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乳腺炎动物的建立模型摘要：乳腺癌严重危害妇女的身体健康，其发病率逐年升高，因此研究乳腺癌动物模型对治愈乳腺癌具有重要的指导意义。本文重点介绍一些常见乳腺癌的动物模型及其优缺点和应用范围。关键词：乳腺癌，优缺点，应用 一、 研究背景乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤，其发病率逐年递增，可能跃居为女性恶性肿瘤的首位。其在全世界每年新发病例约为100 万，死亡约60 万例1，在中国占各种恶性肿瘤的710，并仅次于宫颈癌2。常发生于产后尚未满月的哺乳期妇女,以初产妇多见,绝大多数发生于产后3-4周的哺乳期妇女,且初产妇的发病率比经产妇略高1倍,一般为金黄色葡萄球菌感染所致3。乳腺炎是指乳腺的急性化脓性感染,是产褥期的常见病,是所有哺乳动物均可发生的一种由多种原因引起的乳房的炎症, 最常发生于奶牛或奶山羊。临床表现：乳房局部结块,乳汁不畅,有压痛,局部皮肤表面发热,充血肿胀,伴有恶寒、发热、白血球升高等全身症状和体征。目前, 抗菌治疗是治疗乳腺炎的首选方法, 但易产生抗药性致使疗效不断降低, 同时乳中抗菌素的残留可影响人的健康。为了研究乳腺炎的发病机理, 寻求更好的防治药物( 如中草药), 人们正在进行大量的研究工作, 这就需要一种典型的、价廉的、易于制作的乳腺炎动物模型。二、实验动物的选择目前用于科学实验的动物种类很多，各种动物的特点不同，而每一项科学实验都应有最适合的实验动物。因此必需根据实验的目的选择适于致癌、治癌的相同品种、品系、性别、体重、年龄、活动性、健康状态、遗传背景和微生物等方面严厉操纵的各种等级的标准化的实验动物，且对癌变器官的特异性、组织学类型、病因、发病机制、生物学行为等方面与研究的人类乳腺癌近似。建立乳腺癌模型时对动物一般要求其癌诱发率高，饲养方便。常选用的动物主要有大鼠、小鼠、裸鼠、猫、犬及兔。其中，大鼠、小鼠由于成本低，易饲养，且诱癌周期相对较短，故多用于大批量的实验研究。但由于不同科系、性别乃至不同鼠龄的大鼠均会直接影响到诱癌率和造模时间，因此，诱癌率较高的Wistar系雌性大鼠常被选用。三、 动物模型的建立目前，根据制备方法及研究目的的不同，乳腺癌实验动物模型可分为自发性、诱发性、移植性、转基因或基因敲除性及乳腺癌远处转移等5大类，每种动物模型都有各自的建立方法、模型特点和应用条件。1 自发性乳腺癌模型自发性肿瘤是指实验动物种群中自然发生或通过遗传育种培养而形成的一类肿瘤。目前自发性乳腺癌动物模型多采用的是近交系小鼠，如 SHN小鼠，是由兄妹交配维持下来的自发性乳腺癌的一种动物模型，其特点是时间短、癌变率高，一般在出生后4个月开始出现症状，12个月时乳腺肿瘤的患病率可达100%。因此SHN小鼠已成为乳腺肿瘤多级预防、治疗及研究发病机制的良好模型4。自发性肿瘤模型可以为研究者提供回顾性和前瞻性研究，其优点首先是肿瘤的产生未经任何有意识的人工处理，发生条件比较自然，与人类肿瘤的发生更为相似，实验结果更易于扩展外推至人类，并且此种模型更有利于对肿瘤发生有影响的遗传因素及环境因素等的观察。但这种自发性模型中肿瘤发生、发展的时间不一致性较大，不能在短时间内获得大量肿瘤学资料，致使实验时间延长，实验所需动物数量多，实验耗费增大等等。这些都是自发性肿瘤模型的不利条件。2 诱发性乳腺癌模型使用化学物质、物理、生物因素等可在实验动物中诱发乳腺癌的发生5，目前较多用的是化学诱导方式。化学诱导乳腺癌发生一般是用二甲基苯蒽（DMBA）或甲基胆蒽经胃管灌注或皮下注射Wister雌性大鼠。由剂量及观察时间长短的不同可以建立乳腺癌癌前期病变动物模型和乳腺癌模型。雌性Wister大鼠30只,50-60天龄,体重90-110g, 以二甲基苯蒽10mg/100g体重右臀部注射,复制大鼠同时性乳腺癌与纤维肉瘤动物模型。24周后取肿瘤及瘤旁组织标本。以组织学观察乳腺肿瘤均为乳腺癌,与人乳腺癌相似,右后肢肿瘤均为纤维肉瘤,与人纤维肉瘤相似。诱发性实验肿瘤模型研究的开展，使研究得以有计划、有步骤地观察癌变的整个过程。