糖化血红蛋白形成过程.doc

糖化血红蛋白
信息类别：产品专业知识　作者：admin 发布时间：2008-7-23 15:23:48　浏览量：831 次
糖化血红蛋白

一、概述
血糖测定可以评估收集血样时糖尿病患者的碳水化合物代谢情况。相反的，糖化血红蛋
白和果糖胺可以回顾性地评价血糖，很大程度上它们不依赖于病人的生理节奏模式、饮食及其他短暂性的葡萄糖浓度波动，而综合了几天或几周过程内这种波动。
葡萄糖及其他单糖和蛋白质的自由氨基反应，取决于它们的浓度。另一方面，就蛋白质而言，各氨基的Pk和邻近的多肽结构是反应的关键限速步骤。这种不可逆的、非酶催化的反应称为糖基化。
除血浆蛋白的半衰期和浓度不同以及有时体内波动相对大之外，糖化血红蛋白作为一个长期的参数评定血糖浓度特别适合。
血红蛋白的半衰期定义为红细胞存活时间，相对恒定在100～120 d。除血红蛋白半衰期的影响外，糖化程度基本取决于血糖升高的程度以及持续时间。糖化是不可逆的，并且降解血红蛋白糖化位点的酶系也未知。
总的糖化血清蛋白的检测分析，因葡萄糖-蛋白复合物中的酮胺结构，又称果糖胺。测定单一糖化蛋白（主要白蛋白），这些试剂已经商品化。由于存在许多分析和解释的问题，果糖胺的测定通常不用来监测糖尿病。因此该试验不在这里详细讨论。
在一些病例中，糖化血红蛋白的测定并不可靠或价值有限，果糖胺的测定短时间内可作为长期血糖监测的一种替代方法。
糖化血红蛋白
自从1968年第一次描述了在糖尿病患者中发现的异常血红蛋白以来，关于葡萄糖及其他碳水化合物与血红蛋白结合的糖化产物的术语，已经变化几次。自从1986年，IUPAC-IUB（国际纯化学与应用化学联合会）已经推荐使用糖化血红蛋白这一名称，即非酶促的血红蛋白的糖基化。另一方面，更高级的术语糖基化血红蛋白经常地用于日常语言和现在的出版物里。
根据每个糖化位点和反应参与物，总的糖化血红蛋白分成若干个亚组分。天然（非糖化）血红蛋白是A0（2α、2β链)。亚组分（HbA1a1 , HbA1a2 , HbA1b和HbA1c）因血红蛋白β链-N末端缬氨酸的游离氨基与不同碳水化合物糖基化而形成。这些亚组分总称为HbA1。除了血红蛋白β链的N末端缬氨酸外，血红蛋白分子内其他游离氨基也参与糖基化（α链N末端缬氨酸、赖氨酸ε-氨基）。相对于HbA1，所有β-链N末端和其他游离氨基糖基化的血红蛋白被称作总糖化血红蛋白。
除基本的成人血红蛋白AO外，在健康人里发现少量的胎儿血红蛋白HbF（2α、2γ链）和血红蛋白A2（2α、2δ链）。缬氨酸在δ链N末端，以类似的方式糖基化，例如，通过与葡萄糖的共价键形成HbA2c。
表1 糖化血红蛋白命名
HbA （95%～97%） 血红蛋白A
HbA0 （90%） 非糖化血红蛋白部分
HbA1 （5%～7%） 糖化血红蛋白A0（α2β2）
-HbA1a 糖化血红蛋白HbA1β链
HbA1a1 果糖-1，6-二磷酸的糖化
HbA1a2 葡萄糖-6-磷酸的糖化
-HbA1b HbA1带有未知反应部分
-HbA1c 75%～80%的HbA1，在β链-N末端缬氨酸D-葡萄糖糖化
1-HbA1c 不稳定的HbA1c（醛亚肽）
S-HbA0 稳定的HbA1c（酮胺）
HbA2 (＜3%) 血红蛋白A2（α2δ2）
HbF (＜1%) 血红蛋白F（α2γ2）
亲和层析测定的糖化血红蛋白作为总糖化血红蛋白。

