2 培养基组成对生物絮凝剂产生的影响
一般来说，营养丰富的培养基有利于絮凝剂的产生，但不同的絮凝剂产生菌，其营养要求不同，有些甚至差别很大。培养基的具体组成对生物絮凝剂产生有较大影响，包括培养基碳源、氮源的成分、碳氮比（C/N），以及培养基中的金属离子、微量生长因子等。
2.2.1 碳源和氮源对生物絮凝剂产生的影响
生物絮凝剂的合成与碳源和氮源有很大关系。以0.5%葡萄糖和0.5%果糖作为碳源，以尿素和硫酸铵为无机氮源，酵母膏和酪蛋白水解物为有机氮源可以促进R.erythropolis 菌体细胞的伸长和絮凝剂的分泌[10]；在某些无机氮化合物（如氯化铵、硝酸铵、硫酸铵）存在的情况下，菌体丝的生长是很微弱的，絮凝活性也是难以察觉的[12]。山梨醇、甘露醇和乙醇是对R.erythropolis菌体的生长和絮凝剂的分泌有特殊促进作用的碳源[10]。尿素、硫酸铵、酵母膏以及酪蛋白氨基酸都是产生生物絮凝剂和R.erythropolis生长所需的很好的氮源[12]。
碳氮比（C/N）对生物絮凝剂分泌有非常明显的影响作用。葡萄糖浓度在25g/L时，降低碳氮比（C/N<38）能够使Z.ramigera 絮凝剂分泌量增加[13]。对于Zoogolea MP6,生长所需的可得到的碳源和氮源的不足会使生物絮凝剂的分泌细胞量减少，但在相对低碳的条件下聚合物和细胞将保持高比率。
2.2.2 金属离子对生物絮凝剂产生的影响
生物絮凝剂的产生分泌受培养基中金属离子的影响较大。对黄质菌属，Ca2+、Mn2+和Ba2+的存在下能激发其絮凝剂的分泌，例如Ca2+等二价离子能增强Sac.cerevisiae分泌的生物絮凝剂絮凝活性；如果Ca2+被螯合剂EDTA去除，则其絮凝作用被抑制[14]。某些离子低浓度时能提高絮凝活性，高浓度时反而抑制絮凝剂的产生。例如，0.25%的KNO3，0.01%Al2（SO4）3以及低浓度的CaCl2，CaCO3，MgSO4均能促进C-62菌株产生絮凝剂；但若离子浓度超过0.5%，絮凝活性反而下降。不同金属离子对HHE6产絮凝剂絮凝效果的影响也有差异，Ca2+的添加有利于该菌产絮凝剂的絮凝作用，Al3+的添加基本上起不到促进絮凝的作用，而Fe2+、Mn2+、Cu2+、K+等阳离子的加入不利于絮凝作用的发生[15]。
2.2．3 其它微量生长因子对生物絮凝剂产生的影响
在培养基中加入生长因子，如酪蛋白氨基酸、蛋白胨、酵母膏、酪蛋白、丙氨酸和谷氨酸等，可以促进絮凝剂的产生。培养基中加入其他物质如EDTA、苹果酸、柠檬酸、多聚赖氨酸、小牛清血蛋白等对生物絮凝剂的形成也有不同的影响。这些物质影响生物絮凝剂活性表现的原因主要有两个方面：一是通过调节絮凝基因的表达；二是对微生物产生的絮凝剂进行了物理或化学修饰[16]。
2.2.4 pH对生物絮凝剂产生的影响
培养基的初始pH会影响生物絮凝剂的产生分泌。生物絮凝剂的最佳合成pH一般是中性到偏碱性(6-9.5),过酸或过碱不利于絮凝剂的合成。菌体在发酵过程中发生明显的升降变化，最后趋于稳定。对于C.xerosis,在相对较低的pH条件下产生絮凝剂[17]。
2.2．5 温度对生物絮凝剂的产生影响
不同絮凝剂产生菌有各自的最适培养温度。一般在30℃。对某些菌来讲，絮凝剂的最佳温度与菌体生长的最适温度不同。Asp.sojae AJ-7002于25℃培养时菌体生长最快，而30-34℃絮凝剂产量最高。
2.2.6 通气量对生物絮凝剂产生的影响
有报道，通气量对R.erythropolis S-1菌体生长及絮凝剂合成的影响时发现，发酵过程中，停止通气，仅仅维持搅拌时，菌体絮凝率比有通气时有所提高。
另外也有报道，通气量加大会刺激某些细菌产生絮凝剂或对絮凝剂产生没有影响。可见，对于不同的絮凝剂产生菌，通气量对它影响是不同的。

3、 地衣芽孢杆菌培养条件研究现状
地衣芽孢杆菌，属于芽孢杆菌属。好氧菌。细胞呈杆状，0.6～0.8×1.5～3.0um，革兰氏阳性，着色均匀，鞭毛周生，运动。芽孢呈椭圆或柱状，中生或偏中生，芽孢囊不膨大或稍膨大。菌落粗糙，不透明，污白色。水解淀粉，利用柠檬酸盐和丙酸盐，还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解酪素和石蕊牛奶产碱。下面对芽孢杆菌培养条件的研究进行了总结。