建立此类乳腺癌动物模型，操作容易，靶器官和诱癌剂恒定，诱发形成癌变率高，肿瘤生长速度较慢，肿瘤细胞增殖比率低，倍增时间长，更类似于人体肿瘤细胞动力学特征，故可用于乳腺癌病因学研究、预防性研究以及综合化疗效果评估的研究6-7。但诱导性乳腺癌动物模型的建立过程长，不易同时获得病程或癌块大小较均一的动物，成功率多数达不到100%，实验动物个体差异很大，肿瘤细胞的形态特征差别也很大，浸润和转移能力低，恶性行为表达有限。所以该种模型较少作为肿瘤药物筛选的动物模型。3 移植性乳腺癌动物模型移植性乳腺癌动物模型是指将乳腺癌组织或细胞移植于实验动物而培养出的模型。根据移植物来源不同可分为同种移植和异种移植。同种移植利用已建立的同种乳腺癌细胞株进行同种或同品系动物移植，一般使用免疫功能正常的小鼠。目前已建立的鼠类乳腺癌细胞株有C127，4T1，TM40等，其中4T1和TM40来源于近交系BALB/C小鼠。Shi等8采用4-6周的BALB/C小鼠，选择对数生长期的TM40，在小鼠胸壁肋间或腹壁第对乳腺处皮下接种肿瘤细胞0.1ML，相当于105107细胞只小鼠；一般接种后1周，肉眼便可见皮下肿块，成瘤率为100%；在无任何治疗的情况下，荷瘤小鼠可存活12-15周。这种模型是目前抗癌药物筛选和药效学研究中使用最多的模型。应用同种移植方法建立的乳腺癌动物模型的优点是，周期短、成本低、实验动物均带有同样的肿瘤、肿瘤生长速度较为一致、成功率可达到100%，并且可在实验动物中连续移植，长期保留供实验之用。但值得注意的是此类肿瘤的生长速度快，增殖比率高，体积倍增时间短；这些特点与人体肿瘤生物学特性是显著不同的。异种移植异种移植模型是指利用已建立的人类乳腺癌细胞株移植于免疫缺陷动物体内所建立的动物模型。裸鼠因先天性缺乏胸腺，细胞免疫功能接近于零。所以当人体肿瘤移植到裸鼠体内时无排斥反应；移植后的人体肿瘤保持其原有的组织形态、免疫学特点以及特有的染色体组型和对抗肿瘤药的原有敏感性，且对培养条件等要求比SCID (sever combined immune deficient)鼠低，易于动态观察肿瘤的生长状态。同时人类恶性肿瘤的两大重要特征浸润和转移，在裸鼠上可以通过接种方式、部位的选择，达到较满意的表达效果。因此，裸鼠是目前进行人乳腺癌细胞异位移植最为常用的实验动物。邵志敏等9将经病理诊断证实的女性炎性乳腺癌标本移植至雌性裸鼠皮下，并与非炎性乳腺癌移植瘤MDA-MB231和MDA-MB468进行了比较，证实该动物模型表现为人类炎性乳腺癌的生物学特征，认为此种动物模型是研究肿瘤转移机制的良好动物模型。异种移植肿瘤模型的应用日益广泛，且是目前研究最多的肿瘤模型。容易人为操作，免疫排斥反应弱，肿瘤移植后生长良好，能保持肿瘤细胞的原有形态和生物学特性，周期短，成瘤稳定，成功率常可达到100%，均一性好，患病率高，成瘤时间差异不大，容易施加干扰因素。缺点：移植肿瘤的特性、宿主 因素、接种部位、激素和宿主性别的依赖性都影响 人类肿瘤裸鼠移植效果。但是，免疫抑制预处理常常作用于各种细胞因子，中断它们的级联反应，还会对肿瘤基质各种类型的细胞产生强烈影响，而这些细胞与肿瘤实质细胞又存在密切的关系。因此这样的处理容易影响到肿瘤的生物学行为，也即限制了该模型的应用。4 基因乳腺癌动物模型转基因动物（transgenic animal）是指用实验的方法，有目的地把外源基因（包括人的基因）或特定DNA片段导入动物受精卵中，外源基因与动物本身基因整合后，它就能随着动物细胞的分裂而增殖，并稳定地转给后代的一类动物。（1）转基因乳腺癌动物模型转基因动物是指用人工的方法将外源目的基因或特定的片段导入宿主动物体内，使之在宿主基因组中稳定整合而得以表达，并能遗传给后代的一类动物。利用转基因技术建立的乳腺癌动物模型，目前研究较多的是MMVT-Wnt1转基因小鼠和crel转基因鼠。研究发现，在由鼠乳腺肿瘤病毒（MMVT）感染所致的小鼠乳腺癌中，MMVT原病毒的插入位点位于Wnt1基因编码区之外。MMVT-LTR（鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复启动子）只是作为增强子，激活Wnt1在乳腺上皮细胞中的表达。