二、指征
-糖尿病中碳水化合物代谢长期的回顾性的监测。糖化血红蛋白测定推荐频率取决于糖尿病种类和（或）治疗（表2）。

三、检测方法
分析糖化血红蛋白有几个实用的方法（表3）。
阳离子交换色谱法
原理：糖化导致血红蛋白分子表面阳离子丢失。在弱的阳离子交换剂中，例如Biorex70，伴有增加的离子浓度和（或）pH下降，糖化血红蛋白在非糖化血红蛋白前先洗脱。这现象产生了糖化血红蛋白最初的术语“快速血红蛋白”。阳离子交换色谱法可用于小型、微型或大型柱层析方法或部分或全自动的PHLC/FPLC方法。因为，其他翻译后修饰血红蛋白，例如醛亚胺型、甲酰化、乙酰化、乙醛加合物、降解物、老化人工物品和异常血红蛋白电荷交换也不同于正常的HbA0，所以已经列出了许多阳离子交换层析法的干扰因素。使用常规HPLC的方法。分离糖化血红蛋白亚组分是能达到满足需求的临床精密度。然而，已知HbA1c的峰不是均一的而是包含一重要的非糖化血红蛋白部分。少数糖化血红蛋白也整合到HbA0主峰中。通过使用特殊的柱原料（poly-CATA）和30～40 min分离时间可以改善分离效果。这些方法可以作为参考步骤但不适合常规使用。所有的阳离子交换色谱法对pH和温度的变化敏感，因此要控制pH和温度。
表2 糖尿病患者HbA1c检测时间频度的推荐
糖尿病类型/治疗
推荐频率
Ⅰ型糖尿病，最小量或常规的治疗
每年3～4次（没有建立最佳频率）
Ⅰ型糖尿病
每1～2月
加强治疗Ⅱ型糖尿病
稳定的代谢条件下每年2次
糖尿病孕妇
每1～2月
妊娠期糖尿病
每1～2月

说明：根据红细胞代谢动力学推测初始HbA1c值大约每日破坏1/120（≈0.83%）。因为糖化在合适的治疗下甚至健康人也产生，故这个理论值在体外不能达到。控制不理想的糖尿病患者通过加强治疗而达到血糖量正常，可以发现HbA1c值最大下降率以大约每10 d下降正常血糖的1%（绝对的）。由于测定糖化血红蛋白方法的精确性，两次测定值HbA1c的差异大约1%就可认为具有临床相关性。因为这些原因，在HbA1c两次测定间至少有2周的时间，推荐4～6周的间隔。
因为升高的糖化血红蛋白值是长期高糖血症的糖尿病患者相当可靠的指示剂，因而是可能诊断糖尿病的。在未治疗的个体，正常的糖化血红蛋白值临床上可以排除明显的糖尿病。但由于它不能检测糖耐量受损，所以作为诊断和（或）筛选目的唯一的参数，使用糖化血红蛋白是存在问题的。
表3 糖化血红蛋白分析方法

步骤
原理
分析物
样本体积
分析时间
评    估
柱色谱法（巨柱）
离子交换色谱法
HbA1a，HbA1b，HbA1c
100μl血
8～18 h
醛亚胺被部分测定，HbF、HbS、HbC、乙醛副产品产生干扰
微柱
离子交换色谱法
HbA1
100μl血
20 min
受Hb变异体干扰、对温度和pH敏感
HPLC
离子交换色谱法
HbA1a，HbA1b，HbA1c
10～400μl血
3.3～8 min
受Hb变异体干扰、对温度和pH敏感
FPLC
离子交换色谱法
HbA1a，HbA1b，HbA1c醛亚胺
20～100μl血
5 min
分离HbA1c和醛亚胺的效果最好；参考方法
硫代巴比妥酸
水解和酮酸己糖比色测定
HbA1c
2～4μl血
8 h
仅检测酮胺形式，醛亚胺被消除；也和硅酸反应
电池
电渗
HbA1c
20μl血
35 min
醛亚胺干扰
等电聚焦
pH5～6.5
HbA1c醛亚胺
10μl血
1 h
可检测异常血红蛋白
亲和层析色谱法
苯基硼酸盐柱
总糖化血红蛋白
150μl血
1 h达到20个样本
HbF、HbS、HbC和翻译后修饰物不干扰
免疫化学方法
特异的抗体（单克隆，多克隆）的酶免法和免疫比浊法
HbA1c，HbA2c
10～50μl血
每1 h达到250个样本
Hb变异体不干扰，能检测糖化HbA2,HbS1c,但不能检测HbF1c