地衣芽孢杆菌是中重要的益生菌，胡尚勒等对整肠生菌的生理生化特性和培养条件进行了较为系统的研究。结果表明[16、17]:整肠生菌在以葡萄糖为碳源，赖氨酸、天门冬酰胺等多种复合氨基酸为氮源时，最佳碳氮比为4～4.5：1；赖氨酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、L-半胱氨酸、天门冬酰胺酸、D-苯丙氨酸等对其生长有促进作用，且是不可替代的氨基酸；生物素对其生长有最明显的促进作用，可视为最佳生长因子；对各种矿质元素的需要均在2～4mg/L范围内合适。
当培养基中添加生物素时，整肠生菌的比生长速率增加，其中在加入0.3%～0.5%生物素时比生长速率最高，菌数最多，而乳酸产量随生物素浓度的增加而减少。地衣芽孢杆菌在含0.3%～0.5%生物素的培养基中，迟缓期缩短2h，对数期提前或延长2～4h，在生产上可缩短生长周期，提高产量[17]。

4、目前生物絮凝剂研究中仍存在的问题
絮凝剂的研究一直未取得突破性的进展。究其原因有二：第一，工作开展的范畴太窄，只停留在菌种筛选和絮凝剂性能的研究上。第二，思路没放开，研究重点只放在微生物絮凝剂本身的开发上，并未进行复合型微生物絮凝剂的研究，从而实现大规模的工业生产和应用。据此，今后工作的开展，重点应放在开发廉价的复合型的微生物絮凝剂。
尽管生物絮凝剂独特的优越性已经显示了其广阔的应用前景, 但到目前为止, 生物絮凝剂在实际生产中尚未得到推广应用。生产成本过高一直成为障碍其推广的主要原因。(1) 原材料价格高: 对一般的絮凝剂产生菌来讲, 葡萄糖和果糖通常是絮凝剂合成的最佳碳源, 而酵母膏和牛肉膏, 酪蛋白, 酪氨酸往往是絮凝剂合成的最适氮源,这些高价值原材料的使用使絮凝剂的合成成本大幅提高。因此, 为了降低生物絮凝剂合成成本, 必须寻找廉价原料来代替高价原料, 开发低成本培养基, 这也成为近几年来国外众多絮凝剂工作者的主要研究目标。 (2) 絮凝剂产量低, 絮凝活性弱: 生物絮凝剂产量低, 絮凝活性弱是导致其生产成本过高的根本原因。产生这种现象的主要原因有: ①菌株自身潜力不够, 产絮凝剂能力弱; ②未赋予菌株絮凝剂合成的最佳营养条件(主要指培养基组成) ③未处于絮凝剂合成的最佳发酵条件(通气量, pH, 温度等) ; ④未达到最佳的絮凝条件。因此, 要想提高生物絮凝剂活性或产量, 降低其生产成本, 除了充分挖掘高产菌株自身的潜力, 同时还需要对生物絮凝剂的发酵过程以及絮凝剂分子本身的结构特性、絮凝机制等方面进行系统研究, 生物絮凝剂絮凝机理的研究将有助于控制其最佳絮凝条件, 充分发挥生物絮凝剂的絮凝能力。更重要的, 从分子生物学的角度深入研究控制生物絮凝剂合成与分解代谢才是提高其产量的最根本途径。采用代谢工程的手段实现絮凝剂产量的大幅度提高将成为今后生物絮凝剂领域最主要的研究方向之一。

参考文献
[1] Salehizadeh H，shojaodati S A. Extracellular biopolymeric flocculants Recent trends and biotechnological importance. Biotechnology Adavances,2001,19:371-385
[2] 江锋，黄小武，胡勇有.胞外生物高聚物絮凝剂的研究进展（上）.给水排水，2002，28（8）：83-89）
[3] Kumar C G, Joo H S, Choi J W,etal. Purification and characterization of an extracellular polysaccharide from haloalkalophilic Bacillus sp.I-450.Enzyme and Microbial Technology,2004,34:673-681
[4] Takeda M, Kurane R,Koizumi J, et al. A protein bioflocculant produced by Rhodococcus erythropolis.Agric.Biol.Chem.,1991,55:2663-2664
[5] Deng S B, Bai R B , Hu X M, et al.Characteristics of a bioflocculant produced by Bacillus mucilaginosus., 2003,60:588-593