据此可利用MMVT增强子的作用建立了MMVT-Wnt1转基因小鼠模型；并在分子水平证实了在MMVT-Wnt1转基因小鼠的乳腺中有Wnt1基因的高水平表达，而这种高表达可以激活自身及邻近细胞膜上的Wnt蛋白受体，引起乳腺上皮细胞的恶性转化10。MMVT-Wnt1转基因小鼠，处女鼠在6月龄时有50%发生乳腺肿瘤，余者在年时死于肿瘤；有15% 发生乳腺肿瘤，且其发生时间一般不受遗传背景的影响。它已广泛地应用于各种研究中，是研究乳腺癌发病机制及抗乳腺癌药物良好的高发乳腺癌动物模型。(2)基因敲除乳腺癌动物模型基因敲除技术是指利用同源重组将具有同源序列的有功能基因置换出来，造成功能基因的缺失或失活的方法。运用该技术常规敲除实验动物基因组中的乳腺癌易感基因，即建立了基因敲除乳腺癌动物模型。P53基因为抑癌基因，该基因的突变或缺失，可导致细胞过度增殖，进而发生癌变。Umesako等11利用基因敲近年来的研究发明了一种更为先进的基因敲除动物模型即条件性基因敲除鼠，利用噬菌体P1的Cre重组酶，催化切除两个Lox P识别位点之间的靶基因的目标片段进而建立的模型12。该项技术能在任何类型细胞的任何一个特定时间点剔除肿瘤易感基因，而且能用少数的体细胞模拟遗传性乳腺癌的细胞变化。例如转化生长因子亚型（TGF）在正常生理活动中起生长因子作用，能调节机体生长发育、细胞增殖及免疫反应等。为了解TGF信号途径在乳腺肿瘤发生、发展、转移过程中的作用，Forrester等13将乳腺上皮中编码TGF受体 型（Tgfbr 2）的基因剔除，构建了Tgfbr2 MGKO鼠。该鼠由于乳腺上皮Tgfbr2的丢失，引起乳腺腺叶、腺泡增生及凋亡现象者增多，并且发生乳腺癌的中位潜伏期缩短及肺转移增多。因此认为，TGF信号途径在乳腺肿瘤发生中起抑制肿瘤发生发展的作用。转基因或基因敲除鼠模型中肿瘤生长和进展快速，可以比较方便地获得肿瘤发展的整个过程。因此主要用于肿瘤转化及肿瘤发生中基因生物学功能的研究。5 乳腺癌远处转移动物模型转移是恶性肿瘤的基本生物学特性之一，研究转移是肿瘤研究的一个重要领域。根据途径不同分为实验性转移和自发性转移模型。实验性转移适合研究肿瘤细胞转移后期阶段的着床、生长、血管生成等；自发性转移能再现肿瘤细胞转移的全过程，是较为理想的乳腺癌远处转移模型。细胞原位植入、尾静脉注入或左心室注射，实验鼠都可自发产生远处转移。骨是乳腺癌发生远处转移的最为常见的部位之一。乳腺癌骨转移动物模型是研究人乳腺癌骨转移的发病机制及其治疗措施的重要工具。Hiraga 等14将4T1/luc细胞原位植入实验鼠，建立了自发性的骨转移模型。在此基础上研究发现，口服优福定和唑来膦酸可增加4T1/luc细胞的凋亡并抑制破骨细胞样细胞形成，二者联合治疗对乳腺癌骨转移有较好的效果。Bauerle等15采用绿色荧光蛋白转染人乳腺癌细胞株MDA-MB231，建立了仅在裸鼠后腿有溶骨性病变的动物模型，为有效研究乳腺癌的骨转移病变提供了更为可靠的动物模型。乳腺癌远处转移动物模型的探索，是进行乳腺癌研究的重要内容之一。它能使人们更深入地理解肿瘤转移的复杂性，有利于寻找肿瘤转移抑制或促进因素，进一步为开发新的治疗药物和方法提供新的途径。四、 评价与展望 在研究人类乳腺癌的发生、发展、转移、治疗等方面发挥着重要的作用。理想的乳腺癌动物模型应具备：致癌方法简单、易行；经济、快速；指标客观、明确；对癌变器官的特异性高；重复性好；诱发乳腺癌的病理类型、生物学行为、电镜下表现及组织化学等改变应具有与人体癌肿相似的条件。必须清醒地认识到，目前建立的各种乳腺癌动物模型尚未达到理想模型的全部条件，都有着其自身的优点和缺点。研究者只能根据不同的实验目的，选择与实验要求近似的动物模型进行研究。另外，特别值得注意的是，由于生活环境和遗传背景等因素的差异，动物模型所表现出来的乳腺癌不能等同于人类的乳腺癌，动物实验比较和推论出来的人类疾病，决不能等同于人类疾病。五、 文献资料Smigal C. 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