电泳
原理：相比于非糖化血红蛋白，因糖化而变化的总电荷和糖化血红蛋白的等电点变化是琼脂糖凝胶或者pH梯度5.0～6.5的凝胶等电聚焦电泳分离的基础。琼脂糖凝胶电泳的血红蛋白亚组分分辨率很小，而等电聚焦可以更好地使亚组分分离。可能由于试验的自动化程度不足，重要性已经下降。
亲和层析
原理：硼酸结合顺式-羟基。商品化的m-氨基苯硼酸琼脂糖共价结合的亲和柱已可用于微柱分析检测。将血样本中的血红蛋白加到层析柱后，所有的糖化血红蛋白（HbA1和旁链糖化的血红蛋白；总糖化血红蛋白）与硼酸结合而非糖化血红蛋白通过层析柱可被测量。在加入高浓度也包含顺式-羟基的多羟基复合物，例如山梨醇后，糖化血红蛋白与硼酸的结合被替换而从柱子上洗脱下来。亲和层析法对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感。利用亲和层析法，仅能测定总糖化血红蛋白。广泛使用的亲和层析方法，允许用经验算法从总糖化血红蛋白值计算出“标准的HbA1c。”。
免疫分析
在缬氨酸β-N-末端糖化的血红蛋白提供了一个容易被抗体识别的抗原表位。可以用单克隆抗体或多克隆抗体进行放射免疫分析和免疫酶学分析测定，抗体特异识别β链N-末端糖化的血红蛋白最后4～8个氨基酸组成的抗原表位。异常的血红蛋白或翻译后经修饰的血红蛋白无干扰。
目前的免疫化学试验不仅检测HbA1c，通常也同时检测HbA2c，因为血红蛋白A2糖化δ链的表位是相同的。抗体直接抗β-链的最后四个氨基酸的糖化表位的免疫化学试验也可用进行检测，例如HbS1c。在大多数情况下HbA2c意义不大，虽然镰刀细胞病时可以准确地测定缬氨酸β-N-氨基末端糖化程度，但它仍不能100%代表HbA1c。

四、样本
EDTA血 1ml
肝素血 1ml
毛细血管血 预先包装系统
（肝素化的毛细收集管）

五、参考范围
糖化血红蛋白在年龄或性别上的相关性并不明显的。参考范围取决于分析方法或试剂（表4）。
表4 糖化血红蛋白参考范围
方    法
商 标 名 称
参    数
参考区间（%）
亲和层析
GHb  IMx
GHb
HbA1c**
GHb 4.8～7.8
HbA1c 4.4～6.4
亲和层析
Glyc-Affin
GHb
GHb 4.0～8.0
亲和层析
BM HbA1
HbA1
HbA1 5.0～8.0
亲和层析
Glyc-Hb
GHb
GHb 5.0～8.0
亲和层析（微柱）
HbA1 微柱试验
HbA1
HbA1 3.4～6.1
琼脂糖凝胶电泳
DIATRAC
HbA1c
HbA1c 3.3～5.6
免疫比浊，多克隆抗体
TinaQuant HbA1c
HbA1c
HbA1c 4.3～5.8*
HbA1c 3.6～5.3*
EIA，单克隆抗体
DAKO HbA1c
HbA1c
HbA1c 2.8～4.9*
HbA1c 4.5～5.9*
免疫比浊，单克隆抗体
DCA2000
HbA1c
HbA1c 4.2～6.3
免疫比浊，单克隆抗体
Unimate
HbA1c
HbA1c 4.5～5.7
离子交换色谱法（微柱）
HbA1c微柱试验
HbA1c
HbA1c 4.2～5.9
HPLC离子交换色谱法
DIAMAT
HbA1  HbA1c
HbA1 5.1～7.3
HbA1c 4.3～6.1
HPLC离子交换色谱法
HS-8
HbA1  HbA1c
HbA1 5.0～7.8
HbA1c 4.4～5.7
HPLC离子交换色谱法
L-9100
HbA1  HbA1c
HbA1 4.5～6.0
HbA1c 3.4～4.7

数据来自包装说明书或参考文献，*有不同的标准品；**“标准血红蛋白”；GHb：总糖化血红蛋白。

六、临床意义
评价糖尿病患者血糖控制的质量可用两种不同的方法：
-第一种方法，6～8周前的平均血糖与相应的糖化血红蛋白值相关。通过使用一种算法，6～8周前的平均血糖可以从糖化血红蛋白值导出。这些算法（表5）仅对个别方法有效并且不可广泛地应用。
-另一种方法把临床经验与参考范围的临界值外推法结合。根据WHO的St. Vincent报告，例如，血糖水平控制理想，糖化血红蛋白值低于参考人群平均值以上三个标准差（99.9%参考人群值低于这极限）。血糖水平控制不理想，糖化血红蛋白值高于参考人群平均值以上五个标准差。在这些值之间的糖化血红蛋白值说明血糖水平的控制在临界的理想状态（表6）。
表5 平均血糖浓度和糖化血红蛋白值之间的关系（举例）
方程式
HbA1c(%)＝2.07×平均血糖浓度（mmol/L）0.596；r＝0.98
HbA1c(%)＝0.038×平均血糖浓度（mmol/L）＋3.78；r＝0.89
平均血糖浓度(mg/dl) ＝33.3×HbA1c(%)－86；r＝0.96