[6] He N, LiY, Chen J, et al. Identification of a novel bioflocculant from a newly isolated Corynebacterium glutamicum. Biochemical Engineering Journal,94:99-105
[7] Zang J,Liu Z,Wang S,et al. Characterization of a bioflocculant produced by the marine myxobacterium Nannocystis sp.NU-2. Appl.Microbiol.Biotechnol.,2002,59:517-522
[8] Salehizadeh H,Shojaosadati S A. Extracellular biopolymeric flocculants Recent trends and biotechnological importance. Biotechnology Advances,19:371-385
[9] Shih I L,Van Y T, Yeh L C,et al. Production of a biopolymer flocculant from Bacillus licheniformis and its flocculantion properties. Bioresource Technology,2001,78:267-272
[10] Kurane R,Nohata Y.Microbioal flocculation of waste liquids and oil emulsion by a bioflocculation from Alcaligenes latus. Agric Biol Chem,1991,55:1127-1129
[11] Tago Y, Aida KO.Exocellular mucopolysaccharide closely related to bacterial floc formation. Appl Environ Microbiol,1994,60(23):1~5
[12] Kurane R, Toeda K, Takeda K, Suzuki T. Culture condition for production of microbial flocculant by Rhodococcus erythropolis. Agric Biol Chem, 1986a,50:2309~2313
[13] Tezuka Y.A Zooglodea bacterium with gelatinous mucopolysaccharide matrix. Water Pollut Control Fed ,1973,45:531~536
[14] Stahl U,Kues U, Esser K, Flocculation in yeast, an assay on the inhibition of cell aggregation. Appl Microbiol Biotechnol,1983,17:199~202
[15] 黄晓武，胡勇有，蒲跃武. 生物絮凝剂产生菌的筛选和特性研究. 工业用水，2002，33（3）：5~7
[16] Hantula J, Bamford DH . The efficiency of the protein dependent flocculation of Flavobacterium sp. Appl Microbiol Biotechnol ,1991a,36:100~104
[17] Esser K,Kues U. Flocculation and its implication for biotechnology . Process Biochem,1983,18:21~23
[18] 胡尚勒，刘天贵.地衣芽孢杆菌营养条件的研究.河北省科学院学报，2000，17（4）：224~227
[19] 胡尚勒.生物素对地衣芽孢杆菌生长和乳酸形成的影响.生物工程学报，1998，14（1）:116~117
9