七、评价和问题
标准化
目前没有一个认可的参照物。但有基于特异血红蛋白β链N-末端残基的HbA1c候选参考方法。用内切酶酶解Gluc-C完整血红蛋白分子的方法已经被优化并用于获得HbA1c和HbAo的β链N-末端六肽。这些肽已通过反相HPLC分离并通过电离质谱分析法定量。
质量控制
对于糖化血红蛋白的测定，许多国内和国际的实验室调查组织提供了室间质量控制。因为没有参考方法或国际认可的参考物可用，靶值往往根据不同的测定方法和（或）制造商提供的值或同一分析系统组模式获得。
表6 血糖控制的评价（根据St. Vincent报告）
参数
好
（＜ ＋3SD）
临界
（ ＋3～5SD）
差
（＞ ＋5SD）
HbA1（%）
HbA1c（%）
＜8.0*
＜6.5*
8.0～9.5*
6.5～7.5*
＞9.5*
＞7.5*
取决于使用的方法。参考平均值和 倍标准差（SD）
*示范值，参考人群：HbA1： ＝5.75；SD＝0.75
HbA1c： ＝5.0；SD＝0.5
采样，稳定性
无需特别的条件辅助病人的准备和样本采集。高脂血症的血样由于样本的浊度会使光度计测定产生错误。因为在体外特别在高糖血症时，糖化将继续进行，所以样本收集之后应尽可能快的分析。
样本长时间存储后（3～4 d），红细胞代谢产生血红蛋白相关的谷胱甘肽加合物（HbA1d/ HbA3），特别是在色谱法时会干扰试验。溶血产物不如全血稳定。
因为糖化血红蛋白的结果与总血红蛋白有关，体位或静脉或毛细血管采血将不会引起干扰。
因为血红蛋白的寿命长以及特别糖化动力学，估计不受短期生理节奏影响。仅瞬间的高糖血症可以引起醛亚胺部分的升高。
血红蛋白病
已经报道了有超过400种异常的血红蛋白（氨基酸交换，缺失）。一定程度上，这些主要影响糖化血红蛋白的色谱测定。因每次洗脱模式的不同，糖化血红蛋白值可能是过低或过高。从体外实验已知糖化血红蛋白值＞20%是不太可能的，往往提示存在异常的血红蛋白。此外，血红蛋白病经常与造血作用损伤和（或）溶血有关，这为解释与方法无关的糖化血红蛋白值的变化增加了困难。亲和色谱法不受异常的血红蛋白影响。对于免疫化学方法，异常的血红蛋白的干扰理论上是可能的，因为如果这些血红蛋白改变HbA1c表位的三维结构会使它难接近抗体。然而迄今为止，并没有描述这样异常的血红蛋白。
胎儿血红蛋白（HbF）在胎儿出生时占到所有血红蛋白的大约80%，在出生后第1个月，下降到不到1%。与方法相关的胎儿血红蛋白的干扰，特别是在色谱法和电泳法中，仅在婴儿达到第9个月前和罕见的持续带有遗传性胎儿血红蛋白的成年人，以及地中海贫血产生的代偿的，过量的HbF，才能被检测到。
血液学疾病
血红蛋白的长寿命连同特殊的糖化动力学使我们可以根据糖化血红蛋白值回顾性评价血糖浓度。红细胞存活时间的缩短可导致血红蛋白糖化下降。
所有缩短红细胞存活时间的疾病，比如慢性溶血，会产生与方法学无关的假性的低糖化血红蛋白值。作为替代物，糖化血清蛋白（果糖胺）的测定可以提供病人前2～3周中的代谢的情况。
延长红细胞存活时间的疾病，例如脾切除病人，因为延长时间通常是极少的，所以不引起糖化血红蛋白值显著上升。
表7 异常血红蛋白和翻译后修饰的可能影响
测定原理
方法
HbF
Hb
S/C等
糖化变异体
如HbS1c
1-HbA1c
(醛亚胺)
HbA1ach
乙醛
HbA1c＋
乙酰水杨酸
HbA1d
谷胱甘肽（储备）
碳化Hb
离子交换色谱法
HPLC/
FPLC微柱
＋
＋
＋
＋
－
－
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
电泳
琼脂糖
凝胶IEF*
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
亲和色谱法
硼酸结合
－
－
＋
－
－
－
－
－
免疫分析
比浊法
EIA
－
－
－
－
＋
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
化学法
TBA法
－
－
＋
－
－
－
－
－
＋可能的影响和（或）修饰或糖化变异体可被检测到；*等电聚焦。
药物治疗，药物和化学物
大量药物和环境中的化学物品可以与血红蛋白形成化合物，主要干扰色谱方法。乙酰水杨酸（乙酰化血红蛋白）和酒精（乙醛加合物的血红蛋白）的作用数据和有关这些化合物的分析及临床相关性是有争论的。特别是大量地连续服用这些物质，应考虑可能的影响。
肾功能不全
部分尿素自然地分解成氰酸盐和铵离子。如同异氰酸盐，氰酸盐通过氨甲酰基化和许多的蛋白质形成稳定化合物。肾衰竭和尿素浓度增加的病人，可以观察到氰酸盐浓度上升并且可检测出氨甲酰基化血红蛋白。层析法测定糖化血红蛋白可能会受氨甲酰基化血红蛋白干扰。肾功能不全的病人，特别有尿毒症的，经常有异常的红细胞动力学和红细胞存活时间减少。肾衰竭病人的糖化血红蛋白值经常是不可靠的。由于并发蛋白尿，所以这些病人果糖胺的测定对于回顾性评价葡萄糖代谢不能作为替代方案。
不稳定的糖化血红蛋白（醛亚胺）
不稳定的醛亚胺的形成与血红蛋白和葡萄糖的反应浓度成正比，而稳定的酮胺化合物的形成程度取决于不稳定的醛亚胺的浓度。因为色谱和电泳程序既检测醛亚胺又检测酮胺。所以在分析之前，应除去醛亚胺。这可以通过红细胞冲洗、滤过、pH的变化，或化学清除来完成。席夫碱的化学清除包括利用例如氨基脲的所谓的“席夫碱转移”反应。免疫化学方法和那些利用亲和色谱的方法不受醛亚胺中间物的影响。

八、生化和生理
在组织，葡萄糖与长寿命的蛋白质反应，例如血红蛋白、胶原、碱性髓磷脂蛋白质，依靠高血糖水平和持续时间稳定地发生反应。在这过程中，葡萄糖分子游离醛基和蛋白质主要的氨基相互作用形成席夫碱（醛亚胺）。这反应是可逆的；所以短时间的高血糖仅导致极少的糖化。这个最初过程发生在几小时内，接着的第二个慢过程，发生在几天内并且以分子内重排作用为特征（Amadori重排）。作为这过程的一部分，醛亚胺变为稳定的酮胺（图1）。进一步地反应导致所谓的Maillard产物，也被认为是高级糖化终产物。葡萄糖可以依靠“葡萄糖载体”进入红细胞。红细胞没有能够分解酮胺的酶。因此直到血红蛋白在红细胞的退化期间分解才有可能排除。在健康的个体红细胞存活时间是100～120 d，平均半衰期60 d。

糖化血红蛋白
信息类别：产品专业知识　作者：admin 发布时间：2008-7-23 15:23:48　浏览量：831 次
糖化血红蛋白

一、概述
血糖测定可以评估收集血样时糖尿病患者的碳水化合物代谢情况。相反的，糖化血红蛋
白和果糖胺可以回顾性地评价血糖，很大程度上它们不依赖于病人的生理节奏模式、饮食及其他短暂性的葡萄糖浓度波动，而综合了几天或几周过程内这种波动。
葡萄糖及其他单糖和蛋白质的自由氨基反应，取决于它们的浓度。另一方面，就蛋白质而言，各氨基的Pk和邻近的多肽结构是反应的关键限速步骤。这种不可逆的、非酶催化的反应称为糖基化。
除血浆蛋白的半衰期和浓度不同以及有时体内波动相对大之外，糖化血红蛋白作为一个长期的参数评定血糖浓度特别适合。
血红蛋白的半衰期定义为红细胞存活时间，相对恒定在100～120 d。除血红蛋白半衰期的影响外，糖化程度基本取决于血糖升高的程度以及持续时间。糖化是不可逆的，并且降解血红蛋白糖化位点的酶系也未知。
总的糖化血清蛋白的检测分析，因葡萄糖-蛋白复合物中的酮胺结构，又称果糖胺。测定单一糖化蛋白（主要白蛋白），这些试剂已经商品化。由于存在许多分析和解释的问题，果糖胺的测定通常不用来监测糖尿病。因此该试验不在这里详细讨论。
在一些病例中，糖化血红蛋白的测定并不可靠或价值有限，果糖胺的测定短时间内可作为长期血糖监测的一种替代方法。
糖化血红蛋白
自从1968年第一次描述了在糖尿病患者中发现的异常血红蛋白以来，关于葡萄糖及其他碳水化合物与血红蛋白结合的糖化产物的术语，已经变化几次。自从1986年，IUPAC-IUB（国际纯化学与应用化学联合会）已经推荐使用糖化血红蛋白这一名称，即非酶促的血红蛋白的糖基化。另一方面，更高级的术语糖基化血红蛋白经常地用于日常语言和现在的出版物里。
根据每个糖化位点和反应参与物，总的糖化血红蛋白分成若干个亚组分。天然（非糖化）血红蛋白是A0（2α、2β链)。亚组分（HbA1a1 , HbA1a2 , HbA1b和HbA1c）因血红蛋白β链-N末端缬氨酸的游离氨基与不同碳水化合物糖基化而形成。这些亚组分总称为HbA1。除了血红蛋白β链的N末端缬氨酸外，血红蛋白分子内其他游离氨基也参与糖基化（α链N末端缬氨酸、赖氨酸ε-氨基）。相对于HbA1，所有β-链N末端和其他游离氨基糖基化的血红蛋白被称作总糖化血红蛋白。
除基本的成人血红蛋白AO外，在健康人里发现少量的胎儿血红蛋白HbF（2α、2γ链）和血红蛋白A2（2α、2δ链）。缬氨酸在δ链N末端，以类似的方式糖基化，例如，通过与葡萄糖的共价键形成HbA2c。
表1 糖化血红蛋白命名
HbA
（95%～97%）
血红蛋白A
HbA0
（90%）
非糖化血红蛋白部分
HbA1
（5%～7%）
糖化血红蛋白A0（α2β2）
  -HbA1a

糖化血红蛋白HbA1β链

HbA1a1
果糖-1，6-二磷酸的糖化

HbA1a2
葡萄糖-6-磷酸的糖化
-HbA1b

HbA1带有未知反应部分
-HbA1c

75%～80%的HbA1，在β链-N末端缬氨酸D-葡萄糖糖化

1-HbA1c
不稳定的HbA1c（醛亚肽）

S-HbA0
稳定的HbA1c（酮胺）
HbA2
(＜3%)
血红蛋白A2（α2δ2）
HbF
(＜1%)
血红蛋白F（α2γ2）
亲和层析测定的糖化血红蛋白作为总糖化血红蛋白。

二、指征
-糖尿病中碳水化合物代谢长期的回顾性的监测。糖化血红蛋白测定推荐频率取决于糖尿病种类和（或）治疗（表2）。

三、检测方法
分析糖化血红蛋白有几个实用的方法（表3）。
阳离子交换色谱法
原理：糖化导致血红蛋白分子表面阳离子丢失。在弱的阳离子交换剂中，例如Biorex70，伴有增加的离子浓度和（或）pH下降，糖化血红蛋白在非糖化血红蛋白前先洗脱。这现象产生了糖化血红蛋白最初的术语“快速血红蛋白”。阳离子交换色谱法可用于小型、微型或大型柱层析方法或部分或全自动的PHLC/FPLC方法。因为，其他翻译后修饰血红蛋白，例如醛亚胺型、甲酰化、乙酰化、乙醛加合物、降解物、老化人工物品和异常血红蛋白电荷交换也不同于正常的HbA0，所以已经列出了许多阳离子交换层析法的干扰因素。使用常规HPLC的方法。分离糖化血红蛋白亚组分是能达到满足需求的临床精密度。然而，已知HbA1c的峰不是均一的而是包含一重要的非糖化血红蛋白部分。少数糖化血红蛋白也整合到HbA0主峰中。通过使用特殊的柱原料（poly-CATA）和30～40 min分离时间可以改善分离效果。这些方法可以作为参考步骤但不适合常规使用。所有的阳离子交换色谱法对pH和温度的变化敏感，因此要控制pH和温度。
表2 糖尿病患者HbA1c检测时间频度的推荐
糖尿病类型/治疗
推荐频率
Ⅰ型糖尿病，最小量或常规的治疗
每年3～4次（没有建立最佳频率）
Ⅰ型糖尿病
每1～2月
加强治疗Ⅱ型糖尿病
稳定的代谢条件下每年2次
糖尿病孕妇
每1～2月
妊娠期糖尿病
每1～2月
说明：根据红细胞代谢动力学推测初始HbA1c值大约每日破坏1/120（≈0.83%）。因为糖化在合适的治疗下甚至健康人也产生，故这个理论值在体外不能达到。控制不理想的糖尿病患者通过加强治疗而达到血糖量正常，可以发现HbA1c值最大下降率以大约每10 d下降正常血糖的1%（绝对的）。由于测定糖化血红蛋白方法的精确性，两次测定值HbA1c的差异大约1%就可认为具有临床相关性。因为这些原因，在HbA1c两次测定间至少有2周的时间，推荐4～6周的间隔。
因为升高的糖化血红蛋白值是长期高糖血症的糖尿病患者相当可靠的指示剂，因而是可能诊断糖尿病的。在未治疗的个体，正常的糖化血红蛋白值临床上可以排除明显的糖尿病。但由于它不能检测糖耐量受损，所以作为诊断和（或）筛选目的唯一的参数，使用糖化血红蛋白是存在问题的。
表3 糖化血红蛋白分析方法
步骤
原理
分析物
样本体积
分析时间
评    估
柱色谱法（巨柱）
离子交换色谱法
HbA1a，HbA1b，HbA1c
100μl血
8～18 h
醛亚胺被部分测定，HbF、HbS、HbC、乙醛副产品产生干扰
微柱
离子交换色谱法
HbA1
100μl血
20 min
受Hb变异体干扰、对温度和pH敏感
HPLC
离子交换色谱法
HbA1a，HbA1b，HbA1c
10～400μl血
3.3～8 min
受Hb变异体干扰、对温度和pH敏感
FPLC
离子交换色谱法
HbA1a，HbA1b，HbA1c醛亚胺
20～100μl血
5 min
分离HbA1c和醛亚胺的效果最好；参考方法
硫代巴比妥酸
水解和酮酸己糖比色测定
HbA1c
2～4μl血
8 h
仅检测酮胺形式，醛亚胺被消除；也和硅酸反应
电池
电渗
HbA1c
20μl血
35 min
醛亚胺干扰
等电聚焦
pH5～6.5
HbA1c醛亚胺
10μl血
1 h
可检测异常血红蛋白
亲和层析色谱法
苯基硼酸盐柱
总糖化血红蛋白
150μl血
1 h达到20个样本
HbF、HbS、HbC和翻译后修饰物不干扰
免疫化学方法
特异的抗体（单克隆，多克隆）的酶免法和免疫比浊法
HbA1c，HbA2c
10～50μl血
每1 h达到250个样本
Hb变异体不干扰，能检测糖化HbA2,HbS1c,但不能检测HbF1c
电泳
原理：相比于非糖化血红蛋白，因糖化而变化的总电荷和糖化血红蛋白的等电点变化是琼脂糖凝胶或者pH梯度5.0～6.5的凝胶等电聚焦电泳分离的基础。琼脂糖凝胶电泳的血红蛋白亚组分分辨率很小，而等电聚焦可以更好地使亚组分分离。可能由于试验的自动化程度不足，重要性已经下降。
亲和层析
原理：硼酸结合顺式-羟基。商品化的m-氨基苯硼酸琼脂糖共价结合的亲和柱已可用于微柱分析检测。将血样本中的血红蛋白加到层析柱后，所有的糖化血红蛋白（HbA1和旁链糖化的血红蛋白；总糖化血红蛋白）与硼酸结合而非糖化血红蛋白通过层析柱可被测量。在加入高浓度也包含顺式-羟基的多羟基复合物，例如山梨醇后，糖化血红蛋白与硼酸的结合被替换而从柱子上洗脱下来。亲和层析法对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感。利用亲和层析法，仅能测定总糖化血红蛋白。广泛使用的亲和层析方法，允许用经验算法从总糖化血红蛋白值计算出“标准的HbA1c。”。
免疫分析
在缬氨酸β-N-末端糖化的血红蛋白提供了一个容易被抗体识别的抗原表位。可以用单克隆抗体或多克隆抗体进行放射免疫分析和免疫酶学分析测定，抗体特异识别β链N-末端糖化的血红蛋白最后4～8个氨基酸组成的抗原表位。异常的血红蛋白或翻译后经修饰的血红蛋白无干扰。
目前的免疫化学试验不仅检测HbA1c，通常也同时检测HbA2c，因为血红蛋白A2糖化δ链的表位是相同的。抗体直接抗β-链的最后四个氨基酸的糖化表位的免疫化学试验也可用进行检测，例如HbS1c。在大多数情况下HbA2c意义不大，虽然镰刀细胞病时可以准确地测定缬氨酸β-N-氨基末端糖化程度，但它仍不能100%代表HbA1c。

四、样本
EDTA血 1ml
肝素血 1ml
毛细血管血 预先包装系统
（肝素化的毛细收集管）

五、参考范围
糖化血红蛋白在年龄或性别上的相关性并不明显的。参考范围取决于分析方法或试剂（表4）。
表4 糖化血红蛋白参考范围
方    法
商 标 名 称
参    数
参考区间（%）
亲和层析
GHb  IMx
GHb
HbA1c**
GHb 4.8～7.8
HbA1c 4.4～6.4
亲和层析
Glyc-Affin
GHb
GHb 4.0～8.0
亲和层析
BM HbA1
HbA1
HbA1 5.0～8.0
亲和层析
Glyc-Hb
GHb
GHb 5.0～8.0
亲和层析（微柱）
HbA1 微柱试验
HbA1
HbA1 3.4～6.1
琼脂糖凝胶电泳
DIATRAC
HbA1c
HbA1c 3.3～5.6
免疫比浊，多克隆抗体
TinaQuant HbA1c
HbA1c
HbA1c 4.3～5.8*
HbA1c 3.6～5.3*
EIA，单克隆抗体
DAKO HbA1c
HbA1c
HbA1c 2.8～4.9*
HbA1c 4.5～5.9*
免疫比浊，单克隆抗体
DCA2000
HbA1c
HbA1c 4.2～6.3
免疫比浊，单克隆抗体
Unimate
HbA1c
HbA1c 4.5～5.7
离子交换色谱法（微柱）
HbA1c微柱试验
HbA1c
HbA1c 4.2～5.9
HPLC离子交换色谱法
DIAMAT
HbA1  HbA1c
HbA1 5.1～7.3
HbA1c 4.3～6.1
HPLC离子交换色谱法
HS-8
HbA1  HbA1c
HbA1 5.0～7.8
HbA1c 4.4～5.7
HPLC离子交换色谱法
L-9100
HbA1  HbA1c
HbA1 4.5～6.0
HbA1c 3.4～4.7
数据来自包装说明书或参考文献，*有不同的标准品；**“标准血红蛋白”；GHb：总糖化血红蛋白。

六、临床意义
评价糖尿病患者血糖控制的质量可用两种不同的方法：
-第一种方法，6～8周前的平均血糖与相应的糖化血红蛋白值相关。通过使用一种算法，6～8周前的平均血糖可以从糖化血红蛋白值导出。这些算法（表5）仅对个别方法有效并且不可广泛地应用。
-另一种方法把临床经验与参考范围的临界值外推法结合。根据WHO的St. Vincent报告，例如，血糖水平控制理想，糖化血红蛋白值低于参考人群平均值以上三个标准差（99.9%参考人群值低于这极限）。血糖水平控制不理想，糖化血红蛋白值高于参考人群平均值以上五个标准差。在这些值之间的糖化血红蛋白值说明血糖水平的控制在临界的理想状态（表6）。
表5 平均血糖浓度和糖化血红蛋白值之间的关系（举例）
方程式
HbA1c(%)＝2.07×平均血糖浓度（mmol/L）0.596；r＝0.98
HbA1c(%)＝0.038×平均血糖浓度（mmol/L）＋3.78；r＝0.89
平均血糖浓度(mg/dl) ＝33.3×HbA1c(%)－86；r＝0.96

七、评价和问题
标准化
目前没有一个认可的参照物。但有基于特异血红蛋白β链N-末端残基的HbA1c候选参考方法。用内切酶酶解Gluc-C完整血红蛋白分子的方法已经被优化并用于获得HbA1c和HbAo的β链N-末端六肽。这些肽已通过反相HPLC分离并通过电离质谱分析法定量。
质量控制
对于糖化血红蛋白的测定，许多国内和国际的实验室调查组织提供了室间质量控制。因为没有参考方法或国际认可的参考物可用，靶值往往根据不同的测定方法和（或）制造商提供的值或同一分析系统组模式获得。
表6 血糖控制的评价（根据St. Vincent报告）
参数
好
（＜ ＋3SD）
临界
（ ＋3～5SD）
差
（＞ ＋5SD）
HbA1（%）
HbA1c（%）
＜8.0*
＜6.5*
8.0～9.5*
6.5～7.5*
＞9.5*
＞7.5*
取决于使用的方法。参考平均值和 倍标准差（SD）
*示范值，参考人群：HbA1： ＝5.75；SD＝0.75
HbA1c： ＝5.0；SD＝0.5
采样，稳定性
无需特别的条件辅助病人的准备和样本采集。高脂血症的血样由于样本的浊度会使光度计测定产生错误。因为在体外特别在高糖血症时，糖化将继续进行，所以样本收集之后应尽可能快的分析。
样本长时间存储后（3～4 d），红细胞代谢产生血红蛋白相关的谷胱甘肽加合物（HbA1d/ HbA3），特别是在色谱法时会干扰试验。溶血产物不如全血稳定。
因为糖化血红蛋白的结果与总血红蛋白有关，体位或静脉或毛细血管采血将不会引起干扰。
因为血红蛋白的寿命长以及特别糖化动力学，估计不受短期生理节奏影响。仅瞬间的高糖血症可以引起醛亚胺部分的升高。
血红蛋白病
已经报道了有超过400种异常的血红蛋白（氨基酸交换，缺失）。一定程度上，这些主要影响糖化血红蛋白的色谱测定。因每次洗脱模式的不同，糖化血红蛋白值可能是过低或过高。从体外实验已知糖化血红蛋白值＞20%是不太可能的，往往提示存在异常的血红蛋白。此外，血红蛋白病经常与造血作用损伤和（或）溶血有关，这为解释与方法无关的糖化血红蛋白值的变化增加了困难。亲和色谱法不受异常的血红蛋白影响。对于免疫化学方法，异常的血红蛋白的干扰理论上是可能的，因为如果这些血红蛋白改变HbA1c表位的三维结构会使它难接近抗体。然而迄今为止，并没有描述这样异常的血红蛋白。
胎儿血红蛋白（HbF）在胎儿出生时占到所有血红蛋白的大约80%，在出生后第1个月，下降到不到1%。与方法相关的胎儿血红蛋白的干扰，特别是在色谱法和电泳法中，仅在婴儿达到第9个月前和罕见的持续带有遗传性胎儿血红蛋白的成年人，以及地中海贫血产生的代偿的，过量的HbF，才能被检测到。
血液学疾病